がん治療への抵抗は、病気の進行と死亡に貢献します。抵抗性のメカニズムの基盤を決定する治療応答の改善に不可欠です。この原稿の詳細 PC 患者におけるドセタキセル抵抗への進行に関与する経路を解剖するため (PC) 前立腺癌のタキサン耐性細胞モデルを生成するプロトコル。
微小管ターゲット エージェント (Mta) は、腫瘍の広い範囲の治療の主力です。しかし、薬剤抵抗性獲得は、病気の進行の一般的な機構と悪性腫瘍の予後決定因子の機能です。前立腺癌 (PC)、Mta にタキサン ドセタキセルなどの抵抗が予後不良と高い死亡率率によって定義される病気の致命的な段階の方の進行と同様、治療の失敗に影響を与えます。何十年も学び、獲得抵抗性に貢献するメカニズムの配列完全に理解されていない、従ってこれらの進行した段階の患者に恩恵を受けることができる新しい治療上の作戦の開発に重大な制約をもたらす病気。末期前立腺がんの致命的な特徴を模倣し、ため、メカニズムを研究することができますドセタキセル耐性前立腺癌細胞の生成について述べるこのプロトコルで取得する抗癌剤によって発生します。潜在的な制限はありますが、時間をかけて抵抗特性の損失に基づくセルのモデルに組み込みドセタキセル耐性細胞株がこのメソッドによって作成された最近の研究で使用されているし、を進める機会を提供私たち致命的な前立腺癌で取得した抗癌剤の分子的理解。
細胞周期制御の損失によって引き起こされる増殖の増加率は、がん1の特徴です。この機能のプロパティをレンダリングします癌細胞細胞周期の主要なプロセスを忠実に一意に依存して中に S と M-相、様々 な細胞周期 DNA 損傷や細胞分裂の欠陥を誘発する薬を摂動の発展につながっています。従来の微小管ターゲット エージェント (Mta) が唯一の臨床的に承認された方法であり続ける分裂期キナーゼまたはモーター蛋白質の阻害剤のような多数の抗有糸分裂エージェントが現在開発中とテストの臨床試験、がん2,3,4の有糸分裂を対象とします。Mta はどちらか不安定 (ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン) または (タキサン派生剤パクリタ キセル、ドセタキセルまたはカバジタ キセル) 微小管を安定化および機能有糸分裂紡錘体5,6の形成を防ぐ。これらのエージェントは、紡錘アセンブリ チェックポイント7,8、長引く分裂逮捕および培養細胞9,10の最終的な細胞死と細胞分裂腫瘍11 欠陥で起因するトリガーします。 ,12と前立腺癌13多種多様なそれらの間の癌の治療に有用。
前立腺癌は最も頻繁に診断されるがんとがんの主要な原因関連の男性14人が死亡。ドセタキセルなど体エージェントは、前立腺がん患者の生存率を改善し、この病15,16,17の治療の主力は。残念ながら、初期腫瘍収縮にもかかわらず腫瘍細胞はしばしば治療中に薬剤耐性を開発します。いくつかの細胞メカニズムをアポトーシスと炎症性経路の規制緩和や ATP 結合カセット運送者のような薬剤の流出ポンプの活性化/過剰発現を含む抗癌剤の開発の原因に関与しています。P 糖タンパク質 (P ・ gp/ABCB1)、後者の場合、結果セル18,19の化学療法剤の輸出。タキサン系薬剤への抵抗は、チューブリンのアイソタイプやチューブリン変異は、薬剤とそのターゲット20,21間の相互作用を防ぐための表現の変更など、他の原因でリンクされています。さらに、抵抗は、ゲノム不安定性の蓄積と腫瘍の不均一性22,23に関連しています。ただし、タキサン抵抗のメカニズム完全に理解されない、明らかであるその外観を防ぐ治療戦略の不在によって。したがって、これらのメカニズムの解剖で支援実験モデルを生成し、これらの薬剤に抵抗性の発達を防ぐため新規の治療法を識別するために緊急の必要性があります。
この記事では前立腺癌細胞ドセタキセル耐性 (DR) の生成を可能にする方法をについて説明します。我々 はさらに、これらの細胞のコロニー形成アッセイおよび定量的 RT-PCR を用いた抵抗状態を検証する方法を説明します。このメソッドによって生成される細胞さた公開ひと腫瘍サンプル データベースに対してさまざまな実験的アッセイを実行する汎用性を提供する付加的な利点は、分子機能の多くの利点があります。腫瘍のサンプルで許可されているよりも時間の長い期間。療法の抵抗のこれらの癌モデルことができます多くの週の組織培養とその他のアプローチの間で展開される、遺伝子操作、顕微鏡法による可視化および分析できる遺伝子発現の。さらに、腫瘍形成と成長の生体内での効果をさらに分析するためにマウスで xenotrasplanted をすることができます彼ら。現在、前立腺癌の薬剤耐性を検討する主な方法は、腫瘍のサンプルの直接分析です。これらのサンプルは、遺伝子発現および特定の腫瘍の突然変異の状態に関する情報を収集するために非常に強力なシステムを提示、それらへのアクセスは非常に限られていることができます、彼らはさらに操作の実験的分析を維持することは困難でこのプロトコル24,25生成細胞を簡単に実行できます。重要なは、今後、代替アプローチなど患者から直接人間の派生オルガノイドの生成は、非常に強力なツールと現在法26,27に代替。どのような腫瘍が、元の環境で 3 D コンテキストで要約するが、ので organoids は細胞とひと腫瘍の完全なモデルになります。しかし、このプロトコルで記述した実験細胞モデルはまだ維持するために手頃な価格で高速な解析に適した。これらの細胞株を勉強して得た結果に外挿する、人間のサンプルや 3 D 文化の裏付け。したがって、このプロトコルは私達のプロトコルは、他の薬とがんの種類の研究に合わせることができるのですべてのセル行の抗癌剤メカニズムを研究に研究を細胞モデルを求めての関心の可能性があります。ここで説明する方法があらゆる研究室は、手頃な価格で適用し、薬剤耐性の分子・細胞メカニズムについての予備研究を許可する.
本稿では、抗癌剤表現の習得のメカニズムの研究ができるドセタキセル耐性前立腺癌細胞モデル システムを生成する手法について述べる。このアプローチには、高い信頼性と再現性ですが、いくつかの潜在的な制限を考慮されなければなりません。以来だけでセルの一括人口のごく一部は、抗癌剤28出展、細胞の大規模な人口を持つ開始勧め (我々 は通常約 1.2 × 10 を占める 150 cm2、20 のフラスコをプレート8細胞)。プロトコルの主要な手順は、プロシージャの成功のために考慮されなければなりません。最初に、長期にわたって使用 (-80 ° c に正しく格納するとき年因数を用することができます 10 mM 在庫) の株式が作りたて同じドセタキセルを使用する非常に重要です。因数のドセタキセルのわずかな変化は IC50 のセル行タイミングの生成結果とコロニー形成結果に影響します。第二に、以来、バリエーションは、細胞の新しいバッチを使用する場合に発生することが個々 のセル各行の IC50 を決定するプロトコルを起動することが重要です。第三に、監視、エラーを迅速に検出して修正できるように、顕微鏡下で細胞を頻繁にチェックして、薬物治療が有効であることが不可欠です。最後に、常に汚染やプロトコルの途中で細胞の生存率に影響を与える可能性があります予期しない問題の場合中間段階の在庫を保つことをお勧めします。重要なは、我々 のプロトコルは高用量ドセタキセルの 72 h 最高を模倣する試みで薬の濃度一定ではなく、長い回復期間が続くために前立腺がんの細胞をさらすことによって薬剤耐性のモデルを生成することを目的と臨床このタキサン エージェント15,16前立腺癌治療のためにシナリオが報告されました。
さらに、薬剤耐性細胞が時間をかけて取得した耐熱性の進歩的な損失につながる可能性があります高い可塑性を示すことに注意してください。したがって、これらの細胞の文化 2-3 ヶ月以上の使用を拡張するはお勧めしません。恒久的な供給が必要な場合それは継続的に抵抗力がある細胞の新しいバッチを生成することをお勧めします。ただし、長時間細胞のバッチ培養される場合コロニー形成法と qPCR 使用できます彼らの抵抗を再評価します。別の方法としては、72 h (500-1,000 nM) のドセタキセルの高用量とセルを扱うことによって衰退の抵抗を高めるためです。1 〜 2 週間の回復期間後、表現型再テストできます qPCR とコロニー形成によって試金。(FBS、10 %dmso) で液体窒素に扱われた細胞の因数を格納する推奨されませんにも可能、です。凍結融解サイクル後抗癌剤の表現常に評価すべき再と上記の方法に注意してください。
これらの警告にもかかわらず我々28,29など30,31,32,33正常に主小説細胞を識別するためにこれらのモデル システムを採用することができたと腫瘍開始容量、細胞の存続およびドセタキセル耐性細胞における積極性に結びつく分子メカニズムが昇格。これら癌細胞モデル システムを使用して、その細胞の上皮、前立腺関連の分化マーカーの有無と対象の過剰発現の発達によって特徴付けられる、画一的な表現型を示すがわかりました (ノッチとハリネズミ) シグナル伝達経路は、化学療法の露出28 を生き残る。2 番目の研究では、公開されている患者の遺伝子データ セット24,25、一緒にこれらのモデルを使用して我々 を発見、先駆的転写因子 GATA2 非常において過剰発現転移性去勢抵抗性化学療法抵抗性の前立腺癌細胞。GATA2 直接シグナリング ネットワーク29IGF2 依存型の下流のキナーゼを活性化によって細胞の生存を増加します。特に、これらの研究は高度な転移性前立腺癌攻撃34GATA2 の新規のキーの役割を識別するを助けた。
薬剤耐性の開発は、ドセタキセルと前立腺がんに限定されない問題はがん化学療法薬の広い配列で処理の他の多くの種類の間で流行。確かに、実験的なモデルの可用性に同様の制限が適用されます、我々 のプロトコルは、他のがんの種類とそれぞれの抗癌剤メカニズムを研究に適応できると考えられる。
このプロトコルで記述としてドセタキセル耐性の細胞の生成は、抗癌剤の新規関連分子 · 細胞メカニズムを識別するために機能的なツールとして使用できます。これは、極めて悪性の前立腺がんの新しい治療法の開発が明確に、この病気について知っていることとどのように我々 の治療の境界を押してもう一度、新たな目標を見つけることへの扉を開きます。
The authors have nothing to disclose.
V.R. B米国保健省から資金を受け取る & 人間サービス、NIH、国立癌研究所許可番号 1 K22 CA207458-01 と j. d. d.米国保健省から資金を受け取る & 人間サービス、NIH、国立癌研究所許可番号 1 R01 CA207311-01。
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |