É apresentado um protocolo simplificado para realizar uma extensa Caracterização bioquímica e estrutural de uma proteína de ligação do substrato de hidrato de carbono do Streptococcus pneumoniae .
Desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos e de vacinas para Streptococcus pneumoniae (pneumococo) são necessárias para deter a ascensão rápida em cepas resistentes de múltiplas. Proteínas de ligação de substrato de carboidratos (a) representam metas viáveis para o desenvolvimento de vacinas à base de proteínas e novos agentes antimicrobianos devido à sua localização extracelular e a centralidade da importação de hidrato de carbono para o metabolismo pneumocócica, respectivamente. Descrito aqui é um protocolo integrado Racionalizado para realizar uma caracterização abrangente de SP0092, que pode ser estendido para outros hidratos de carbono a partir do pneumococo e outras bactérias. Este procedimento pode ajudar o design baseado em estrutura de inibidores para esta classe de proteínas. Apresentado na primeira parte deste manuscrito são protocolos para análise bioquímica, por meio de ensaio térmico turno, multi ângulo de espalhamento de luz (MALS) e cromatografia de exclusão (SEC), do tamanho que otimizam a estabilidade e homogeneidade da amostra direcionado para ensaios de cristalização e assim aumentar a probabilidade de sucesso. A segunda parte deste procedimento descreve a caracterização dos cristais SBP usando uma trajetória de síncrotron de difração anômala ajustáveis, comprimento de onda e protocolos de coleta de dados para dados de medição que podem ser usados para resolver a proteína cristalizada estrutura.
S. pneumoniae (pneumococo) é uma bactéria Gram-positiva que residem assintomaticamente em vias aéreas superiores do trato respiratório humano com a capacidade de migrar para nichos normalmente estéril causando otite média, pneumonia, sepse, septicemia, e meningite,1,2. Além disso, a infecção pneumocócica é a principal causa de pneumonia adquirida na Comunidade, que contribui para um fardo clínico e económico mundial3,4. Cepas resistentes aos antibióticos de S. pneumoniae espalharam-se pelo globo e embora um sete-valente e a vacina conjugada de proteína pneumocócica 13-valente ajudaram a reduzem a taxa de resistência aos antimicrobianos, variedades de substituição da uso de vacina surgiram e levaram a demanda crescente de investigação para o desenvolvimento de novos tratamentos para a doença pneumocócica5,6,7,8.
O pneumococo depende de açúcares importados de host como um carbono fonte9,10; com efeito, que dedica 30% de seu maquinário de importação para o transporte de carboidratos diferentes 3211,12,13. Estes importadores incluem pelo menos oito transportadores ABC13. Em transportadores ABC, a extracelular a desempenhar um papel fundamental na determinação da especificidade para o ligante e apresentá-lo para o transportador de integral de membrana para a absorção na célula. A representa os alvos válidos para a concepção de novas vacinas e antimicrobianos porque eles são proteínas de superfície e seu papel vital em processos celulares.
Caracterização de proteína alvo e descrição detalhada das características estruturais, como ligante bolsos e flexibilidade entre domínios, fornecem uma ferramenta útil para desenho de drogas baseada em estrutura14,15. Cristalografia de raios x é o método de escolha para a caracterização estrutural de proteínas em perto de resolução atômica, mas o processo de cristalização é imprevisível, demorado e não sempre bem sucedido. Métodos sistemáticos têm melhorado a taxa de sucesso e fatores importantes são a qualidade da amostra e a estabilidade. A taxa de sucesso de cristalização é influenciada pelas propriedades químicas de proteína e metodologia de preparação de amostra. O efeito destes pode ser avaliado e informado pela caracterização bioquímica16,17.
Uma outra complicação para design baseado em estrutura é o problema de fase cristalográfica, que deve ser abordado. Como estruturas de proteína mais se tornaram disponíveis, muitas estruturas podem ser resolvidas pelo método de substituição molecular, que exige uma estrutura homóloga18. Como a apresenta uma estrutura de domínio flexível, substituição molecular também pode revelar-se desafiador19. Se um modelo estrutural que é suficientemente semelhante à proteína alvo não estiver disponível, um número de técnicas pode ser usado para obter a progressiva experimental20. Entre estes, o método de dispersão anômala Single-comprimento de onda (SAD) surgiu como a principal técnica e tem sido extensivamente usado para resolver o problema de fase21. O uso do método triste tem sido ainda mais avançado com melhorias em hardware e software, bem como estratégias de coleta de dados para permitir a detecção e o uso de sinais fracos de anômalos para eliminação gradual de22,23, 24. Além disso, avanços em métodos diretos para solução de estruturas de macromoléculas, que, no passado, necessários dados de difração de resolução atômica, agora pode ser utilizado, por exemplo, combinando conhecimento estereoquímica conforme implementado no programa ARCIMOLDO25. Um recurso útil de métodos para resolver o problema da fase em cristalografia é dada por Taylor26.
Aqui nós apresentamos um protocolo Racionalizado para a caracterização do transporte de carboidratos SBP, SP0092 de S. pneumoniae, integrar técnicas bioquímicas e estruturais (Figura 1). Este protocolo passo a passo fornece um exemplo útil caso de teste de estratégias para melhorar a taxa de sucesso de estudos estruturais na apresentação, em geral, que são encontrados em todos os reinos da vida. Em particular, o protocolo destaca a importância de caracterizar o estado oligoméricos mais estável da proteína em solução em um método rápido e eficaz e permite a identificação das melhores espécies para acompanhar para experimentos de cristalização. Embora existam mais de 500 estruturas SBP relatadas na Protein Data Bank27, substituição molecular pode ser um desafio devido à natureza flexível inerente as dois domínios α/β, que são ligadas por uma dobradiça região19. Assim, a segunda parte do protocolo descreve como usar o método triste para eliminação de íons metálicos acoplados, que é comum na apresentação, bem como a incorporação de selenometionina e uso do selênio (Se) na fase triste.
Neste artigo, descrevemos e validar um protocolo integrado para Caracterização bioquímica e estrutural de carboidratos apresentação com uma ênfase específica em proteínas de S. pneumoniae. No entanto, isto pode ser usado como um procedimento padrão para a análise de outra a partir de organismos diferentes e até mesmo outras proteínas solúveis não relacionadas.
A primeira parte do protocolo está focada em fornecer informações bioquímicas na estabilidade da proteína e estrutura quaternária, que pode ser explorada na preparação de amostras da proteína para cristalização. Na seção ensaios térmicos turno, descrevemos apenas o pH e as variações de concentração de NaCl para manter a natureza geral deste procedimento. Apesar disso, muitas outras condições do tampão podem ser testadas de forma semelhante, por exemplo, incluindo qualquer composto químico utilizado como aditivo estabilizador: em particular, a ligand(s) real que ligam para um específico SBP é notavelmente eficaz em aumentar a Tm por alguns graus Celsius31. Em alguns casos, as curvas de desnaturação podem ser mal definidas devido ao baixo sinal ou um fundo de fluorescência de alta, que é causado pela agregação de proteínas ou desdobramento parcial. Para evitar isso, uma titulação de proteína: tintura pode ser realizada para otimizar as curvas de desnaturação pouco claras. Se nenhuma melhoria é obtida, triagem de vários aditivos que podem melhorar a estabilidade da proteína é aconselhável, e telas adequadas tem sido descrito anteriormente54.
Normalmente, a maioria é monomérica em seu ambiente natural, mas como mostrado aqui multimerization pode ocorrer nas altas concentrações utilizadas em experimentos de cristalização, assim é a caracterização do comportamento de oligomerização fornecida por MALS e SEC essencial para avaliar o estado de oligomerização monodisperso estável mais favorável para a cristalização. No entanto, é difícil prever o efeito de diferentes produtos químicos incluídos na condição de cristalização no comportamento de oligomerização das proteínas. Se o exame da SEC e MALS mostra extensa agregação da amostra da proteína, recomendamos o seguinte para reduzir a probabilidade disso acontecer: usar amostra de proteína fresca (não congelar-descongelada) e expandir a análise de estabilização realizada com térmico ensaios, testes possíveis aditivos e detergentes suaves como um último recurso, para minimizar a agregação de turno. Neste trabalho, apresentamos as diretrizes básicas para cristalização com rastreio de cristalização comercial de matriz esparsa de alta produtividade para manter a natureza geral do presente protocolo. No entanto, a obtenção de cristais de proteína de difração de raios x de alta resolução pode precisar iterativo de ajuste fino para otimizar as condições de cristalização em relação a concentração precipitant, pH, adição de aditivos químicos, temperaturas diferentes, e outros fatores de mudança dinâmica de equilíbrio entre o cristal gota e reservatório16,17.
A segunda parte do protocolo descreve a caracterização os cristais de proteínas a fim de definir a melhor estratégia para coleta de dados de difração de raios x com um foco específico sobre a aquisição de dados anômalos para fase triste. Mesmo se a manter uma arquitetura geral semelhante (e existem muitas estruturas 3D depositadas potencialmente utilizável como modelos de partida), eliminação destas proteínas pelo método de substituição molecular não é sempre simples por causa da variabilidade do elementos de estrutura secundária e a flexibilidade intrínseca destas proteínas. Assim, propomos o método triste e destacar que estas proteínas podem já ter intrinsecamente ligado metais ou fato inespecificas de metais das condições de reserva de cristalização, que podem fornecer uma gama de elementos diffracting anômalas como um passo padrão em nosso protocolo geral.
Em conclusão, este protocolo define um padrão de fluxo de trabalho guiado de procedimentos que permitam a descrição detalhada das características bioquímicas e estruturais que pode ser explorada para aumentar a taxa de sucesso de determinação de estrutura, bem como acelerar a caracterização estrutural de apresentação em geral.
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos a OPPF-UK para assistência em clonagem, Gemma Harris para SEC-shoppings e os cientistas de luz síncroton I03 e I04 na fonte de luz de diamante.
SelenoMethionine Medium Complete | Molecular Dimensions | MD12-500 | Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies. |
MicroAmp Optical 96-Well plate | Applied Biosystems | 4306737 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
SYPRO Orange | Molecular Probes | S6651 | SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions. |
MicroAmp Optical Adhesive film | Applied Biosystems | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background. |
7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4362143 | The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software. |
Superdex 200 increase 10/300 GL column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques. |
DAWN HELEOS II | Wyatt | DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided. | |
Superdex 200 5/150 GL | GE Healthcare | 28906561 | Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the "increase" version but this model is ideal for the standard day by day use. |
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography. |
24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate | MiTeGen | XQ-P-24S-A | The 24 well "big" crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips. |
PCT Pre-Crystallization Test | Hampton | HR2-140 | The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening. |
96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 6098xx | Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult. |
Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide – includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA) |
Standard Foam Dewar | Molecular Dimensions | MD7-35 | 5.7" diameter by 2.8" deep. 800mL capacity. |
Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton | HR4-955 | Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes™ that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools. |
CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part. |