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Biochemistry

Personalizada péptido matrices para la detección de aloanticuerpos HLA en trasplante de órganos

doi: 10.3791/56278 Published: September 6, 2017

Summary

Desajustes en las secuencias de leucocito humano antígeno (HLA) entre pares de receptores y donante de órganos son la causa principal de rechazo mediada por anticuerpos en el trasplante de órganos. Aquí presentamos el uso de matrices de antígeno personalizados basados en secuencias HLA de donantes individuales para sondear aloanticuerpos HLA de anti-donantes en receptores de órganos.

Abstract

Trasplante de órganos, la función y la longevidad del injerto críticamente confían en el éxito del control de la reactividad inmunológica del rechazo contra antígenos leucocitarios humanos (HLA). Directrices de histocompatibilidad se basan en pruebas de laboratorio de inmunidad anti-HLA, que presenta como preexistente o de novo generado anticuerpos HLA que constituyen una barrera importante del trasplante. Pruebas actuales son construidas en una plataforma de granos solo antígeno (SAB) usando un conjunto fijo de ~ 100 preseleccionados antígenos recombinantes de HLA para trasplante sera la punta de prueba. Sin embargo, en los seres humanos existe una mayor variedad de tipos de HLA, no dos individuos que no sean gemelos idénticos pueden compartir la misma combinación de secuencias HLA. Mientras que tecnologías avanzadas para el mecanografiar de HLA y la secuencia directa precisamente pueden capturar cualquier desajustes en la secuencia de ADN entre un donante y HLA del receptor, el ensayo SAB, debido a su limitada variedad en representación de la secuencia, es incapaz de detectar precisamente aloanticuerpos específicamente contra los desajustes HLA del donante. Se intentó desarrollar un método complementario utilizando una tecnología diferente para detectar y caracterizar anticuerpos HLA del donantes de forma personalizada. La herramienta de análisis es una matriz de péptido personalizado de donantes HLA-derivados secuencias sondeo poste-trasplanta suero del receptor órgano para evaluar el riesgo de rechazo mediado por anticuerpos. En una sola matriz para un par de donantes y receptores, hasta 600 péptidos únicos son hecha basado en secuencias de proteínas HLA del donante, cada péptido llevando al menos un residuo no coinciden en una secuencia de ácido amino-15. En nuestros experimentos piloto para comparar patrones de antígeno para pre y poste-trasplanta sera de estos arreglos de discos, hemos sido capaces de detectar señales de anti-HLA con la resolución que también nos permitió identificar los epítopos inmune involucrados. Estos personalizados matrices de antígeno permiten alta resolución detección de epítopos HLA específicos de donante en trasplante de órganos.

Introduction

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Terapia de reemplazo de órganos que habitualmente se lleva a cabo en todo el mundo ha salvado millones de vidas. Trasplante sólido del órgano ocurre en aproximadamente 100 pacientes por millón de personas en los Estados Unidos anualmente, mientras que un mayor número todavía están en listas de espera recibir órganos de donantes debido a una grave escasez de suministro (de acuerdo con información proporcionada por el órgano Adquisición y trasplante de la red - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Trasplante de órganos es altamente regulado con el fin de reducir los residuos de órganos y salvar vidas, pero las herramientas científicas utilizadas para informar de estas regulaciones están limitadas en su eficacia. Por ejemplo, la comunidad científica reconoce plenamente los Estados altamente polimórficos de las moléculas HLA y precisas pruebas genéticas de ADN mediante la tipificación de alta resolución y basados en la secuencia escribiendo (SBT) se han desarrollado en estos últimos años1, 2. sin embargo, métodos de prueba de aloanticuerpo no han todavía sido capaces de producir la gran variedad de secuencias HLA individuales como puntas de prueba de antígeno. La prueba estándar de hoy en día utiliza un panel invariable de ~ 100 antígenos alélicos que constan de variantes comunes del HLA, A, B, C, DQ, DP y DR las secuencias en las poblaciones humanas3,4,5,6. Con frecuencia, las secuencias HLA del donante real no están incluidas en el panel de prueba, obligando a los médicos de trasplante y cirujanos inferir reactividad específica de donantes basada en similitudes compartidas entre secuencias reales y correspondientes "normas" del donante en el set de prueba de7,8. En consecuencia, a veces es difícil hacer una estimación confiable del riesgo de rechazo basado en anticuerpos prueba resultados9,10,11,12. Por lo tanto, personalmente pruebas personalizables para aloanticuerpos son nuevos urgente13,14.

Los genes HLA codifican los receptores (MHC) complejo mayor de histocompatibilidad que tienen una función clave en la respuesta inmune6. Los genes HLA son conocidos por ser los genes más polimórficos de la genoma humano6. Debido a los rápidos avances en el ADN sequencing estrategias para los genes HLA, nuevas variantes alélicas (o simplemente denominados alelos) se descubren en un explosivo tipo15,16. Marzo de 2017, 16.755 alelos validados se habían depositados en la base de datos IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), de que 12.351 eran de clase y 4.404 eran de grupos de clase II. En contraste, sólo un poco más de 100 alelos diferentes están representados en el análisis de los granos solo antígeno estándar (SAB), que se utiliza rutinariamente para la detección de aloanticuerpos en trasplante de órganos. El método SAB está construido sobre una plataforma Luminex mediante citometría de flujo. Puesto que el análisis utiliza un conjunto invariable de antígenos, además de menor variabilidad de lote a lote en producción, la prueba de antisuero puede estandarizarse robusta a través de individuos y de los laboratorios5. Sin embargo, esta prueba es capaz de capturar todos los aloanticuerpos desarrollados específicamente contra los alelos del donante, especialmente cuando las secuencias de donantes están ausentes desde el SAB. Aunque la producción por encargo de los antígenos de los donantes basado en secuencias del verdadero son deseables, aún existen desafíos técnicos en la racionalización de la producción necesaria y procedimientos de prueba.

Recientemente hemos descrito una metodología alternativa en un estudio de viabilidad de trasplante renal sujetos17. El método utiliza antígenos del peptide en un formato de matriz para sondeo previo y poste-trasplante sueros de sujetos individuales. Cada arreglo de discos fue construido usando el SPOT síntesis método18,19,20,21,22,23 que produce antígenos péptidos, cada 15 aminoácidos de longitud, enteramente basado en alelos HLA del donante de órganos respectivos de A, B, C y DRB1, DQA1, DQB1. SPOT síntesis es operado en una membrana de celulosa utilizando Fmoc-química estándar22 y pueden producir cientos de péptidos personalizados en paralelo con un sistema totalmente automatizado robótico19,21. La matriz de la membrana puede soportar múltiples rondas de desmontaje y reprobing ciclos. En nuestro estudio retrospectivo de17, se detectaron cambios en los patrones de antígenos con los antisueros de trasplante almacenado recogidos en una serie de tiempo (es decir, antes y después del trasplante). Adjunto describimos el protocolo técnico para el flujo de trabajo incluyendo el diseño de la matriz, fabricación, análisis de sondeo y resultado de antisuero. El método está pensado para la detección de aloanticuerpos contra epitopos lineales específicos en las moléculas HLA de donantes para trasplante.

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Protocol

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Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Junta de revisión institucional para la Universidad Noroeste (IRB protocolo #: STU00104680). Un flujo de trabajo general del Protocolo se ilustra en la figura 1.

1. Análisis Bioinformático de donante y receptor HLA secuencias

  1. recuperar secuencias de base de datos IMGT/HLA 15.
    1. Informes mecanografiar HLA obtener de la donante de órganos y su destinatario.
      Nota: Asegúrese de que se utilizan los procedimientos adecuados para proteger los registros médicos confidenciales. Por lo general, la aprobación de la Junta de revisión institucional (IRB) el protocolo del estudio o la prueba experimental es necesaria según las pautas del IRB. Si HLA informes eran de polimerización en cadena-basado escribiendo (de alta o baja resolución) o basados en secuenciación de escribir (SBT), vaya directamente al paso 1.1.3. Si se obtuvieron secuencias de secuenciación genómica/HLA, y si son completas, utilice estas secuencias directamente. En ocasiones, cuando escribiendo solamente incompleto o secuenciación resultados están disponibles, siga los pasos adicionales 1.1.2. para asignar la " falta " alelos mediante la herramienta web se describe en el paso 1.1.2.
    2. Abrir las combinaciones alelo ambigua raíz web enlace - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html y utilice la búsqueda del “ herramienta de búsqueda de combinaciones de alelos ambiguo ” función para recuperar los alelos hipotéticos. A continuación, proceda al paso 1.1.3. escribir el nombre de alelo.
    3. Abrir el formulario de consulta IMGT/HLA alelos en el siguiente enlace - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html y el tema de entrada ’ nombres de alelo s (cada uno individualmente, como se muestra en la figura 2) en el “ búsqueda para ” caja. Haga clic en el “ búsqueda de alelos ahora ” botón. Nombres de alelo HLA deben utilizar sistemas de nomenclatura estándar (es decir, A *, A * 01, A * 01:01:01:01 y cualquier designaciones anteriores como A * 01010101).
    4. Encontrar el nombre de alelo correspondiente aparece en la pantalla. Haga clic en el botón de alelo.
    5. Copia la " secuencia de la proteína " y pegarlo en un documento de texto debajo de una línea de cabecera de " > nombre del alelo ". Efectivamente, es el documento de texto en formato FASTA (FAST-All) el nombre de alelo y la secuencia de.
  2. Realizar basado en genes múltiples alineaciones de alelos del donante y el receptor/paciente.
    1. Un gen (es decir, DQB1 * 03:01:01:01) a la vez, copie y pegue los cuatro alelos de las secuencias FASTA donante y del paciente (dos del donante) y dos del paciente en un documento de texto combinado. En este punto, es importante denotar diferencialmente nombres nombres paciente alelo alelo donante (las opciones incluyen el uso diferencial de alta vs baja casos; o crear una extensión distintiva de prefijo o sufijo a cada nombre de alelo para marcar por separado donantes vs. alelos del paciente). El orden de entrada de las secuencias no es importante porque la orden se mezclan según los niveles de semejanza entre cualquier par de secuencias de la alineación.
    2. Copiar y pegar las secuencias FASTA formato (como se ve en la figura 3) de arriba en la “ entrar en sus secuencias de entrada ” caja en la Página Web de grupo Omega: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
    3. Clic en " enviar su trabajo " utilizando la configuración estándar de los parámetros: como " PROTEINŔ y " Clustal w / números ". Realizar la alineación al hacer clic en " enviar ". Una alineación de las cuatro secuencias se muestra en la pantalla ( figura 4).
  3. Marca desajustes donante específico.
    Nota: Cabe especialmente señalar que las secuencias alélicas dadas aquí se basan en los resultados de la tipificación de HLA, no secuencia. Por lo tanto, es un riesgo que puede perderse la variación de la secuencia pertinente en la pareja donante-receptor particular. Este problema potencial se mitigarán como más y más centros de trasplante adoptan precisa tipificación de alta resolución y la secuencia de ADN dirigen.
    1. Copia y pega el texto de la alineación en un documento de texto y cree un nuevo documento. Si se altera el formato del archivo alineado, fijar el formato cambiando el estilo de fuente y tamaño: siempre use " Courier New " fuente de tamaño de tipo pequeño para adaptarse a las filas. Guardar el documento después de que se resuelven los problemas de formato.
    2. Inspeccionar manualmente las secuencias alineadas para identificar todos los residuos no coincidentes que pertenecen únicamente al donante. Cada uno de estos residuos específicos del donante con un distintivo color de fuente marca.
    3. Subrayar todas las letras en el donante ' s secuencias que ampliar 14 residuos tanto para arriba - y abajo de los marcados desajustes específicos de donante (calculado como péptido de aminoácidos 15 menos 1 residuo del desajuste).
  4. Derivar secuencias de péptidos de 15-mer en una serie de superposición.
    Nota: La razón de 15-mer péptidos se basó en el conocimiento general de los epitopos típicos están 4-9 aminoácidos en longitud. Por lo tanto, cuando aplicamos una " ventana móvil " procedimiento con un tamaño de paso de 4 aminoácidos ( figura 1), nuestra selección de una longitud de 15 aminoácidos dejó un 15-4 = 11 aminoácidos se solapan cualquier vecinos péptidos en una serie. En teoría, esta superposición de 11 aminoácidos es suficiente para cubrir todos los epitopos inmunes de hasta 9 aminoácidos en longitud, por lo que ningún método será inadvertidamente " partido " por la mitad con sólo secuencias parciales en la matriz.
    1. Usar las secuencias subrayadas como plantillas para derivar secuencialmente corto 15 secuencias de aminoácidos en una serie que se superponen por 4 residuos entre cualquier dos secuencias inmediatamente adyacentes en la serie.
    2. Copiar y pegar estos 15 secuencias de aminoácidos en una hoja de cálculo ( figura 5) en un formato de columna acompañan por columnas de notación que incluyen los nombres correspondientes de los alelos de donantes. Una columna adicional que incluyen posiciones de residuos aa puede ser de utilidad.
  5. Repetir los pasos de 1.1.3. a 1.3. por cada alelo HLA (es decir, A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 y DP) del donante y el receptor par derivar las 15 secuencias de aa corto del donante.
  6. Copia y pega todas las columnas en una hoja de cálculo principal para crear una columna larga continua de todas las secuencias de aa 15 de todos los alelos de los donantes. Anote el número total de filas (para las secuencias del peptide) en el documento de.

2. Diseño de aduana matriz de diseño y producción

  1. generar una hoja de cálculo de secuencias de péptidos con el alelo correspondiente llamamientos. La matriz tiene 20 filas y 30 columnas y puede contener hasta 20 x 30 = 600 puntos de péptidos. Dependiendo del número total de péptidos en 1.5 de un donante particular y basado en nuestra experiencia anterior con dos ejemplos que habíamos tratado en Liu et al. 17, la matriz punto 600 puede contener todas las secuencias generadas a partir de casos de trasplante separado ~ 2.
    1. Plan racional más emanera eficiente a los conjuntos de péptidos en el formato de 600 puntos de la matriz de.
    2. Si más de una asignatura puede caber en una matriz de entera, Insertar filas vacías después de la primer donante ' secuencias de s para que coincida con el número total de filas que se pueden dividir por 30 (el número de puntos en una fila en la matriz).
    3. Inmediatamente después de la última fila vacía para la primera serie de secuencias, pegue en toda la columna de contenidos de la secuencia del segundo caso de trasplante de.
    4. Repita estos pasos hasta que se llena la matriz y no hay más casos pueden añadirse sin superar los 600 puntos. Si se dejan las filas vacías todas para rellenar en la parte inferior, " mover " la fila vacía para colocarse entre los conjuntos de dos donantes. Este amplio espacio entre casos hace corte de la membrana después de la terminación de la síntesis más fácil - siguiente paso 3.2. por debajo de.
  2. Las secuencias de péptidos en el contexto del diseño de la matriz del programa. El programa del sintetizador SPOT lleva un formato de texto de las secuencias (secuencia de un péptido de una fila), que puede obtenerse directamente por guardar la hoja de cálculo resultante del paso 2.1.4 como un documento de texto simple (sin las columnas adicionales para los nombres de alelo, aa posiciones etc.).
  3. Gestión automatizada péptido matriz síntesis mediante el sintetizador de punto. Toda la operación de la síntesis se detalla en Kudithipudi et al. 21. Tenga en cuenta que la síntesis Fmoc de dos matrices toma ~ 4-5 días.

3. Recipiente del trasplante del probe y Reprobe antisueros de una serie de tiempo de una persona.

Nota: la matriz de la membrana de 600 puntos tiene las medidas ~ 7 cm x 13 cm. Después de síntesis, las matrices pueden almacenarse a temperatura ambiente como membranas secas para por lo menos dos años cuando está protegida de la luz directa. Evitar excesivo plegamiento de la membrana para mantener su longevidad para uso repetido.

  1. Rehidratar la matriz de la membrana con etanol y visualizar puntos de péptido con Ponceau S. Matriz
    1. rehidratar la membrana que los péptidos siguiendo un procedimiento paso a paso optimizado en Li et al. 24.
      1. sumergir la membrana de la matriz en 20 mL de etanol al 100%.
      2. Añadir 20 mL agua destilada agua para diluir la solución de etanol 50% e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
      3. Cambiar la solución de inmersión de 40 mL de agua 100% tres veces e incubar 15 min cada vez.
      4. Lavado en un buffer de trabajo adecuada, por ejemplo, 20 mL de TBST (Tris-buffer salino con 0.1%), tres veces por 5 minutos cada uno.
    2. Ponceau S la coloración de la matriz para visualizar péptidos sintéticos
      1. Añadir 20 mL de solución de Ponceau S previamente formulada directamente a la matriz hidratada e incube durante 30 s con sacudarir.
      2. Agua destilada de funcionamiento continuamente sobre la membrana a la mancha de fondo color Ponceau S. Durante el proceso, puntos de péptido de color rojo pueden llegar a ser visibles.
      3. Separar las porciones de la matriz para cada donante cortando cuidadosamente entre las secciones de la matriz para casos individuales. Marcar la orientación de cada arreglo de discos.
  2. Matriz pre-bloque. Leche descremada de
    1. bloque de la membrana en 20 mL de 5% disuelta en buffer TBST. Esta solución basada en la leche más manchas de color Ponceau S. Cambie el búfer de leche varias veces para conseguir las imágenes más claras del péptido.
    2. Para fines de registro, tomar una foto de la imagen de Ponceau S de la matriz mediante una cámara en mano (ejemplo en la figura 6).
    3. Continuar el bloqueo de la membrana en leche descremada de 5% a 4 ° C durante la noche o a temperatura ambiente durante 2 h con mecedora.
  3. Matriz de incubar con antisuero trasplante.
    Nota: Debe ser señaló que un fenómeno conocido como prozona o el efecto de gancho al resultado de interferencia dependientes de complemento en el análisis de anticuerpos del suero. Para evitar este problema, puede considerarse un paso de pretratamiento del suero opcional con la inactivación o el EDTA o el calor de las muestras de suero.
    1. Solución amortiguadora de bloqueo de quitar y lavar la membrana con 20 mL de TBST tres veces al día siguiente por 5 minutos cada vez.
    2. Añadir 20 μl del suero crudo del destinatario a 20 mL de 2.5% de la leche en buffer TBST e incubar con la membrana para 2-3 h a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que en esta ronda inicial de la sonda, se recomienda que el último poste-trasplanta suero (o probablemente más sensibilizada suero) en la serie de tiempo es en primer lugar. Esto se basa en la suposición de que las muestras anteriores de la serie, particularmente de momentos antes del trasplante, con menos variedad de aloanticuerpos que tienden a desarrollar con el tiempo. De esta manera, cualquier posibilidad de interferencia de la señal de " remanente " entre rondas de sondeo puede ser claramente distinguido de reactividad aloanticuerpo verdaderamente desarrollados debido a la respuesta inmune contra el injerto.
  4. Lavar la matriz usando 20 mL de TBST e incubar con el anticuerpo secundario.
    1. Lavar la membrana tres veces durante 10 minutos cada vez.
    2. Incubar con cabra anti-human IgG-HRP (peroxidasa de rábano) de anticuerpo secundario en dilución de 1: 10,000 en buffer TBST suplementado con 1% de leche para otra 2 h.
  5. Lavado y desarrollar el blot.
    1. Lavar la membrana tres veces con TBST durante 10 minutos cada vez.
    2. Realizar mejorado quimioluminescencia (ECL) con 5 mL de solución de luminol recién mezclado con 5 mL de solución de peróxido para el desarrollo de la membrana (para 1 minuto).
    3. ECL visualizar señales usando un sensor adecuado (es decir, sistemas de proyección de imagen del ChemiDoc o Azure C600).
  6. Analizar y cuantificar lo blot.
    1. Guardar las imágenes desarrolladas ( figura 7, imagen inferior) y realizar la cuantificación de la intensidad del punto.

4. Comparar la reactividad de antisuero a través de una serie clínica.

  1. Tira la matriz de.
    1. En este momento, mantener la membrana húmeda en todo momento.
    2. Tira de la membrana por incubación con 20 mL de tampón de extracción comercial a 37 ° C por 20 min y luego lavar la membrana con TBST tres veces de 10 minutos cada uno. Luego repetir el bloqueo (paso 4.2) y sondeo los pasos (paso 4.3) mediante distintas de suero del paciente tomada en un punto del tiempo diferentes.
  2. Bloque pelado membrana.
    Nota: Después de pelar, la membrana puede ser reutilizada para otra ronda de sondeo de diferentes sueros del mismo paciente en una serie de tiempo.
    1. Bloquear la membrana usando buffer de leche de 5% como antes (ver paso 3.2).
  3. Reprobe un antisuero diferentes de la misma serie de tiempo (Repita los pasos de 3.3-3.6; ejemplo en la figura 7, imagen superior).
    Nota: La matriz despojada puede utilizarse entonces para reprobe otra muestra de suero. Puesto que los péptidos se conjugan covalentemente a la matriz de soporte de la membrana, demostró que la matriz puede ser reutilizada para hasta 20 rondas de desmontaje y reprobing ciclos sin perder su performance.
  4. Almacenamiento a largo plazo de arreglos de discos.
    1. Tienda la membrana en tampón TBS suplementado con 0,02% de azida de sodio peso como conservante. Utilizar una bolsa de plástico sellada para el almacenamiento a largo plazo. A 4 ° C bajo la protección de la luz directa, la membrana húmeda puede guardarse durante al menos 2 años.

5. Adquisición de datos y análisis

  1. anotar manualmente péptidos del antígeno positivo.
    1. Localizar puntos mostrando señales positivas de anticuerpos y determinar cada uno de sus posiciones en la parrilla.
    2. Destacar las filas correspondientes en la hoja principal para los péptidos positivos.
  2. Recuperar secuencias de péptidos listadas en la hoja principal ( figura 7, lista de la parte inferior). Según el principio de diseño descrito en el paso 1.4.1., puntos seriales vecinos comparten secuencias superpuestas significativamente (15-4 = 11), por lo tanto epítopos reactivos pueden ser compartida por péptidos en una serie consecutiva.
    1. Destacar cualquier puntos positivos que ocurren en la sucesión.
  3. Determinar la longitud mínima del epítopo para cada péptido en una serie.
    1. Resaltar cualquier secuencia del epítopo potencialmente compartido basado en superposición de segmentos de péptidos reactivos.
  4. Modelo estructural epitopos del antígeno.
    1. Obtener estructuras cristalinas de prototipo HLA de Protein Data Bank en el siguiente el enlace: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
    2. Mostrar el prototipo de estructura HLA en Pymol (descargar de www.pymol.org).
    3. Mapa " o modelo donante contra epítopos a las estructuras 3D de las moléculas HLA de prototipo al destacar las secuencias del péptido reactivo ( figura 8). Haga clic en " pantalla ", entonces " fondo " y seleccione " blanco ". Para guardar la imagen, vaya a " archivos " y " imagen de guardar como " y seleccione el formato de archivo " png ".
  5. Informe de resultados y asignar epítopes reactivos a los alelos correspondientes.
  6. Compara array resultados a los resultados de antígeno solo granos (SAB), si está disponible.
    Nota: La prueba SAB usando antígenos alélicos solo mide la reactividad de anticuerpos hacia un panel fijo de proteínas HLA. Los péptidos que muestran reactividad de anticuerpos pertenecen a ciertos alelos HLA que, si también se incluyen en el panel SAB, permiten la comparación directa entre la matriz y los resultados SAB. Nuestro anterior estudio 17 mostraron un alto nivel de correlación entre los resultados, sugiriendo que los epitopos de péptidos contribuyen significativamente a la reactividad general de Sab Además, los resultados de la matriz también revelan aminoácido-niveles de especificidad.
    1. Obtener SAB resultados de un laboratorio HLA que proporciona información acerca de si y que alelos de donantes son reactivos a poste-trasplante el suero del paciente. Resultados del paso 5.5. basado en la matriz de análisis proporcionan también información sobre correspondiente alelos de donantes positivos para reactividad del aloanticuerpo.
    2. SAB comparar y matriz de resultados.

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Representative Results

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En el estudio original utilizando la matriz de proyección método17, inscribieron un total de 5 temas de trasplante de riñón. Obtuvimos el HLA mecanografía resultados de nuestra cohorte y sus respectivos donantes. Su historial médico y los títulos de anticuerpos alélica de SAB pruebas también estaban disponibles para nosotros. En nuestro estudio experimental de estos 5 pacientes, hemos elaborado dos metodologías diferentes: una matriz estándar consta de un panel fijo de péptidos y arreglos personalizados que fueron encargo hecho para cada par de donante y receptor. Mientras que el primer método había permitido validar técnicamente el funcionamiento de la plataforma de la matriz en el logro de altos niveles de especificidad en los trasplantes, el protocolo personalizado para este método se describe en este artículo y video la intención para la completa detección de anticuerpos donante específicos (DSA), que a menudo se correlacionan con injerto pobres resultados5,25,26.

Los arreglos personalizados fueron aplicados a dos de los cinco casos17, y para ilustrar el flujo de trabajo general del método, aquí nos centramos en uno de estos dos pacientes (es decir, PTN Nº 4). La tecnología clave para la fabricación de matriz personalizada péptido implica al sintetizador del lugar. Es un sistema totalmente automatizado robótico que hace péptidos usando síntesis Fmoc directamente una matriz celular especialmente derivada de una membrana (figura 1). Hemos aprovechado la flexibilidad del sintetizador para montar grandes conjuntos de péptidos derivados de secuencias HLA de donantes individuales del órgano. Para tener una cobertura suficiente para evitar una situación cuando un epítopo continuado es ser "split" y pierde reactividad de anticuerpos, siguió un diseño de "caminar" de péptidos serie a 15-4 = 11 residuos solapan cualquier péptidos inmediatamente adyacentes, así que la serie siempre es suficiente para cubrir la longitud típica de epítopos de anticuerpos estima aa 4-9 de largo (figura 1).

Las secuencias HLA de plantilla se descargaron directamente de la base de datos de repositorio en EMBL-EBI (Instituto Europeo de bioinformática). Por ejemplo, donantes de PTN #4 de HLA-DQB1 * 03:01:01:01 alelo era buscado (ilustración de la página web en la figura 2). En conjunto, hemos descargado por separado secuencias para el allele de HLA-DQB1 segundo del donante de * 02: 01:01, así como los de PTN #4 sí, HLA-DQB1 * 4:02 y * 5:01. Alineamiento múltiple de secuencias entonces fue realizado usando las funciones de Clustal Omega web (figura 3). El archivo de alineación resultante fue obtenido (figura 4), que se identificaron todos los residuos del aminoácido no coinciden (residuos del donante se destacan). A continuación, marcamos secuencias de plantilla (subrayadas) del donante que eran suficientemente largos para cubrir todos sus residuos no coincidentes. Basado en estas secuencias de la plantilla y siguiendo un diseño de "caminar" como se describe anteriormente, tres series de péptidos cada 15 aa de longitud fueron derivadas para HLA-DQB1. Este proceso se repitió con el resto de los alelos de HLA-A, B, C, DQA1 y DRB1 del donante (DRA1 y DP se excluyeron debido a falta de la historia clínica pertinente) en comparación con los alelos correspondientes de su destinatario. Al final, un total de 202 péptidos fueron alistados para la fabricación de la matriz (secuencias de péptidos en una hoja de cálculo en la figura 5 y una ilustración de la matriz en la figura 6) específicamente para sondeo suero de poste-trasplanta PTN #4 y compararon los resultados con los obtenidos de una reprobing posterior de su suero antes del trasplante (figura 7). De los 202 péptidos, un total de 10 señales mostraron anticuerpos asociados con el poste-trasplanta la muestra de que residuos específicos de donante (Lencería desconjunta del receptor) E87, I306, W243 y K197 de HLA-B * 52:01, B * 52:01, - C * 3:04 y - DQA1 * parecía 5:01 involucrados en incitar a la reactividad de anticuerpos (residuos indicadas en letras rojas en la figura 7).

Además, una de las principales ventajas del método de arreglo de discos en comparación con la tradicional prueba SAB es que del epítopo puede fácilmente obtener información, como se muestra en la figura 7. Comparamos los epitopos anticuerpos reactivos en HLA-DQA1 y - DQB1 de los cinco pacientes (de resultados de matriz distinta de Liu et al. 17) por tenerlos todos modelados a una estructura de cristal Co del heterodimer DQA1 y DQB1 (figura 8). Es alentador, un segmento importante de la estructura conocida como la cadena β1 es un "hotspot" que tenían mucho más riesgo (3/5 en pacientes 2,3,5) dirigido por aloanticuerpos entre los temas de trasplante en la cohorte de casos 5.

Figure 1
Figura 1 . El esquema general del método de matriz basada en HLA antígeno para la detección de aloanticuerpos HLA de anti-donantes en receptores de órganos. (Adaptado y modificado de Liu et al. 17) por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Sitio web del repositorio de datos
Para recuperar secuencias HLA, visite el siguiente sitio web: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Múltiples proteínas secuencias de alineación de los donantes vs destinatarios alelos de HLA-DQB1 con Clustal Omega herramienta basada en web.
Copiar y pegar secuencias de DQB1 de paciente #4(PTN#4) * 0201 y 3:01 y de DQB1 de donantes * 4:02 y 5:01 en formato FASTA en http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (Ilustración, DQB1 * 5:01 de PTN #4 y DQB1 * 3:01 del donante se muestran en el cuadro de entrada) . Seleccione la opción "Clustal w / números" en "STEP2" para formato de salida y ejecutar la alineación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Comparación dedonante y paciente/receptor HLA DQB1 y selección de secuencias de plantilla para la síntesis de péptidos.
Las secuencias de los donantes son en negrilla, con desajustes específicos de donante en fuente de color rojo y también destacaron con cajas negras. Secuencias de plantilla (subrayadas) para derivar péptidos contienen estos residuos específicos de donante. (Esta cifra fue adaptada y modificada de Liuet al. 17) por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Un ejemplo ilustrativo de la hoja principal en una hoja de cálculo de péptidos HLA de donantes.
Posición del péptido en la matriz se indica por fila y columna coordenadas. Secuencias de péptidos se utilizan para síntesis mediante robot sintetizador de punto del programa. Residuos específicos de donante (Lencería desconjunta de alelos correspondientes del destinatario) son destacados en negrita y subrayados. También se indican las posiciones inicial y final del péptido correspondiente a las secuencias de longitud completo HLA-DQB1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 . Imagen de una sección de matriz teñidas con Ponceau S
Nota la disparidad en la intensidad del color debido a la diferencia en la composición de aminoácidos entre péptidos, mientras que las concentraciones de péptido entre todas las áreas de terreno son las mismas. (La imagen es un ejemplo ilustrativo, no uno de este estudio real). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 . Específicos de donante HLA-A, B, C, DQ, DR estudio de matriz de epítopos no coinciden en PTN Nº 4.
Serie péptidos fueron derivados de secuencias del donante para cubrir residuos no coincidentes (un ejemplo DQB1 en la figura 4). La matriz se utilizó para probar el suero después del trasplante (blot inferior: post-TX) y posteriormente el suero antes del trasplante (blot superior: pre-TX) del mismo paciente. Los cuatro conjuntos de puntos fuertes de poste-trasplanta sondeo están marcados por líneas rojas (en la mancha baja), mientras que dos manchas de intensidad media que sólo se asociaron con pre-trasplante suero están marcadas por líneas azules (en la mancha superior). La tabla inferior muestra las correspondientes secuencias de péptidos y su reactividad al suero después del trasplante. Específicos del donante (no coincidentes) residuos E87, I306, W243 K197 de sus respectivos alelos están en letras rojas y péptidos que muestran reactividad anticuerpo fuerte están en fuente en negritas. Esta cifra fue adaptada y modificada de Liu et al. 17. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8 . Ubicación estructural de epitopos de HLA-DQ.
Estructura cristalina Co de HLA-DQ8 fue utilizado como una plantilla. La estructura constaba de un DQA1 y un subunidades DQB1 junto con un péptido antígeno (A). Estructuras secundarias de proteínas de las α-hélices y β-filamentos se muestran en el panel (B). Péptidos DQA1 y DQB1 que reaccionó con una de suero cinco se encontraban en la estructura cristalina Co (en A y en B: sombreado en azul). Tres hebras β β1, β6 y β12 (azul oscuro en B), cada uno representado por múltiples péptidos (corta líneas rojas corresponden a las posiciones aa lineales de DQA1) reaccionó con muestras de varios pacientes (resultados originales en Liu et al. 17). todos seis DQB1 péptidos (en negrillas) reactivas a los anticuerpos en los pacientes #2, #3, #5 se encuentran en el segmento de "hotspot" de β1 ( b: señalado por la flecha roja). Esta figura fue adaptada de Liu et al. 17. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El diseño de la matriz de punto descrito aquí es para el estudio experimental de la especificidad del aloanticuerpo en el trasplante contra los antígenos HLA del donante de órganos. En contraste con el ensayo SAB existente ampliamente utilizado en clínica, el método de matriz de antígeno tiene una gran ventaja en su diseño flexible que puede acomodar el verdadero secuencias HLA del donante individual. La nueva plataforma explota las potencialidades de la tecnología de secuenciación de ADN rápido avance que pronto serán capaces de producir lecturas de secuencia alélica de HLA precisas sin ambigüedad16,27 y el potencial de las bases de datos designadas para repositorio HLA secuencias de15 en la población mundial. Nuestro protocolo actual de la matriz de proyección fue desarrollado basándose en el éxito de varios estudios piloto de sueros de trasplante. Aquí debemos destacar que en esta etapa, nuestras matrices prototipo están construidos exclusivamente para fines de investigación, no para usos de diagnóstico en la práctica clínica.

Otra notable distinción entre SAB y nuestra gama de antígeno es que este último tiene una mayor resolución para distinguir posibles epítopes del antígeno dentro de los 15 segmentos aa de secuencias HLA, que podrían proporcionar información valiosa sobre alloantigenicity18 . Sin embargo, a diferencia de la SAB que presenta antígenos de proteína entera para adaptar sus estructuras plegadas, la matriz de antígeno sólo incorpora péptidos cortos, que no incluye información sobre plegamiento conformacional. Por lo tanto, las matrices no pueden detectar los anticuerpos que sólo reconocen epitopos conformacionales, que algunos creen que constituyen una mayoría de todos epítopes funcionales relevantes para anticuerpo mediado rechazo28,29. Todavía, en otros contextos, acciones de anticuerpos contra epítopos lineales, tales como ésos en péptidos cortos, están siendo explotadas en las respuestas de antígeno viral y en vacuna diseño30,31. También debemos señalar que, en el número limitado de muestras de pacientes analizadas, el rendimiento de sensibilidad de detección de nuestro arsenal superó de SAB y permitió la detección de anticuerpos específicos de donante antes17 durante la progresión clínica de rechazo mediado por anticuerpos. Esto es debido a la alta concentración molar de los péptidos del antígeno local en el arreglo de discos en comparación con Sab Esta característica fue especialmente útil en casos cuando SAB no detectó ninguna reactividad mientras que la evidencia clínica y patológica de rechazo mediada por anticuerpo era evidente, como demostró anteriormente17. Sin embargo, es importante señalar que esta prueba personalizada es más desperdiciador de tiempo que la prueba estándar de SAB. El test de la array requiere obtener el órgano secuencias HLA del donante y del receptor (propuesto) antes de iniciar el diseño de péptidos del antígeno. Luego toma varios días para producir la matriz y el otro 7-8 horas para obtener resultados de anticuerpos. Por lo tanto, el procedimiento largo no es apto para trasplante de donante fallecido, a menos que el principal objetivo de la prueba de anticuerpos para determinar la aparición de anticuerpos específicos de donante después del trasplante, en lugar de para la evaluación pre-trasplante de anticuerpos existentes.

El método de matriz tuvo una mejora importante de la prueba existente del SAB en la detección de epítopos del antígeno. Además, hicimos un intento de mapa epítopes reactivos en cinco pacientes de trasplante a una estructura de plantilla de HLA-DQ, en el que observamos al menos un epitopo prominente "hotspot" en su cadena β1 que ocurrió en tres de los cinco pacientes17. Curiosamente, los filamentos de β1 de HLA-DQA1 y - DQB1 se encuentran en la ranura de la cóncava de antígeno-presentación (figura 8), una situación conocida por ser antigénica en el contexto de rechazo de trasplante de32. Por lo tanto, esperamos que futuras exploraciones de nuestro método de matriz de antígeno personalizada en estudios de cohorte extendido trasplante dará información valiosa sobre hotspots antigénicos de las moléculas HLA. Un catálogo de estos hotspots identificados, cuando se considere conjuntamente con alta precisión ADN secuencia tipificación de genes HLA entre los posibles donantes y receptores, ayudará en última instancia las decisiones antes del trasplante a través de programas de desajuste aceptable 33, destinadas a evitar más eficazmente ciertos desajustes en proximidades a hotspots catalogados.

En Resumen, nuestro estudio original17 en explorar el diseño personalizado de una matriz de antígeno para la detección de aloanticuerpos anti-HLA específicos fue el primero de su tipo. Objetivo del estudio era sobre la viabilidad de la matriz diseño e implementación, que sirvió como prototipo para la tecnología futura potencial. Nuestro estudio piloto no sólo genera resultados de muestras clínicas alentadores, pero también nos permitió estimar el costo total y la velocidad de la prueba. El costo de producción de una matriz personalizada en nuestro actual entorno de laboratorio está bajo $1,000 USD, que es un costo por única vez ya que la matriz se puede utilizar con el tiempo en hasta 20 rondas de reprobing ciclos sin pérdida de rendimiento. Es posible que pruebas adicionales del protocolo conjunto con una cohorte más amplia de temas de trasplante más serán optimizar el método que podría un día ser utilizado en la práctica clínica.

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Disclosures

No hay conflictos de intereses, declaró.

Acknowledgments

Agradecemos a los Drs. Shawn Li y Li Xing de la Universidad de Western en Canadá por su amable ayuda con punto de arreglo de discos de producción. Agradecemos a los miembros del personal en el centro de histocompatibilidad y en la Universidad integral trasplante centro del noroeste de prestación de servicios de la muestra. Este trabajo ha sido apoyado en parte por la Junta Auxiliar de Northwestern Memorial Hospital y por un fondo de inicio de Facultad proporcionada por la Universidad Northwestern a J.J..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
Non-fat milk Bio Rad Laboratories 1706404
TBST Santa Cruz Biotechnology 10711454001
Goat anti-human IgG–HRP  ThermoFisher Scientific A18811
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad Laboratories 1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientifics 21059
ChemiDoc gel imaging system Bio Rad Laboratories 1708265 

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Personalizada péptido matrices para la detección de aloanticuerpos HLA en trasplante de órganos
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Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).More

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).

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