Summary
구 균 에서 탄수화물 기질 의무적인 단백질의 광범위 한 생 화 학적 및 구조 특성화를 수행 하기 위한 효율적인된 프로토콜 제공 됩니다.
Abstract
구 균 (렴)에 대 한 새로운 제 및 백신 개발은 여러 방지 종자의 급속 한 증가 중단 하는 데 필요한. 탄수화물 기질 의무적인 단백질 (SBPs) 그들의 extracellular 지역화 및 폐 렴 물질 대사에 대 한 탄수화물의 centrality 단백질 기반 백신과 새로운 제의 개발에 대 한 실행 가능한 목표를 대표 각각. 여기에 설명 된 다른 탄수화물 SBPs는 pneumococcus과 다른 박테리아에서 확장 될 수 있습니다 SP0092의 포괄적인 특성화를 수행 하는 합리화 통합된 프로토콜이입니다. 이 절차는 단백질의이 클래스에 대 한 억제제의 구조-기반의 디자인을 도움이 있습니다. 제시이 원고에의 첫 번째 부분에서 열 교대 분석 실험에 의해 생 화 확 적인 분석을 위한 프로토콜, 다중 산란 (MALS), 각도 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 안정성 최적화는 그리고 샘플의 이동 결정 화 실험 그리고 성공의 확률을 향상. 이 절차의 두 번째 부분 결정된 단백질을 해결 하는 데 사용할 수 있는 측정 데이터에 대 한 가변 파장 변칙 회절 싱크 로트 론 beamline 및 데이터 수집 프로토콜을 사용 하 여 SBP 결정의 특성을 설명 합니다. 구조입니다.
Introduction
S. 균 (렴)은 그람 양성 박테리아 원인이 중이염, 폐 렴, 패 혈 증, 패 혈 증, 일반적으로 메 마른 틈새 마이그레이션할 수와 인간의 호흡기의 위 항공에 asymptomatically 거주 하 고 수 막 염1,2. 또한, 폐 렴 감염 임상 및 경제적 부담 전세계3,4에 기여 하는 지역 사회 획득 폐 렴의 주요 원인입니다. S. 균 의 항생제 내성 변종 전세계 확산 및 7-발렌타인와 13-발렌타인 폐 렴 단백질 어원이 백신 도움이 있지만 항균 성 저항, 교체 긴장에서의 속도 줄일 백신 사용 등장 하 고 연구를 위한 증가 요구에 폐 렴 균 성 질병5,6,,78에 대 한 새로운 치료법의 개발으로 이어졌다.
고 렴 설탕은 탄소 소스9,10; 호스트에서 가져온에 따라 달라 집니다. 실제로 그것은 그것의 가져오기 기계 32 다른 탄수화물11,,1213의 수송의 30%를 탕 진. 이러한 수입에는 적어도 8 개의 ABC 운송업 자13포함 됩니다. ABC 운송업 자에 extracellular SBPs는 리간드에 대 한 특이성을 결정 하 고 셀에 통풍 관에 대 한 필수적인 막 운송업 자에 게 제시에 근본적인 역할을 재생 합니다. SBPs 표면 단백질 및 세포질 과정에 있는 그들의 중요 한 역할 때문에 새로운 백신과 항균의 디자인에 대 한 유효한 목표를 나타냅니다.
대상 단백질 특성 및 리간드 주머니와 우선 유연성 같은 구조 기능에 대 한 자세한 설명을 구조 기반 약물 설계14,15에 대 한 유용한 도구를 제공합니다. X 선 결정학은 원자 해상도, 가까이 단백질의 구조적 특성에 대 한 선택의 방법 그러나 결정 화 과정은 예측할 수 없는 시간과 항상 성공 하지. 체계적인 방법 성공률 개선 하 고 중요 한 요소는 샘플의 품질 및 안정성. 결정 화의 단백질 화학 속성 및 샘플 준비 방법론에 의해 좌우 된다. 이러한 효과 평가 고 생 화 학적 특성16,17정보 수 있습니다.
구조 기반 디자인에 대 한 추가 합병증은 결정학 위상 문제를 해결 해야 합니다. 더 많은 단백질 구조를 사용할 수 있게 되는, 많은 구조는 동종 구조18분자 교체 방법으로 해결할 수 있습니다. SBPs 현재의 유연한 도메인 구조, 분자 교체 또한 도전19를 증명할 수 있습니다. 충분히 유사한 대상 단백질 구조 모델 사용할 수 없는 경우, 다양 한 기술 실험 위상20를 사용할 수 있습니다. 이 중, 단일 파장 변칙 분산 (슬픈) 메서드는 기본 기법으로 떠오르고 있다 고21의 위상 문제 해결 하기 위해 광범위 하 게 사용 되었습니다. 검색 및 약한 비정상적인 신호22,23, 를 단계적으로 조정의 사용을 허용 하도록 데이터 수집 전략 뿐만 아니라 하드웨어 및 소프트웨어, 개선 슬픈 메서드를 사용 하 여 더 고급 24. 회절 데이터 원자 해상도 필요, 과거에는 고분자의 구조를 해결 이제 이용 될 수 있다 프로그램에서 구현 될 때 예를 들어 stereochemical 지식을 결합 하 여 대 한 직접적인 방법에서 또한, 발전 ARCIMOLDO25. 결정학에서 위상 문제를 해결 하기 위한 방법 중 유용한 리뷰 테일러26에 의해 주어진 다.
여기 선물이 탄수화물 전송 SBP, 미 균의 SP0092 특성에 대 한 합리화 프로토콜 통합 생화학 및 구조 기술 (그림 1). 이 단계별 프로토콜 생활의 모든 왕국에 있는 일반적으로 SBPs에 구조 연구의 성공률을 개선 하기 위해 전략의 유용한 예제 테스트 사례를 제공 합니다. 특히, 프로토콜 솔루션을 신속 하 고 효과적인 방법에 있는 단백질의 가장 안정적인 oligomeric 상태 특성화의 중요성을 강조 하며 결정 화 실험에 대 한 후속 최고의 종의 식별 500 SBP 구조 단백질 데이터 은행27에 보고 있지만, 분자 교체 경첩 지역19로 연결 되는 2 개의 α/β 도메인 고유의 유연한 특성상 전하실 수 있습니다. 따라서, 프로토콜의 두 번째 부분에서 설명 합니다 슬픈 방법을 사용 하 여 바인딩된 금속 이온에서 단계적으로 SBPs, 일반적으로 selenomethionine의 셀레늄 (Se)의 사용에 대 한 슬픈 단계적.
Protocol
참고: 신호 펩 티 드 삭제 된 코딩 순서-퓨전 하는 표준 프로토콜에 따라 pOPINF 벡터에 복제, 네이티브 단백질은 대장균 BL21 로제타 세포에서 그의 태그 융합으로 표현 28 , 29. variant를 표시 하는 selenomethionine 제조 업체 30에 따라 표준 방법에 따라 표시 됩니다. SBP 이전 정화 재조합 설명 31 , 32.
1. 생 화 확 적인 특성
- 열 0, 0.5 M ~ 9.5와 NaCl 농도
- ph 4.0에서까지 준비 48 버퍼 솔루션의 분석 결과 이동 하 고에 설명 된 대로 40 µ L 96 잘 접시에 분배 표 1 33.
- 1-2 mg/mL 농도에서 SBP 솔루션의 각 잘 5 µ L에 추가.
- 단백질 (재료의 표 참조)에 대 한 형광 얼룩 x 20의 각 잘 5 µ L에 추가.
- Pipetting으로 솔루션을 혼합, 투명 접착 필름을 사용 하 여 접시를 봉인 하 고 실내 온도에서 112 x g에서 2 분 동안 회전.
- 실시간 컴퓨터에 실험을 실행: 99 ° c 10 s 대기 시간 4에서 3 ° C/min의 온도 경사로 설정 하 고 읽기 형광 483 nm에서 여기와 568에서 방출 0.5 ° C 마다 nm.
- 파생의 최소 용융 온도 (T m)을 확인 모든 버퍼 조건에 대 한 형광 방출 곡선 분석.
참고:이 절차는 단백질 안정성의 개선에 도움을 최고의 버퍼 솔루션의 좋은 표시를 제공 합니다. PH 범위 및 소금 농도 높은 T m 버퍼 조건에 따라 선택 하 고 추가 글리세롤과의 0.5 m m의 2.5% (v/v) tris(2-carboxyethyl) 정의 다음 단계 (초-버퍼) 버퍼 솔루션 phosphine (TCEP).
- MALS 및 분석
- degassed 필터링 된 물 (다양 한 분자량 24 mL 열 사용) 미리 포장된 젤 여과 열의 두 열 볼륨 세척 수행.
- 산란 검출기에 열을 연결 하 고 열 교대 분석 실험에서 결정 초 버퍼 열 equilibrate.
- Equilibrated 초 열과 흐름 한 열 볼륨에 초 버퍼의 5 mg/mL에서 순화 SBP의 주사 100 µ L.
- 단일 또는 여러 개의 봉우리에 대 한 차입 크로마를 확인 하 고 어 금 니 질량 및 모든 종족에 대 한 증가할수록 인덱스 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분산 데이터 검사.
참고: 해당 oligomeric 종 하 모든 피크에 대 한 유리 하다는 증가할수록 확인 색인 어 금 니 질량 분자 (Mw/Mn)의 수에 가중치는 질량/어 금 니 질량에 가중치로 계산. 증가할수록 값이 1에 가까우면 monodispersed 피크 나타냅니다.
참고: 모든 oligomerization 종 정의, 그것은 유용 단백질 농도에 대 한 그들의 의존을 공부 높은 농도 더 큰 올리고 머 형성을 부탁 수 있습니다으로. - 여러 분석 초 실행 실행; equilibrated 젤 여과 열 (다양 한 분자량 5 mL 열 사용)에 농도 (0.1-10 mg/mL) 증가에서 순화 SBP의 100 µ L를 주사 및 흐름 초 버퍼의 볼륨 하나 열 때마다.
- 단일 또는 여러 개의 봉우리에 대 한 차입 크로마를 확인 하 고 280에서 흡 광도 농도 분석 다른 시작 단백질 농도에 해당 하는 곡선의 nm. 다른 봉우리의 상대 농도 일정 하 게 유지 하는 경우 oligomeric 종 간의 상호 변환이 존재 이다. 다른 농도에서 상대 농도에 변화는 단백질 농도에 따라 다른 oligomeric 종 사이 interconversion.
참고:이 특성 단계는 결정 화에 대 한 더 적합 어떤 종 정의 기본 이다. 실제로, 뚜렷한 monodispersed 종은 구체화 정의 농도에 꾸준한 oligomeric 상태에 있는 경우 더 쉽습니다.
2. 단백질 준비 및 결정 화
degassed 필터링 된 물,- 열 볼륨 후
- 대리점 초
- 세척 초 버퍼 (광범위 한 분자 무게 120 mL 대리점 사전 포장된 젤 여과 열 equilibrate 열).
- Equilibrated 젤 여과 열과 흐름 한 열 볼륨 초 버퍼의 5-50 mg/mL에서 순화 SBP의 1-5 mL 주입.
- 1 mL 분수 통해 열 흐름 수집.
- 단일 단 분산 피크에 해당 하는 분수 풀; 1500 g에서 15 mL 원심 필터에서 샘플을 회전 하 고 원하는 농도 달성 때까지 농도 계량 (SP0092에 대 한 일반적으로 50-100 mg/mL).
- 결정 화
- 제조 업체에 의해 설명 된 대로 테스트 사전 결정을 사용 하 여 결정 화 실험에 대 한 최적의 농도 범위 결정:
- 디스 펜스 0.5-1.0 mL 각 4 화 테스트의 24 잘 앉아있는 다른 저수지에서 솔루션 드롭 결정 화 접시.
- 결정 화 방울 저수지 솔루션의 1 µ L로 단백질 해결책의 1 µ L를 혼합 하 여 준비, 접시, 인감 및 이상의 1 h (보다 안정적인 결과 하룻밤 부 화 후 얻을 수 있습니다)에 대 한 실 온에서 품 어.
- 10 배 확대 현미경을 사용 하 여 각 농도 대 한 드롭 품질 확인.
참고: 적어도 3 개의 다른 단백질 농도 테스트: (I) 분명 남은 상품의 대부분은 단백질 결정 화;에 대 한 너무 희석이 나타냅니다 (II) 대부분 안 약의 무거운 침전의 존재 의미는 지나치게 높은 농도; 그리고 분명 방울과 침전 (더 가벼운 경우) (III) 균형 잡힌된 발생 시험된 농도 결정 화에 대 한 유리한 좋은 표시 이다.
- 준비 96 잘 앉아 드롭 결정 화 접시; 각 저수지 잘 34 , 35 ,에서 다른 상용 화 솔루션의 100 µ L를 분배 36 , 37.
- 단백질 결정 화 로봇 시스템을 사용 하 여 모든 결정 화 방울 우물에서 이전에 정의 된 농도 (단계 1.1.6)에서 샘플의 특 면 100 nL.
- 다른 저수지의 특 면 100 nL 솔루션 해당 결정을 드롭 단백질 단계 2.2.3에서에서 적절 하 게 혼합 하는 우물. 봉인 하 고 증발을 피하기 위해 결정 화 방울 저수지와의 평형 결정 화 접시.
- 체크 방울 정기적으로 (처음 1-2 일 마다, 매주 나중) (적어도) 10 배를 사용 하 여 크리스탈 형성 및 성장 확대 현미경.
참고: 자동된 이미징 시스템 단백질 결정 화에 사용할 수 있습니다 위한 상품 시각화 및 캡처.
- 제조 업체에 의해 설명 된 대로 테스트 사전 결정을 사용 하 여 결정 화 실험에 대 한 최적의 농도 범위 결정:
- 크리스탈 장착
- 글리세롤 (최종 농도)의 25% (v/v)을 추가 하 여 (따라서 교체는 초기에 물 25% 결정 화 조건 cryoprotectant 솔루션을 준비 혼합물) 38.
- 채우기 거품 액체 질소 및 장소 샘플 인클로저 부분의 dewar로 유 니 퍽 dewar. 액체 질소 온도에 냉각 허용.
- 잘라내기 및 결정 형성 된다 드롭 통해 결정 화 접시에서 씰링 테이프 제거.
- Cryoprotectant 솔루션 대상 드롭의 가까이에 위치 하는 coverslide에 1 µ L의 드롭 장소.
- Cryoprotectant 솔루션 드롭 자기 지팡이 39 , 40에 장착 된 척추 표준 기지에 나일론 cryo-루프를 사용 하 여 원본에서 선택한 크리스탈 전송.
- 빨리 cryoprotectant 드롭 크리스탈 액체 질소, 유 니 퍽 샘플 소유자의 첫 번째 빈 위치에 루프를 배치 전송.
- (씰링 테이프 컷된 단계)에서 모든 원하는 결정 수확 되 고 유 니 퍽 샘플 홀더에 저장 될 때까지 반복.
- 장소 유 니 퍽 유 니 퍽 퍽 지팡이 사용 하 여 기준 및 조건 (액체 질소) beamline 퍽을.
주의: 매우 낮은 온도! - Cryo-집게와 퍽 사용 uni 로드 dewar 로드 도구-beamline 샘플 체인저 로봇에 puck(s) dewar. 유 니 퍽 샘플 홀더 샘플 루프 홀더 샘플 로봇에 똑바로 떠나 기본 뚜껑에서 분리 됩니다 dewar 따라서 액체 질소에 노출 및 샘플 체인저 로봇에 액세스할 수.
- 크리스탈 특성화
참고: 실험실 X-ray 소스를 사용 하 여 회절 품질 또는 싱크 로트 론 방사선 (SR) x 선 소스에서 수확된 결정 상영 다음 수 있습니다. 고분자 결정학 (MX) beamlines 변칙 회절 구조 솔루션에 대 한 악용을 가변 에너지 소스를 제공 합니다. 다음 섹션에서 일련의 다이아몬드 빛 소스 MX beamlines의 실험적인 기능에 맞춰 작업 지시를 제안 하지만이 지침 또한 전세계 다른 synchrotrons에서 MX beamlines를 적용할 수 있습니다.- 첫 번째 단계로 서, 그것은 확인 하거나 비정상적인 scatterers 결정에서 식별 하는 데 유용. 이 결정에서 x 선 형광 스펙트럼을 측정 하 여 편리 하 게 구현할 수 있습니다. 먼저 x 선 에너지는 beamline의 고분자 결정을 위해 일반적으로 예상 하는 모든 요소를 자극을 충분히 높게 설정 되어 보장 (14 케빈 또는 더 높은).
- Beamline 제어 소프트웨어를 사용 하 여 샘플 체인저 로봇에 의해 탑재 될 샘플 선택; 루프 자동으로 x-선 빔에서의 중심으로 될 것입니다 및 beamline 제어 소프트웨어를 사용 하 여 수동으로으로 크리스탈을 중심으로 확인 될 수 있다.
- Beamline 제어 소프트웨어를 사용 하 여 x 선 형광 스펙트럼 기록: 사용자는 노출 시간을 선택 하 고 측정을 시작 (형광/형광 스펙트럼 설정, → 실행, 그림 2A). Beamline 제어 소프트웨어는 자동으로 x-선 형광 검출기에 놓고 최소 사건 형광 검출기에 읽을 수 있는 신호를 x-선 플럭스를 결정을 배치 합니다. 인수 스펙트럼 다음 방출 봉우리 장착 자연스럽 게 발생 하는 자동화 된 방식 분석 생물 학적 요소. 이러한 루틴 beamline 제어 소프트웨어 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)-GDA (www.opengda.org) 우리 회사에서 하 고 유럽 41 , 42에 걸쳐 synchrotrons에서 내에서 사용할 수 있습니다.
- 적당 한 요소는 식별 하는 변칙 회절 실험을 위해 악용 될 수, 크리스탈에서 변칙 회절 데이터 수집에 대 한 최적의 파장을 결정 하는 x 선 흡수 지 에너지 스캔을 수행:는 beamline에 제어 소프트웨어 요소를 선택 하 고 스캔을 시작할 (형광/형광 스캔 설정, → 원자 이름, → 실행, 그림 2B).
참고: 단일 변칙 회절 실험에 대 한 흡수의 피크 변칙 분산을 최대화 하기 위해 사용 됩니다. 다중 파장 변칙 회절 실험을 수행 하기 위한 실험 고려 사항 이전 자세한 43 되었습니다. - 수정 같은 단위 세포 매개 변수, 대칭, 회절 한계를 결정 하는 45 ° 간격으로 발진 메서드를 사용 하 여 3 x 선 회절 패턴 측정 (데이터 수집/심사 → 현재, 실행 그림 2C). Beamline 제어 소프트웨어 진동 각도 및 노출 시간, 그리고 엑스레이 광속의 비율 전송 설정 하는 기능을 가진 사용자를 제공 합니다. 표준 크리스탈 심사 0.5 °, 0.5 s, 및 5 %x 선 빔 전송의 노출 시간의 진동 각을 사용 하는 것이 좋습니다. 측정 된 회절 이미지 에드나 파이프라인에 의해 자동으로 분석 하 고 완전 한 데이터 세트 22의 컬렉션에 대 한 전략의 집합을 반환할.
- 데이터 수집 x 선
참고: 사용자는 표준 진동 모드 또는 시간 및 엑스레이 복용량, 약 같은 흡수 동작에 가까운 기록 Friedel 동료 수 역 빔 모드에서 데이터를 수집 하도록 선택할 수 변칙 차이의 더 정확한 측정을 허용합니다. 후자는 유용 특히 경우 작은 변칙 차이가 예상 된다 샘플은 방사선에 민감한 변칙 회절 실험을 수행 하는 경우. 사용 하 여 최고의 데이터 수집 전략에 고려 되어 종합적 검토 22 , 23 , , 44 45 , 46 , 47.- beamline 제어 소프트웨어를 사용 하 여 가져올 데이터 컬렉션 매개 변수를 제공할 것입니다 전략 프로그램에 의해 제안:
ω-회전 축의 i. 시작 위치
ii. Ω-축 회전의 진동 폭 각 회절 이미지 각도
iii. 각각의 회절 이미지에 대 한 노출 시간
iv. (직접 정의 하지 전체 데이터 컬렉션에 대 한 총 ω-축 회전 각도)는 완전 한 데이터 집합에 대 한 이미지의 수
노출 및 방사선 손상을 피하기 위하여 엑스레이 광속의 감쇄의 비율 대
참고: 우리의 기관에 대 한 실행 데이터 수집, 수집 된 데이터의 자동된 처리를 위해 소프트웨어 파이프라인은 잘 설립: (i)는 회절 데이터 (색인, 통합, 및 축소) 감소는 사용자에 대 한 반사 mtz 파일을 생성 하는 xia2 파이프라인 단계적으로 조정 및 구조 솔루션/구체화 48에 대 한 입력으로. (단계적으로 ii) 때 중요 한 변칙 신호 동안 감지 되 면 데이터 분석, 실험에 의해 무거운 원자 구조를 해결 하기 위해 시도 하는 SHELX를 사용 하 여 첫 번째 빠른 자동화 된 구조 솔루션 파이프라인 (fast_ep), 단계별된 전자 밀도 지도 제공 하 어디로 실현. 두 번째 더 포괄적인 구조 솔루션 파이프라인 자동으로 수행 하는 시도 해결 하 고는 structu 구축독립 소프트웨어 스위트 49 , 50 , , 51 52;를 사용 하 여 다시 이것이 성공 하는 경우에 사용자는 초기 모델 및 전자 밀도 지도 함께 제공 됩니다. 이 수정 완료 선택의 결정학 소프트웨어 스위트와 모델의 유효성을 검사 하는 사용자에 대 한 기초를 제공 합니다.
- beamline 제어 소프트웨어를 사용 하 여 가져올 데이터 컬렉션 매개 변수를 제공할 것입니다 전략 프로그램에 의해 제안:
Representative Results
이 통합된 프로토콜 4 성공 하려면 입증 되었습니다 (2 출판 및 두 구조 되지 않은) 6 탄수화물의32,53날짜 분석 렴에서 단백질 표적을 바인딩. 이 섹션에서 우리는 일반적으로 SBPs의 구조 연구 안내 대표 결과적으로 SP0092의 생화학 및 구조 특성화 제시.
순화 된 단백질 열 교대 분석 실험을 사용 하 여 버퍼 안정성에 대 한 분석 SBP SP0092을 표현 하 고 정의 된 이전32정화, 후: SP0092 전시 증가 Tm pH 6.5에서와 NaCl의 0-0.2 M 농도 범위 (그림 3A)입니다. 이 비추어 다음 단계에 대 한 버퍼 솔루션으로 정의 되었다: 0.02 M MES pH 6.5, 0.2 M NaCl, 2.5% (v/v) 글리세롤, 0.5 m m TCEP. SP0092의 다른 oligomerization의 절대 분자량 MALS 해당 tetrameric, trimeric, dimeric, 단위체 종, 하 초 187.2, 140.8, 97.0, 49.4 kDa의 분자량을 측정 하는 결합에 의해 측정 되었다 (각각 그림 3B)입니다. 다른 단백질 희석에 SEC 프로필의 분석 계시는 oligomerization 증가 단백질 농도, 더 큰 올리고 높은 농도 일반적으로 사용 하는 보다 더 안정 된 것에 의해 트리거되는 결정 화입니다. 실제로, 성공적으로 생산된 단백질 결정 종 하지 않았다 하는 단위체를 동안 정화 큰 oligomeric 종 결정 화 실험을 감독.
네이티브에서 얻은 최적화 된 결정 및 Se-메티오닌 SP0092 형태의 분류 x 선 회절 특징 이었다. 이 결정에서 x 선 형광 측정 Zn Se 예상 대로 Se-메티오닌 결정에 대해서만 감지 하는 동안 단백질, 구속 되 고에 대 한 방출 봉우리를 두 경우에 밝혔다. 나중에, Se와 Zn 가장자리 엑스레이 흡수 검사 수행, Zn 또는 Se의 각각 x-선 흡수 가장자리를 입사 x 선 파장을 조정 직접 실험 데이터에 비정상적인 신호를 최대화 하기 위해 결정 제시 제공 결과 데이터 (그림 4A-B)에서 설정할 수 있습니다.
낮은 전송에 3 개의 회절 패턴 측정 후 완전 한 비정상적인 데이터 세트는 에드나 (그림 4C)에 의해 제안 데이터 수집 전략을 사용 하 여 얻은 했다. 현재 비정상적인 신호 트리거 하위 구조를 결정 하 beamline에 자동된 위상 파이프라인 및 파생 초기 실험 단계에 따라, 생산 초기 지도 및 세련 되 고 확인 수 있는 모델 (그림 4D ).
요약 하자면, 기술의 잠재적인 함정은 중심 주로 크리스탈 가용성 및 품질. 솔루션에서 하나 이상의 올리고 머 식별 됩니다 때 사용할 단백질의 가장 적합 한 oligomeric 상태의 식별 뿐만 아니라 단백질 안정성 향상을 위해 버퍼 조건의 최적화 결정에서 실패의 위험을 줄일 수 있습니다. 무대입니다. 초기 단계에서 식별 된 바인딩된 금속 이온의 사용 악용 구조 솔루션을 빠르게 하 고 분자 교체 방법이 실패 하는 경우 단백질을 표시 하는 selenomethionine의 불필요 한 생산을 방지 수 있습니다.
그림 1입니다. 탄수화물 SBPs의 생 화 학적 및 구조적 특성에 대 한 워크플로 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. GDA에서 크리스탈 특성. (A) GDA beamline 제어 소프트웨어의 x 선 형광 제어 탭의 스크린샷. (B) GDA에서 x 선 에너지 지 스캔 제어 탭의 스크린샷. (C) GDA에서 데이터 컬렉션 크리스탈 심사 탭의 스크린샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. SP009239-491의 생 화 확 적인 특성. (A) 3D 표면 그래프 SP009239-491 의 녹는 온도 버퍼 용액의 NaCl 농도 pH의 기능으로 음모를 꾸미고. (B) SEC 그리고 MALS SP009239-491에 대 한 결과. 280에서 흡수 nm는 파란색으로 표시 됩니다. 다른 oligomerization의 어 금 니 질량은 빨간색으로 표시 됩니다. 패널 (B)32에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. SP009239-491의 구조상 특성. (A)와 (B) x 선 흡수 에너지 SP009239-491 결정에 대 한 Zn와 Se 지 스캔. Zn와 Se를 포함 하는 결정에서 측정 된 형광 블루, 청록색, 계산 된 f 에서처럼 '와 f "변칙 분산 분수는 녹색 및 빨강, 각각. X 선 회절 패턴의 (C) 예 SP009239-491 결정에서 수집. (D) SP009239-491 이합체 구조 표현의 만화. 한 protomer 흰색 다른 마젠타 (잔류물 39-366)과 바이올렛 (잔류물 367-491), 이며 변칙 분산 원자는 Zn와 Se, 각각 파란색과 청록색 볼으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 0.1 M 구 연산 산 성 pH 4.0 | 0.1 M 구 연산 산 성 pH 4.5 | 0.1 M 인산 염 pH 5.0 | 0.1 M 구 연산 pH 5.5 | 0.1 M 두번째-트리 스 pH 6 | 0.1 M 이다 pH 6.5 | 0.1 M MOPS pH 7 | 0.1 M HEPES pH 7.5 | 0.1 M 이미 pH 8.0 | 0.1 M Tris pH 8.5 | 0.1 M CHES pH 9 | 0.1 M CHES pH 9.5 | |
| NaCl 0 M | 40 Μ | 40 Μ | 40 Μ | 40 Μ | 40 Μ | 40 Μ | 40 Μ | 40 Μ | 40 Μ |
표 1입니다. 버퍼 열 교대 분석 실험에 대 한 구성입니다.
Discussion
이 문서에서 설명 하 고 미 균에서 단백질에 특정 한 강조와 함께 SBPs 탄수화물의 생화학 및 구조 특성 분석을 위한 통합된 프로토콜 유효성 검사. 그럼에도 불구 하 고,이 다른 유기 체에서 다른 SBPs와도 다른 관련이 없는 수용 성 단백질의 분석에 대 한 표준 절차로 사용할 수 있습니다.
프로토콜의 첫 번째 부분은 단백질 안정성과 제 사기 구조, 결정 화 단백질 샘플 준비에서 개발 될 수 있는 생 화 확 적인 정보 제공에 집중 된다. 열 변화 분석 섹션에서 우리는 pH 및이 절차의 일반적인 특성을 유지 하기 위해 NaCl 농도 변화를 설명 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 다른 많은 버퍼 조건 시험 될 수 있다 유사한 방식으로, 예를 들어 안정화 첨가제로 사용 하는 모든 화합물을 포함 하 여: 특히 특정 SBP 바인딩할 실제 ligand(s)는 T증가에 현저 하 게 효과가 m 몇 섭씨31여. 경우에 따라 변성 커브는 낮은 신호 또는 단백질 집계 또는 부분 전개에 의해 발생 한 높은 형광 배경 제대로 정의할 수 있습니다. 이 방지 하려면 단백질: 염료 적정 불분명 변성 곡선 최적화를 수행할 수 있습니다. 개선을 가져온 경우 단백질의 안정성을 개량 할 수 있는 다양 한 첨가제를 심사, 권고 그리고 적당 한 화면 앞에서 설명한54되었습니다.
일반적으로, 대부분의 SBPs는 그들의 자연 환경에서 단위체 이지만 다음과 같이 multimerization 결정 화 실험에 사용 하는 높은 농도에서 발생할 수 있습니다, 따라서 MALS 및 SEC에 의해 제공 된 oligomerization 동작 특성 결정 화에 대 한 가장 유리한 안정 단 분산 oligomerization 상태를 평가 하기 위해 필수. 그럼에도 불구 하 고, 단백질의 oligomerization 행동에 결정 화 조건에 포함 하는 다른 화학 물질의 효과 예측 하기 어렵다. 경우 SEC 그리고 MALS 시험 단백질 샘플의 광범위 한 집합, 우리이 발생의 가능성을 줄이기 위해 다음을 권합니다: 신선한 단백질 샘플 (하지 동결-해 동)을 사용 하 고 열을 사용 하 여 수행 안정화 분석을 확장 분석 실험, 테스트 가능한 첨가제 및 온화한 세제 집계를 최소화 하기 위해 마지막 자원으로 이동 합니다. 이 문서에서 우리는이 프로토콜의 일반적인 특성을 유지 하기 위해 높은 처리량 스파스 매트릭스 상업 결정 심사를 사용 하 여 결정 화에 대 한 기본 지침 제시. 그러나, precipitant 농도, pH, 온도, 화학 첨가물의 추가 결정 화 조건 최적화를 반복 미세 조정 해야 할 수 있습니다 고해상도 x 선 회절 단백질 결정을 취득 하 고 다른 크리스탈 드롭 및 저수지16,17사이 변화 평형 역학 요인.
프로토콜의 두 번째 부분에서는 슬픈 단계적에 대 한 비정상적인 데이터의 취득에 특정 초점 x 선 회절 데이터 컬렉션에 대 한 최적의 전략을 정의 하는 데 단백질 결정의 특성을 설명 합니다. 경우에 비슷한 일반 아키텍처를 유지 하는 SBPs (많은 예금 된 3 차원 구조 모델을 시작으로 잠재적으로 사용할 수 있다), 이러한 단백질의 분자 교체 방법으로 단계적으로 아니다 항상 간단의 다양성 때문에 이차 구조 요소와 이러한 단백질의 본질적인 유연성. 따라서, 우리 슬픈 메서드를 제안 하 고이 단백질 수 있습니다 이미 본질적으로 바인딩한 금속 또는 금속의 실제로 일반적인 바인딩으로 변칙 diffracting 요소의 범위를 제공할 수 있는 결정 화 버퍼 조건에서 그 강조는 우리의 일반적인 프로토콜 표준 단계입니다.
결론적으로,이 프로토콜 사용 결정 구조 성공률 증가 가속을 악용 될 수 있는 SBPs의 생화학 및 구조 기능 자세한 설명 하는 절차의 표준 가이드 워크플로 정의 일반적으로 SBPs의 구조 특성입니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 복제, 초 쇼핑몰과 I03 및 다이아몬드 광원에서 I04 beamlines의 과학자에 대 한 싹 해리스에 OPPF-영국을 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SelenoMethionine Medium Complete | Molecular Dimensions | MD12-500 | Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies. |
| MicroAmp Optical 96-Well plate | Applied Biosystems | 4306737 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| SYPRO Orange | Molecular Probes | S6651 | SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions. |
| MicroAmp Optical Adhesive film | Applied Biosystems | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background. |
| 7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4362143 | The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software. |
| Superdex 200 increase 10/300 GL column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques. |
| DAWN HELEOS II | Wyatt | DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided. | |
| Superdex 200 5/150 GL | GE Healthcare | 28906561 | Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the "increase" version but this model is ideal for the standard day by day use. |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography. |
| 24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate | MiTeGen | XQ-P-24S-A | The 24 well "big" crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips. |
| PCT Pre-Crystallization Test | Hampton | HR2-140 | The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening. |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 6098xx | Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult. |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA) |
| Standard Foam Dewar | Molecular Dimensions | MD7-35 | 5.7" diameter by 2.8" deep. 800mL capacity. |
| Mounted CryoLoop - 20 micron | Hampton | HR4-955 | Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes™ that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools. |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part. |
References
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