Summary

Personalizada péptido matrices para la detección de aloanticuerpos HLA en trasplante de órganos

Published: September 06, 2017
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Summary

Desajustes en las secuencias de leucocito humano antígeno (HLA) entre pares de receptores y donante de órganos son la causa principal de rechazo mediada por anticuerpos en el trasplante de órganos. Aquí presentamos el uso de matrices de antígeno personalizados basados en secuencias HLA de donantes individuales para sondear aloanticuerpos HLA de anti-donantes en receptores de órganos.

Abstract

Trasplante de órganos, la función y la longevidad del injerto críticamente confían en el éxito del control de la reactividad inmunológica del rechazo contra antígenos leucocitarios humanos (HLA). Directrices de histocompatibilidad se basan en pruebas de laboratorio de inmunidad anti-HLA, que presenta como preexistente o de novo generado anticuerpos HLA que constituyen una barrera importante del trasplante. Pruebas actuales son construidas en una plataforma de granos solo antígeno (SAB) usando un conjunto fijo de ~ 100 preseleccionados antígenos recombinantes de HLA para trasplante sera la punta de prueba. Sin embargo, en los seres humanos existe una mayor variedad de tipos de HLA, no dos individuos que no sean gemelos idénticos pueden compartir la misma combinación de secuencias HLA. Mientras que tecnologías avanzadas para el mecanografiar de HLA y la secuencia directa precisamente pueden capturar cualquier desajustes en la secuencia de ADN entre un donante y HLA del receptor, el ensayo SAB, debido a su limitada variedad en representación de la secuencia, es incapaz de detectar precisamente aloanticuerpos específicamente contra los desajustes HLA del donante. Se intentó desarrollar un método complementario utilizando una tecnología diferente para detectar y caracterizar anticuerpos HLA del donantes de forma personalizada. La herramienta de análisis es una matriz de péptido personalizado de donantes HLA-derivados secuencias sondeo poste-trasplanta suero del receptor órgano para evaluar el riesgo de rechazo mediado por anticuerpos. En una sola matriz para un par de donantes y receptores, hasta 600 péptidos únicos son hecha basado en secuencias de proteínas HLA del donante, cada péptido llevando al menos un residuo no coinciden en una secuencia de ácido amino-15. En nuestros experimentos piloto para comparar patrones de antígeno para pre y poste-trasplanta sera de estos arreglos de discos, hemos sido capaces de detectar señales de anti-HLA con la resolución que también nos permitió identificar los epítopos inmune involucrados. Estos personalizados matrices de antígeno permiten alta resolución detección de epítopos HLA específicos de donante en trasplante de órganos.

Introduction

Terapia de reemplazo de órganos que habitualmente se lleva a cabo en todo el mundo ha salvado millones de vidas. Trasplante sólido del órgano ocurre en aproximadamente 100 pacientes por millón de personas en los Estados Unidos anualmente, mientras que un mayor número todavía están en listas de espera recibir órganos de donantes debido a una grave escasez de suministro (de acuerdo con información proporcionada por el órgano Adquisición y trasplante de la red – OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Trasplante de órganos es altamente regulado con el fin de reducir los residuos de órganos y salvar vidas, pero las herramientas científicas utilizadas para informar de estas regulaciones están limitadas en su eficacia. Por ejemplo, la comunidad científica reconoce plenamente los Estados altamente polimórficos de las moléculas HLA y precisas pruebas genéticas de ADN mediante la tipificación de alta resolución y basados en la secuencia escribiendo (SBT) se han desarrollado en estos últimos años1, 2. sin embargo, métodos de prueba de aloanticuerpo no han todavía sido capaces de producir la gran variedad de secuencias HLA individuales como puntas de prueba de antígeno. La prueba estándar de hoy en día utiliza un panel invariable de ~ 100 antígenos alélicos que constan de variantes comunes del HLA, A, B, C, DQ, DP y DR las secuencias en las poblaciones humanas3,4,5,6. Con frecuencia, las secuencias HLA del donante real no están incluidas en el panel de prueba, obligando a los médicos de trasplante y cirujanos inferir reactividad específica de donantes basada en similitudes compartidas entre secuencias reales y correspondientes “normas” del donante en el set de prueba de7,8. En consecuencia, a veces es difícil hacer una estimación confiable del riesgo de rechazo basado en anticuerpos prueba resultados9,10,11,12. Por lo tanto, personalmente pruebas personalizables para aloanticuerpos son nuevos urgente13,14.

Los genes HLA codifican los receptores (MHC) complejo mayor de histocompatibilidad que tienen una función clave en la respuesta inmune6. Los genes HLA son conocidos por ser los genes más polimórficos de la genoma humano6. Debido a los rápidos avances en el ADN sequencing estrategias para los genes HLA, nuevas variantes alélicas (o simplemente denominados alelos) se descubren en un explosivo tipo15,16. Marzo de 2017, 16.755 alelos validados se habían depositados en la base de datos IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), de que 12.351 eran de clase y 4.404 eran de grupos de clase II. En contraste, sólo un poco más de 100 alelos diferentes están representados en el análisis de los granos solo antígeno estándar (SAB), que se utiliza rutinariamente para la detección de aloanticuerpos en trasplante de órganos. El método SAB está construido sobre una plataforma Luminex mediante citometría de flujo. Puesto que el análisis utiliza un conjunto invariable de antígenos, además de menor variabilidad de lote a lote en producción, la prueba de antisuero puede estandarizarse robusta a través de individuos y de los laboratorios5. Sin embargo, esta prueba es capaz de capturar todos los aloanticuerpos desarrollados específicamente contra los alelos del donante, especialmente cuando las secuencias de donantes están ausentes desde el SAB. Aunque la producción por encargo de los antígenos de los donantes basado en secuencias del verdadero son deseables, aún existen desafíos técnicos en la racionalización de la producción necesaria y procedimientos de prueba.

Recientemente hemos descrito una metodología alternativa en un estudio de viabilidad de trasplante renal sujetos17. El método utiliza antígenos del peptide en un formato de matriz para sondeo previo y poste-trasplante sueros de sujetos individuales. Cada arreglo de discos fue construido usando el SPOT síntesis método18,19,20,21,22,23 que produce antígenos péptidos, cada 15 aminoácidos de longitud, enteramente basado en alelos HLA del donante de órganos respectivos de A, B, C y DRB1, DQA1, DQB1. SPOT síntesis es operado en una membrana de celulosa utilizando Fmoc-química estándar22 y pueden producir cientos de péptidos personalizados en paralelo con un sistema totalmente automatizado robótico19,21. La matriz de la membrana puede soportar múltiples rondas de desmontaje y reprobing ciclos. En nuestro estudio retrospectivo de17, se detectaron cambios en los patrones de antígenos con los antisueros de trasplante almacenado recogidos en una serie de tiempo (es decir, antes y después del trasplante). Adjunto describimos el protocolo técnico para el flujo de trabajo incluyendo el diseño de la matriz, fabricación, análisis de sondeo y resultado de antisuero. El método está pensado para la detección de aloanticuerpos contra epitopos lineales específicos en las moléculas HLA de donantes para trasplante.

Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Junta de revisión institucional para la Universidad Noroeste (IRB protocolo #: STU00104680). Un flujo de trabajo general del Protocolo se ilustra en la figura 1. 1. Análisis Bioinformático de donante y receptor HLA secuencias recuperar secuencias de base de datos IMGT/HLA 15. Informes mecanografiar HLA obtener de la donante de órganos y su destinatario. …

Representative Results

En el estudio original utilizando la matriz de proyección método17, inscribieron un total de 5 temas de trasplante de riñón. Obtuvimos el HLA mecanografía resultados de nuestra cohorte y sus respectivos donantes. Su historial médico y los títulos de anticuerpos alélica de SAB pruebas también estaban disponibles para nosotros. En nuestro estudio experimental de estos 5 pacientes, hemos elaborado dos metodologías diferentes: una matriz estándar consta de u…

Discussion

El diseño de la matriz de punto descrito aquí es para el estudio experimental de la especificidad del aloanticuerpo en el trasplante contra los antígenos HLA del donante de órganos. En contraste con el ensayo SAB existente ampliamente utilizado en clínica, el método de matriz de antígeno tiene una gran ventaja en su diseño flexible que puede acomodar el verdadero secuencias HLA del donante individual. La nueva plataforma explota las potencialidades de la tecnología de secuenciación de ADN rápido avance que pro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los Drs. Shawn Li y Li Xing de la Universidad de Western en Canadá por su amable ayuda con punto de arreglo de discos de producción. Agradecemos a los miembros del personal en el centro de histocompatibilidad y en la Universidad integral trasplante centro del noroeste de prestación de servicios de la muestra. Este trabajo ha sido apoyado en parte por la Junta Auxiliar de Northwestern Memorial Hospital y por un fondo de inicio de Facultad proporcionada por la Universidad Northwestern a J.J..

Materials

Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
Non-fat milk Bio Rad Laboratories 1706404
TBST Santa Cruz Biotechnology 10711454001
Goat anti-human IgG–HRP  ThermoFisher Scientific A18811
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad Laboratories 1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientifics 21059
ChemiDoc gel imaging system Bio Rad Laboratories 1708265 

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Cite This Article
Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).

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