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Biochemistry

Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos

doi: 10.3791/56278 Published: September 6, 2017

Summary

Incompatibilidades em sequências de antigénios (HLA) leucocitário humano entre doador e beneficiários pares são a principal causa de rejeição mediada por anticorpo em transplante de órgãos. Aqui nós apresentamos o uso de matrizes de antígeno personalizado com base em sequências HLA dos doadores individuais para sondar aloanticorpos HLA antidoadores em receptores de órgãos.

Abstract

No transplante de órgãos, a função e a longevidade da prótese criticamente dependem do sucesso de controlar a reatividade de rejeição imunológica contra antígenos de leucócitos humanos (HLA). Diretrizes de histocompatibilidade são baseadas em testes laboratoriais de imunidade anti-HLA, que apresenta como pré-existentes ou de novo gerados anticorpos HLA que constituem uma barreira grande transplante. Testes atuais estão construídos sobre uma plataforma de grânulos single-antigénio (SAB) usando um conjunto fixo de ~ 100 pré-selecionados antígenos HLA para transplante soros de sonda. No entanto, em humanos, existem uma variedade muito maior de tipos HLA, com nenhum dois indivíduos que não sejam gêmeos idênticos que podem compartilhar a mesma combinação de sequências HLA. Enquanto tecnologias avançadas para a tipagem de HLA e sequenciamento direto precisamente podem capturar qualquer inadequações na sequência de DNA entre um doador e HLA do receptor, o ensaio de ORS, devido à sua variedade limitada em representação de sequência, é incapaz de detectar precisamente aloanticorpos especificamente contra o doador HLA mismatches. Procuramos desenvolver um método complementar, usando uma tecnologia diferente para detectar e caracterizar os anticorpos HLA de antiem doadores uma base personalizada. A ferramenta de seleção é uma matriz de peptídeo personalizado doador HLA-derivado de sequências de para sondar pós-transplante soros do destinatário órgão para avaliar o risco de rejeição mediada por anticorpo. Em um único array para um par de doador-beneficiário, até 600 exclusivos peptídeos são feitas com base em sequências de proteínas HLA do doador, cada peptídeo carregando pelo menos um resíduo incompatível em uma sequência de ácido amino-15. Em nossos experimentos piloto para comparar padrões de antígeno do pré e pós transplante sera nesses conjuntos, fomos capazes de detectar sinais de anti-HLA com a resolução que também nos permitiu identificar os epítopos imunes envolvidos. Estas personalizado matrizes de antígeno permitam a detecção de alta resolução de epitopos HLA do doador específico em transplante de órgãos.

Introduction

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Terapia de substituição de órgão que é rotineiramente realizada em todo o mundo já salvou milhões de vidas. Transplantação de órgãos sólidos ocorre em cerca de 100 pacientes por milhão de pessoas nos Estados Unidos anualmente, ao passo que um número maior ainda colocorá receber órgãos de doadores devido a uma grave escassez de abastecimento (de acordo com informações fornecidas pelo órgão Colheita e transplante de rede - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Transplante de órgãos é altamente regulada a fim de reduzir o desperdício de órgãos e salvar vidas, mas as ferramentas científicas usadas para informar a estes regulamentos são limitadas na eficácia. Por exemplo, a comunidade científica reconhece plenamente os Estados altamente polimórficos de moléculas HLA e precisos testes genéticos de DNA usando digitação de alta resolução e baseados em sequência de digitação (SBT) foram desenvolvidos nos últimos anos1, 2. no entanto, os métodos de ensaio Alo-anticorpo ainda não foram capazes de produzir a grande variedade de sequências individuais de HLA como sondas de antígeno. O teste padrão hoje em dia usa um painel invariável de ~ 100 antígenos alélicas que são compreendidos de variantes comuns de HLA, A, B, C, DQ, DP e DR sequências em populações humanas3,4,5,6. Frequentemente, sequências HLA do doador real não estão incluídas no painel de teste, forçando o transplante de médicos e cirurgiões para inferir a reatividade de doadores específicos com base em semelhanças compartilhadas entre sequências reais do doador e padrões"correspondentes" na teste conjunto7,8. Consequentemente, às vezes é difícil fazer uma estimativa confiável do risco de rejeição baseada em anticorpos teste resultados9,10,11,12. Portanto, Nova pessoalmente testes personalizáveis para aloanticorpos são urgentemente necessários13,14.

Os genes HLA codificam os receptores de (MHC) complexos principal de histocompatibilidade que têm uma função fundamental em respostas imunes6. Os genes HLA são conhecidos por serem os mais polimórficos genes do genoma humano6. Devido aos avanços rápidos no DNA sequenciamento estratégias para os genes HLA, novas variantes alélicas (ou simplesmente referido como alelos) estão sendo descobertas a uma taxa explosiva15,16. Em março de 2017, 16.755 alelos validados tiveram sido depositados no banco de dados IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), dos quais 12.351 de classe se eu fosse e 4.404 eram de grupos de classe II. Em contraste, apenas um pouco mais de 100 diferentes alelos são representados no ensaio padrão único-antígeno grânulos (SAB), que é usado rotineiramente para detectar aloanticorpos em transplante de órgãos. O método SAB é construído sobre uma plataforma de Luminex usando citometria de fluxo. Desde que o ensaio utiliza um conjunto invariável de antígenos, além de menores variabilidades de lote para lote em produção, o teste de soro pode ser robustamente padronizado entre indivíduos e entre laboratórios5. Entretanto, este teste é capaz de capturar todos os aloanticorpos desenvolvidos especificamente contra os alelos do doador, particularmente quando as sequências de doadores estão ausentes do SAB definido. Embora a produção personalizada de antígenos dos doadores, com base em sequências de verdadeiras são desejáveis, persistem os desafios técnicos em racionalizar a produção necessária e procedimentos de teste.

Recentemente descrevemos uma metodologia alternativa em um estudo de viabilidade do transplante renal assuntos17. O método usado antígenos de peptídeo em um formato de matriz pela investigação pré- e pós-transplante de soros de sujeitos individuais. Cada matriz personalizado foi construído usando o lugar síntese método18,19,20,21,22,23 que produz antígenos peptídeos, cada 15 aminoácidos de comprimento, inteiramente baseada em alelos HLA do doador do respectivo órgão de A, B, C, DQA1, DQB1 e DRB1. Síntese SPOT é operado em uma membrana de celulose usando padrão Fmoc-química22 e pode produzir centenas de peptídeos personalizados em paralelo com um sistema totalmente automatizado de robótica19,21. A matriz de membrana pode suportar várias rodadas de descascamento e ciclos de reprobing. Em nosso estudo retrospectivo17, detectamos mudanças nos padrões do antígeno com anti-soros transplante armazenados, coletados em uma série de tempo (ou seja, antes e após o transplante). Neste documento descrevemos o protocolo técnico para o fluxo de trabalho, incluindo o projeto da matriz, fabricação, análise de sondagem e resultado de anti-soro. O método destina-se para a detecção de aloanticorpos contra epítopos lineares específicos em moléculas HLA dos doadores de transplante.

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Protocol

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Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo noroeste da Universidade institucional Review Board (IRB protocolo #: STU00104680). Um fluxo de trabalho geral do protocolo é ilustrado na Figura 1.

1. a análise de Bioinformatic do doador e receptor HLA sequências

  1. recuperar sequências de banco de dados IMGT/HLA 15.
    1. Relatórios de digitação obter HLA do doador de órgãos e do seu receptor.
      Nota: Certifique-se de procedimentos adequados para proteger os registos médicos confidenciais são utilizados. Normalmente, uma aprovação institucional Review Board (IRB), o protocolo de estudo ou o teste experimental é necessária as orientações institucionais do IRB. Se relatórios HLA foram baseados em PCR digitação (de alta ou baixa resolução) ou baseada no sequenciamento digitação (SBT), vá diretamente para a etapa 1.1.3. Se sequências foram obtidas de sequenciamento genômico/HLA, e se eles são completos, use essas sequências diretamente. Ocasionalmente, quando digitando apenas incompleta ou sequenciamento resultados estiverem disponíveis, siga o passo adicional 1.1.2. para atribuir o " faltando " alelos através da ferramenta web descrito na etapa 1.1.2.
    2. Abrir as combinações de alelos ambíguo seguindo web link - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html e Pesquisar usando o “ ferramenta de busca de combinações alélicas ambígua ” função para recuperar os alelos hipotéticos. Então, prosseguir para a etapa 1.1.3. Digite o nome do alelo.
    3. Abrir o formulário de consulta de alelo IMGT/HLA no seguinte o link de web - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html e assunto de entrada ’ nomes de alelo s (cada qual individualmente, conforme mostrado na Figura 2) no “ pesquisa para ” caixa. Clique sobre o “ busca de alelos agora ” botão. Os nomes de alelo HLA devem usar sistemas de nomenclatura padrão (ou seja, A *, A * 01, A * 01:01:01:01 e quaisquer denominações anteriores como A * 01010101).
    4. Encontrar o nome de alelo correspondente exibido na tela. Clique no botão alelo.
    5. Cópia da " sequência da proteína " e colá-lo em um documento de texto por baixo de uma linha de cabeçalho de " > nome do alelo ". Efetivamente, o documento de texto é em um formato FASTA (FAST-All) do nome do alelo e sequência.
  2. Executar baseados em genes múltiplos alinhamentos de doador e receptor/paciente alelos.
    1. Um gene (ou seja, DQB1 * 03:01:01:01) ao mesmo tempo, copie e cole todos os quatro alelos de doador e paciente FASTA sequências (dois do doador) e dois do paciente em um documento de texto combinado. Neste ponto, é importante denotar diferencialmente nomes de alelo doador de nomes do alelo doente (as opções incluem o uso diferencial de alta vs baixa casos; ou criar uma extensão de prefixo ou sufixo distintiva para cada nome de alelo para marcar separadamente doador vs. pacientes alelos). A ordem de entrada das sequências não é importante, porque, seguindo a ordem depois misturada de acordo com os níveis de similaridade entre qualquer par de sequências de alinhamento.
    2. Copiar e colar as sequências em FASTA formato (como visto na Figura 3) de cima para o “ digite seus sequências de entrada ” caixa no site da Omega Cluster: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
    3. Clique no " enviar seu trabalho " usando as configurações padrão dos parâmetros: tais como " PROTEINŔ e " Clustal w / números ". Executar alinhamento clicando no " enviar ". Um alinhamento de sequências de quatro é exibido na tela ( Figura 4).
  3. Mark doador específico incompatibilidades.
    Nota: Especialmente Note-se que as sequências alélicas dadas aqui foram baseadas nos resultados da tipagem HLA, não sequenciamento. Portanto, há um risco de que a variação da sequência relevante do par doador-receptor específico pode ser perdida. Este potencial problema vai ser atenuado como mais e mais centros de transplante adotam precisa digitar de alta resolução e direto de sequenciamento de DNA.
    1. Copiar e colar o texto de alinhamento em um documento de texto e criar um novo documento. Se o formato do arquivo alinhado é perturbado, corrigir o formato, alterando o estilo de fonte e tamanho: sempre use " Courier New " fonte no tipo de pequeno tamanho para caber as linhas. Salvar o documento após os formatação problemas estão resolvidos.
    2. Inspecionar manualmente as sequências alinhadas para identificar todos os resíduos incompatíveis que pertencem exclusivamente ao doador. Marcar cada um desses resíduos de doador específico usando uma cor de fonte distintiva.
    3. Sublinhar todas as letras do dador ' s sequências que estender 14 resíduos dois - up e a jusante das marcado incompatibilidades específicas do doador (calculado como 15 aminoácido peptídeo menos 1 resíduo de incompatibilidade).
  4. Derivam sequências de peptídeo 15-mer em uma série de sobreposição.
    Nota: O motivo para a escolha de peptídeos mer-15 foi baseado no conhecimento geral de epítopos típicos, sendo 4-9 aminoácidos de comprimento. Portanto, quando aplicamos um " janela em movimento " procedimento com um tamanho de passo de 4 ácidos aminados ( Figura 1), nossa seleção de um comprimento de 15 aminoácidos deixou um 15-4 = 11 aminoácidos sobreposição entre qualquer peptídeos vizinhas em uma série. Em teoria, essa sobreposição de 11 aminoácidos é suficiente para cobrir todos os epitopos imunes de até 9 aminoácidos de comprimento, para que não epítopo será inadvertidamente " dividir " ao meio com apenas sequências parciais na matriz.
    1. Use as sublinhado sequências mais modelos para derivar sequencialmente curto 15 sequências de aminoácidos em uma série que se sobrepõem por 4 resíduos entre quaisquer duas sequências imediatamente adjacentes na série.
    2. Copiar e colar esses 15 sequências de aminoácidos em uma planilha ( Figura 5), em um formato de coluna acompanhado por colunas de notação que incluem os nomes correspondentes dos alelos doador. Uma coluna adicional para incluir posições aa resíduo pode ser útil.
  5. Repita os passos de 1.1.3. a 1.3. para cada alelo HLA (i.e., A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 e DP) do dador e o par de destinatário para derivar as 15 aa sequências curtas do dador.
  6. Copiar e colar todas as colunas em uma planilha mestra para criar uma coluna contínua longa de todas as 15 aa sequências de todos os alelos do doador. Anote o número total de linhas (para as sequências peptídicas) no documento.

2. Projeto de Layout de matriz personalizado e produção

chamados
  1. gerar uma planilha de sequências peptídicas com alelo correspondente. A matriz tem 30 colunas e 20 linhas e pode conter até 20 x 30 = 600 pontos por peptídeos. Dependendo do número total de peptídeos gravado no passo 1.5 de um doador particular e com base em nossa experiência do passado com dois exemplos que tentamos em Liu et al. 17, a matriz de ponto 600 pode segurar todas as sequências geradas a partir de ~ 2 casos de transplante separado.
    1. Plano racionalmente e maismostrou de forma para caber os conjuntos de péptidos dentro o formato 600-ponto da matriz.
    2. Se mais de um assunto pode caber em uma matriz inteira, inserir linhas vazias após o primeiro doador ' sequências de s para coincidir com o número total de linhas que pode ser dividido por 30 (o número de pontos em uma linha na matriz).
    3. Imediatamente após a última linha vazia para o primeiro conjunto de sequências, colar em toda a coluna de conteúdo de sequência do segundo transplante caso.
    4. Repita essas etapas até que a matriz é preenchida e não há mais casos podem ser adicionados sem exceder os 600 pontos. Se toda linhas vazias são deixadas para preencher na parte inferior, " mover " na linha em branco deve ser posicionado entre os conjuntos de dois doadores. Este amplo espaço deixado entre casos faz o corte da membrana após a conclusão da síntese mais fácil - seguindo passo 3.2. abaixo.
  2. Programa as sequências peptídicas no contexto do layout de matriz. O programa do sintetizador SPOT tem um formato de texto das sequências (sequência de um peptídeo de uma linha), que pode ser obtido diretamente, salvando a planilha resultante da etapa 2.1.4 como um documento de texto simples (sem as colunas extras para nomes de alelo, aa posições, etc.).
  3. Gerência automatizada do peptide matriz síntese através do sintetizador SPOT. Toda a operação da síntese é detalhada em Kudithipudi et al. 21. Observar que o Fmoc síntese de duas matrizes ~ 4-5 dias.

3. Receptor de transplante de sonda e anti-soros Reprobe de uma série temporal de um indivíduo.

Nota: A matriz de membrana 600 loco tem o dimensões ~ 7 x 13 cm. Após a síntese, as matrizes podem ser armazenadas à temperatura ambiente como membranas secas pelo menos dois anos quando protegido da luz direta. Evitar excesso de dobramento da membrana para preservar sua longevidade para uso repetido.

  1. Re-hidratar a matriz de membrana com etanol e visualizar pontos de peptídeo manchados com Ponceau S. Matriz de
    1. Rehidratar a membrana carregando os peptídeos seguindo um procedimento gradual otimizado em Li et al. 24.
      1. mergulhe a membrana de matriz em 20 mL de etanol a 100%.
      2. Adicionar 20 mL água destilada para diluir a solução de etanol a 50% e incubar a temperatura ambiente por 15 min.
      3. Trocar a solução de imersão para 40 mL de água 100% três vezes e incubar 15 min a cada hora.
      4. Lavagem em um buffer de trabalho adequada, por exemplo, 20 mL de TBST (Tris salino com 0,1%), três vezes por 5 min cada.
    2. Ponceau S coloração da matriz para visualizar peptídeos sintéticos
      1. Adicionar 20 mL de solução de Ponceau S previamente formulada diretamente para a matriz hidratada e incube por 30 ~ s com tremendo.
      2. Run destilada água continuamente ao longo da membrana de manchar o fundo cor de Ponceau S. Durante o processo, manchas de peptídeo de cor vermelha podem tornar-se visível.
      3. Separar as partes da matriz para cada doador cortando cuidadosamente entre as seções da matriz para casos individuais. Marcar a orientação de cada matriz.
  2. Matriz pre-bloco. Leite desnatado de
    1. bloco a membrana em 20 mL de 5% dissolvido em tampão TBST. Esta solução à base de leite mais de mancha cor de Ponceau S. Substitua o tampão de leite várias vezes para alcançar as imagens mais claras do peptídeo.
    2. Para fins de registo, tirar uma foto da imagem da matriz usando uma câmera de mão (exemplo na Figura 6) Ponceau S.
    3. Continuar bloqueando da membrana em leite desnatado de 5% a 4 ° C durante a noite ou em temperatura ambiente por 2 h com balanço.
  3. Matriz de incubar com transplante de anti-soro.
    Nota: Deve ser observado que um fenômeno conhecido como prozona ou o efeito de gancho pode resultar de complemento-dependente interferência na análise de anticorpos do soro. Para contornar este problema, uma etapa de pré-tratamento de soro opcional pode ser considerada com EDTA ou calor inactivação de amostras de soro.
    1. Remover o tampão de bloqueio e lave a membrana com 20 mL de TBST três vezes no dia seguinte por 5 min cada vez.
    2. Adicionar 20 µ l do soro bruto do destinatário a 20 mL de 2,5% leite em buffer TBST e incuba com a membrana para 2-3 h à temperatura ambiente. Note que nesta rodada inicial de sondagem, é recomendado que a último pós-transplante soro (ou provavelmente mais sensibilizado soro) da série de tempo é usado em primeiro lugar. Isto é baseado no pressuposto de que os espécimes anteriores da série, particularmente a partir de pontos de tempo pré-transplante, tem menos variedade de aloanticorpos que tendem a desenvolver ao longo do tempo. Desta forma, qualquer possibilidade de interferência do sinal de " reporte " entre rodadas de sondagem podem ser claramente distinguidos de reatividade verdadeiramente desenvolvidos Alo-anticorpo devido a respostas imunes contra o enxerto.
  4. Lavar a matriz com 20 mL de TBST e incubar com anticorpo secundário.
    1. Lavar a membrana três vezes durante 10 minutos cada vez.
    2. Incubar com anticorpo secundário cabra anti-humano IgG-HRP (peroxidase de rábano silvestre) a diluição de 1:10,000 no buffer TBST suplementado com 1% de leite para outro h. 2
  5. Lavagem e desenvolver o blot.
    1. Lavar a membrana três vezes com TBST durante 10 minutos cada vez.
    2. Executar reforçada quimioluminescência (ECL) usando 5 mL de solução de luminol recém misturado com 5 mL de solução de peróxido para desenvolver a membrana (por 1 min).
    3. ECL Visualizar sinais usando um sistema de imagem apropriado (ou seja, sistemas de imagem de ChemiDoc ou Azure C600).
  6. Scan e quantificar o blot.
    1. Salvar as imagens desenvolvidas ( Figura 7, imagem inferior) e realizar a quantificação da intensidade local.

4. Comparar a reatividade do soro através de uma série de tempo clínico.

  1. Tira matriz.
    1. , Neste ponto, mantenha a membrana molhado em todos os momentos.
    2. Tira a membrana incubando com 20 mL de tampão de extracção comercial a 37 ° C por 20 min e em seguida, lave a membrana com TBST três vezes durante 10 minutos cada. Em seguida, repita o bloqueio (etapa 4.2) e sondagem (passo 4.3) etapas usando um diferente soro do paciente tomada em um ponto diferente tempo.
  2. Bloco despojado membrana.
    Nota: Após o descascamento, a membrana pode ser reutilizada para outra rodada de sondagem de um soro diferente do mesmo paciente em uma série de tempo.
    1. Bloquear a membrana usando o buffer de leite 5% como antes (consulte a etapa 3.2).
  3. Reprobe um anti-soro diferente da mesma série tempo (repita os passos de 3.3-3,6; exemplo na Figura 7, imagem superior).
    Nota: A matriz despojada então pode ser usada para reprobe outra amostra de soro. Desde que os peptídeos são conjugados covalentemente a matriz de suporte da membrana, mostramos que a matriz pode ser reutilizada por até 20 rodadas de descascamento e reprobing ciclos sem perder sua perfobrilho.
  4. Armazenamento de longo prazo de matrizes.
    1. Loja da membrana no buffer TBS suplementado com 0,02% w/w de azida sódica como conservante. Use um saco plástico selado para armazenamento a longo prazo. A 4 ° C, sob a proteção da luz direta, a membrana molhada pode ser armazenada pelo menos 2 anos.

5. Aquisição de dados e análise

  1. anotar manualmente peptídeos do antígeno positivo.
    1. Localizar pontos mostrando sinais de anticorpo positivo e determinar cada uma das suas posições de grade.
    2. Destacar as linhas correspondentes na planilha mestre para os peptídeos positivos.
  2. Recuperar sequências peptídicas listadas na planilha mestre ( Figura 7, lista de fundo). De acordo com o princípio de projeto descrito no passo 1.4.1., manchas seriais vizinhas compartilham sequências significativamente sobrepostas (15-4 = 11), portanto epitopos reativos podem ser compartilhados por peptídeos numa série consecutiva.
    1. Destacar todos os pontos positivos ocorrem em sucessão.
  3. Determinar o comprimento mínimo do epítopo para cada peptídeo em uma série.
    1. Destaque qualquer sequências potencialmente compartilhada epítopo com base na sobreposição de segmentos de peptídeos reativos.
  4. Modelo estruturalmente epítopos do antígeno.
    1. Obter estruturas de cristal HLA de protótipo de banco de dados da proteína encontrada no seguinte link da web: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
    2. Exibir o protótipo estrutura HLA em Pymol (download a partir www.pymol.org).
    3. Mapa " ou modelo descoberto antiresumos doadores para as estruturas 3D das moléculas HLA do protótipo, realçando as sequências peptídicas reativa ( Figura 8). Clique em " Display ", então " fundo " e selecione " branco ". Para salvar a imagem, vá para " arquivo " e " salvar imagem como " e selecionar o formato de arquivo " png ".
  5. Relatar resultados e atribuir epitopos reativos para os alelos correspondentes.
  6. Comparar resultados para os resultados de grânulos single-antigénio (SAB), de matriz, se disponível.
    Nota: O teste SAB usando antígenos alélicas único mede de reatividade de anticorpos para um painel fixo de proteínas HLA. Peptídeos individuais que mostram reatividade de anticorpos pertencem a certos alelos HLA que, se também incluído no painel SAB, permitem a comparação direta entre a matriz e os resultados SAB. Nosso anterior estudo 17 mostrou um alto nível de correlação entre os resultados, sugerindo que os epítopos de peptídeo contribuam significativamente para a reatividade global de sab. Além disso, os resultados da matriz também revelam aminoácido-níveis de especificidade.
    1. Obter SAB resulta de um laboratório HLA que fornece informações sobre se e quais alelos doador são reativos para pós-transplante de soro do paciente. Resultados da etapa 5.5. com base na matriz de análise também fornecem informações sobre alelos correspondentes do doador positivos para reatividade Alo-anticorpo.
    2. Resultados comparar SAB e matriz.

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Representative Results

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No estudo original usando a matriz de seleção método17, estamos inscritos um total de 5 indivíduos de transplante de rim. Obtivemos o HLA digitando resultados de nossa coorte e de seus respectivos doadores. Sua história médica e anticorpos alélica de SAB testes também estavam disponíveis para nós. Em nosso estudo piloto desses 5 pacientes, criámos duas metodologias diferentes: um matriz padrão, composto por um painel fixo de peptídeos e matrizes personalizados que foram personalizadas feitas para cada par de dador e do receptor. Enquanto o primeiro método tinha nos permitiu validar tecnicamente o desempenho da plataforma em atingir altos níveis de especificidade em transplantes individuais de matriz, o protocolo personalizado para este último método é descrito neste artigo e vídeo que se destina para a seleção abrangente de anticorpos específicos do doador (DSA), que muitas vezes correlacionar com enxerto pobres resultados5,25,26.

As matrizes personalizadas foram aplicadas a dois dos cinco casos17, e para ilustrar o fluxo de trabalho geral do método, aqui vamos focar em um destes dois pacientes (nomeadamente PTN #4). A tecnologia-chave para fazer a matriz de peptídeo personalizado envolve o sintetizador SPOT. É um sistema totalmente automatizado de robótico que faz peptides usando síntese de Fmoc diretamente sobre uma matriz celular derivada especialmente numa membrana (Figura 1). Nós explorada a flexibilidade do sintetizador para montar grandes conjuntos de peptídeos derivados de sequências HLA dos doadores de órgãos individuais. Para ter cobertura suficiente para evitar uma situação quando um epítopo contínuo está sendo "dividido" e perde a reatividade de anticorpos, seguimos um projeto "caminhar" de peptídeos seriais ter 15-4 = 11 resíduos de sobreposição entre qualquer peptídeos imediatamente adjacentes, então que a série é sempre suficiente para cobrir o comprimento típico de anticorpo epitopos estimada em 4-9 aa de comprimento (Figura 1).

As sequências HLA do modelo foram baixadas diretamente do banco de dados do repositório mantido no EMBL-EBI (Instituto Europeu de Bioinformática). Por exemplo, doador do PTN #4 do HLA-DQB1 * 03:01:01:01 alelo foi pesquisado para (página Web ilustração na Figura 2). Em conjunto, baixamos separadamente sequências para segundo alelo de HLA-DQB1 do doador do * 02: 01:01, bem como aqueles de PTN #4 se, HLA-DQB1 * 04:02 e * 05:01. Alinhamento múltiplo da sequência, em seguida, foi executado usando funções de web do Clustal Omega (Figura 3). O arquivo resultante do alinhamento foi obtido (Figura 4), que foram identificados todos os resíduos de aminoácidos incompatíveis (resíduos do doador são destacados). Em seguida, marcamos as sequências de modelo (sublinhadas) do doador que eram suficientemente longo para cobrir todos os seus resíduos incompatíveis. Baseado nessas sequências de modelo e seguindo um design "andar" conforme descrito acima, três séries de peptídeos cada 15 aa de comprimento foram derivadas para HLA-DQB1. Este processo foi repetido para o resto dos alelos do doador de HLA-A, B, C, DQA1 e DRB1 (DRA1 e DP foram excluídos devido a indisponibilidade do registro clínico pertinente) em comparação com os alelos correspondentes do seu destinatário. No final, um total de 202 peptídeos foram convocados para fazer a matriz (sequências peptídicas em uma planilha na Figura 5 e uma ilustração de matriz na Figura 6), especificamente para sondar o soro de pós-transplante do PTN #4 e comparou os resultados com aqueles obtidos de uma reprobing subsequentes de seu soro pré-transplante (Figura 7). Fora os 202 peptídeos, um total de 10 anticorpo mostrou sinais associados com o espécime pós-transplante de quais resíduos específicos do doador (incompatíveis do destinatário) E87, I306, W243 e K197 de HLA-B * 52:01, -B * 52:01, - C * 03:04 e - DQA1 * parecia ser 05:01 envolvido em incitar de reatividade de anticorpos (resíduos denotadas em letras vermelhas na Figura 7).

Além disso, uma das principais vantagens do método matriz em comparação com o tradicional teste SAB é que o epítopo informações podem ser facilmente obtidas, como mostrado na Figura 7. Comparamos os epítopos anticorpo-reativa em HLA-DQA1 e - DQB1 de todos os cinco pacientes (a partir de resultados de matriz separada em Liu et al 17) por tê-los todos modelados para uma estrutura de cristal Co de DQA1 e DQB1 heterodímero (Figura 8). De forma encorajadora, um proeminente segmento da estrutura conhecida como a vertente de β1 é um "hotspot" que tinha uma chance muito maior (3/5 em pacientes 2,3,5) para ser alvo de aloanticorpos entre os temas de transplante a coorte de caso 5.

Figure 1
Figura 1 . O esquema geral do método de matriz de antígeno HLA-baseado para a detecção de aloanticorpos de anti-doadores HLA em receptores de órgãos. (Adaptado e modificado de Liu. et al. 17.) clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Site do repositório de dados
Para recuperar sequências HLA, visite o seguinte Web site: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Proteína várias sequências de alinhamento do doador vs destinatários alelos HLA-DQB1, usando a ferramenta baseada na web de Clustal Omega.
Copie e cole a sequências de DQB1 do paciente #4(PTN#4) * 0201 e 03:01 e da DQB1 do doador * 04:02 e 05:01 em formato FASTA em http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (para ilustração, DQB1 * 05:01 de PTN #4 e DQB1 * 03:01 do dador são mostrados na caixa de entrada) . Selecione a opção "Clustal w / números" em "Passo 2" para o formato de saída e executar o alinhamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Comparação dedador vs paciente/destinatário HLA DQB1 e seleção de sequências de modelo para a síntese do peptide.
Sequências do doador estão em negrito, com incompatibilidades específicas do doador em fonte vermelha e também destacou com caixas-pretas. Sequências de modelo (sublinhadas) para derivar peptídeos contêm estes resíduos específicos do doador. (Esta figura era adaptada e modificada de Liuet al. 17.) clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . Um exemplo ilustrativo da planilha em uma planilha de peptídeos HLA do doador mestre.
Peptídeo posição na matriz é indicada pela linha vs coordenadas de coluna. Peptídeo sequências são usadas para programar usando robótica sintetizador de local de síntese. Resíduos específicos do doador (incompatíveis de alelos correspondentes do destinatário) são destacados em negrito e sublinhados. As posições inicial e final do peptide correspondente ao comprimento total HLA-DQB1 sequências também são indicadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 . Imagem de uma secção de matriz manchado com Ponceau S
Observe a disparidade na intensidade de cor devido à diferença na composição de aminoácidos entre os peptídeos, enquanto as concentrações de peptídeo entre todas as áreas de ponto são as mesmas. (A imagem é um exemplo ilustrativo, não é o que este estudo real). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 . Específicos do doador HLA-A, B, C, DQ, estudo de matriz DR de epítopos incompatíveis em PTN #4.
Peptídeos seriais foram derivados de sequências do doador para cobrir resíduos incompatíveis (um exemplo de DQB1 na Figura 4). A matriz foi usada para sondar o soro pós-transplante (borrão inferior: post-TX) e posteriormente o soro pré-transplante (borrão superior: pré-TX) do mesmo paciente. Os quatro conjuntos de pontos fortes do pós-transplante de sondagem são marcados por linhas vermelhas (no borrão inferior), enquanto dois pontos de média intensidade que só foram associados com pré-transplante soro são marcados por linhas azuis (no borrão superior). A tabela inferior mostra as sequências peptídicas correspondente e sua reatividade ao soro pós-transplante. Resíduos (incompatíveis) de doador específico E87, I306, W243 e K197 de seus respectivos alelos são em letras vermelhas e peptídeos mostrando a reatividade de anticorpos forte estão em fontes em negrito. Esta figura era adaptada e modificada de Liu et al . 17. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8 . Estruturais locais de epitopos de HLA-DQ.
Estrutura de cristal Co de HLA-DQ8 foi usada como um modelo. A estrutura era composta de um DQA1 e um subunidades DQB1 juntamente com um peptídeo de antígeno (A). Estruturas secundárias da proteína do α-hélices e β-vertentes são mostradas no painel (B). DQA1 e DQB1 peptídeos que reagiram com qualquer um dos cinco soro localizavam-se na estrutura de cristal Co (em A e em B: sombreado em azul). Três vertentes-β, β1, β6 e β12 (azul-escuro em B), cada uma representada por vários peptídeos (vermelhos linhas curtas correspondente às posições aa lineares de DQA1), reagiu com amostras dos vários pacientes (resultados originais em Liu et al . 17). todos os seis DQB1 peptídeos (em negrito) reativos para anticorpos em pacientes #2, #3, #5 estão localizados no segmento de "hotspot" β1 (em B: apontado pela seta vermelha). Esta figura foi adaptada de Liu et al . 17. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O desenho da matriz de ponto descrito aqui é para o estudo experimental de especificidade de Alo-anticorpo em transplante contra antígenos HLA do doador de órgãos. Em contraste com o ensaio SAB existente, amplamente utilizado na clínica, o método de matriz de antígeno tem uma grande vantagem em seu design flexível que pode acomodar as verdadeiras sequências HLA do doador individual. A nova plataforma explora os potenciais da tecnologia de sequenciamento de DNA rapidamente avançando que em breve será capaz de produzir leituras precisas de sequência alélica HLA sem ambiguidade16,27 e o potencial das bases de dados designadas para repositório HLA sequências15 na população global. Nosso protocolo de triagem de matriz atual foi desenvolvido com base no sucesso de vários estudos-piloto de soros de transplante. Aqui nós deve enfatizar que, nesta fase, nossas matrizes de protótipo são construídos somente para uso de pesquisa, não para aplicações de diagnósticos na prática clínica.

Outro notável distinção entre Sanches e nossa matriz de antígeno é que o último tem uma resolução maior para distinguir potenciais epítopos do antígeno dentro 15 segmentos aa de sequências de HLA, que poderiam fornecer informações valiosas sobre alloantigenicity18 . No entanto, diferentemente de SAB que apresenta antígenos de proteína inteira para adaptar suas estruturas dobradas, a matriz de antígeno só incorpora peptides curtos, que exclui informações sobre dobradura conformacional. Portanto, as matrizes não podem detectar anticorpos que só reconhecem epitopos conformacionais, que alguns acreditam que constituem a maioria de todos os resumos funcionais relevantes para anticorpo mediado rejeição28,29. Ainda, em outros contextos, ações de anticorpo contra epítopos lineares, tais como aqueles em peptides curtos, estão a ser exploradas nas respostas do antígeno viral em na vacina design30,31. Note também que, em número limitado de amostras de pacientes testados, o desempenho de sensibilidade de detecção de nossa matriz excedeu o de SAB e permitiu a detecção de anticorpos específicos do doador mais cedo17 durante a progressão clínica da rejeição mediada por anticorpo. Isto é devido a alta concentração molar de peptídeos do antígeno local na matriz em comparação com sab. Esse recurso foi particularmente útil em casos quando SAB não detectada nenhuma reatividade enquanto evidências clínica e patológica de rejeição mediada por anticorpo eram aparente, como mostramos anteriormente a17. No entanto, é importante salientar que este teste personalizado é mais demorado do que o teste padrão do SAB. O teste de matriz requer a obtenção do órgão sequências HLA do doador e do beneficiário (proposto) antes de iniciar o projeto de peptídeos do antígeno. Então leva vários dias para produzir a matriz e outra de 7-8 horas para obter resultados de anticorpo. Portanto, o processo moroso não é apropriado para o transplante de doador falecido, a menos que o principal objetivo do teste de anticorpo é determinar o aparecimento de anticorpos específicos do doador após o transplante, em vez de para a avaliação pré-transplante de anticorpos existentes.

O método de matriz teve uma grande melhoria do teste do SAB existente na detecção de epítopos de antígeno. Além disso, fizemos uma tentativa de mapear epitopos reativos em cinco pacientes transplantados para uma estrutura de modelo de HLA-DQ, no qual observamos pelo menos um epítopo proeminente "hotspot" na sua vertente de β1 que ocorreu em três dos cinco pacientes17. Curiosamente, as vertentes β1 do HLA-DQA1 e - DQB1 estão localizadas na ranhura do côncavo de apresentação de antígeno (Figura 8), um local conhecido por ser antigênica no contexto da rejeição de transplante de32. Portanto, esperamos que a futura exploração do nosso método de matriz de antígeno personalizado em estudos de coorte de transplante prolongado trará insights valiosos sobre hotspots antigênicas em moléculas HLA. Um catálogo destes hotspots identificados, quando considerada em conjunto com digitação altamente precisos DNA sequenciamento dos genes HLA entre potenciais doadores e receptores, em última análise ajudará pré-transplantes decisões através de programas de incompatibilidade aceitável 33, destinados a evitar mais eficazmente certas incompatibilidades nas proximidades para hotspots catalogadas.

Em resumo, nosso estudo original17 em explorar o projeto personalizado de uma matriz de antígeno para a deteção de aloanticorpos anti-HLA específicos foi o primeiro de seu tipo. O foco do estudo foi sobre a viabilidade da matriz design e implementação, que serviu como um protótipo para a tecnologia do futuro potencial. Nosso estudo piloto não só gerou resultados de amostras clínicas encorajadores, mas também nos permitiu estimar o custo total e a velocidade do teste. O custo de produção de uma matriz personalizada em nossa configuração atual do laboratório é abaixo dos $1.000 USD, que é um custo único, desde que a matriz pode ser usada ao longo do tempo até 20 cartuchos de reprobing ciclos sem perda de desempenho. É possível que testes adicionais do protocolo de matriz com uma mais ampla coorte de transplante assuntos mais racionalizará o método que poderia um dia ser usado na prática clínica.

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Disclosures

Não há conflitos de interesses declararam.

Acknowledgments

Agradecemos os Drs Shawn Li e Li Xing de Western University, no Canadá por sua gentil assistência com mancha matriz de produção. Somos gratos aos membros do pessoal no núcleo histocompatibilidade e abrangente de transplante centro do noroeste da Universidade para a prestação de serviços de exemplo. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo auxiliar placa de Northwestern Memorial Hospital e por um fundo de inicialização faculdade fornecido pela Northwestern University a JJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
Non-fat milk Bio Rad Laboratories 1706404
TBST Santa Cruz Biotechnology 10711454001
Goat anti-human IgG–HRP  ThermoFisher Scientific A18811
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad Laboratories 1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientifics 21059
ChemiDoc gel imaging system Bio Rad Laboratories 1708265 

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Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos
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Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).More

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).

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