المقاومة لعلاجات السرطان يسهم في تطور المرض والموت. تحديد الأسس الميكانيكية للمقاومة أمر حاسم لتحسين الاستجابة العلاجية. تفاصيل المخطوطة هذا البروتوكول لتوليد نماذج خلية تشن مقاومة سرطان البروستاتا (PC) للمساعدة في تشريح المسارات تشارك في التقدم للمقاومة دوسيتاكسيل في المرضى PC.
ميكروتوبولي استهداف عملاء (MTAs) دعامة أساسية في معالجة مجموعة واسعة من الأورام. ومع ذلك، هو المقاومة المكتسبة على أدوية العلاج الكيميائي إليه مشتركة لتطور المرض وميزة التنبؤات-العوامل المحددة للأورام الخبيثة. في سرطان البروستات (PC)، يملي المقاومة للاتفاقات التجارية المتعددة الأطراف مثل تشن دوسيتاكسيل فشل العلاج، فضلا عن التقدم نحو المراحل المميتة من المرض التي يتم تعريفها سوء تشخيص وارتفاع معدلات الوفيات. على الرغم من دراستها لعدة عقود، مجموعة الآليات التي تسهم في المقاومة المكتسبة ليست مفهومة تماما، وهكذا تشكل قيداً كبيرا على تطوير استراتيجيات علاجية جديدة يمكن أن تفيد المرضى في هذه المراحل المتقدمة المرض. في هذا البروتوكول، يصف لنا توليد دوسيتاكسيل المقاوم خطوط خلايا سرطان البروستات التي تحاكي ميزات قاتلة من سرطان البروستاتا المرحلة المتأخرة، وذلك يمكن استخدامها لدراسة الآليات التي تشيموريسيستانسي المكتسبة التي تنشأ. على الرغم من القيود المحتملة الجوهرية لخلية على أساس نموذج، مثل فقدان خصائص المقاومة مع مرور الوقت، خطوط الخلايا دوسيتاكسيل المقاوم المنتجة بهذه الطريقة قد استخدمت بنجاح في الدراسات الحديثة وتوفر فرصة للمضي قدما لدينا فهم الجزيئية تشيموريسيستانسي المكتسبة في سرطان البروستاتا المميتة.
زيادة معدل الانتشار الناجم عن فقدان السيطرة على دورة الخلية السمة مميزة للسرطان1. هذه الخاصية الوظيفية الخلايا السرطانية يجعل فريد يعتمد على الإخلاص للعمليات الرئيسية لدورة الخلية خلال S-M-مراحل و، مما أدى إلى تطوير مختلف دورة الخلية مقاومة العقاقير التي تسبب تلف الحمض النووي أو عيوب الانقسامية. على الرغم من وكلاء مكافحة الانقسامية العديد، مثل مثبطات مؤنزم الانقسامية أو السيارات والبروتينات، ويجري حاليا تطوير واختبارها في التجارب السريرية، ميكروتوبولي القديمة تستهدف وكلاء (MTAs) الاستمرار في النهج المعتمد سريرياً فقط استهداف الانقسام في سرطان2،،من34. الاتفاقات التجارية المتعددة الأطراف أما زعزعة (فينبلاستيني, فينكريستيني, فينوريلبيني) أو استقرار microtubules (المشتقة من تاكساني وكلاء باكليتاكسيل أو دوسيتاكسيل أو كابازيتاكسيل) وبالتالي منع تكوين المغزل التفتلي عاملة5،6. هذه العوامل تؤدي المغزل الجمعية حاجز7،8، مما يسفر عن اعتقال الانقسامية المطول وموت الخلايا في نهاية المطاف في الخلايا المستزرعة9،10 وعيوب الانقسامية في الأورام11 ،12 ، وهي لذلك مفيدة لعلاج مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع السرطان، منها سرطان البروستاتا13.
ومعظم الأحيان يتم تشخيص سرطان البروستاتا سرطان وسببا رئيسيا للسرطان المتعلقة بالوفيات في الرجال14. وكلاء أنتيميتوتيك مثل دوسيتاكسيل تحسين بقاء المريض سرطان البروستاتا وهي دعامة أساسية في علاج هذا المرض15،،من1617. ولسوء الحظ، وعلى الرغم من انكماش الورم الأولى، الخلايا السرطانية غالباً ما تضع مقاومة المخدرات أثناء فترة العلاج. العديد من الآليات الخلوية قد تورطت في التسبب في تنمية تشيموريسيستانسي، بما في ذلك إزالة القيود المفروضة على أبوبتوتيك ومسارات التحريضية، أو التنشيط/overexpression مضخات efflux المخدرات مثل الناقل ملزم ATP كاسيت فبروتين سكري (ف-gp/ABCB1)، هذه الأخيرة التي يؤدي تصدير وكلاء العلاج الكيميائي من أصل18،الخلايا19. كما ارتبطت المقاومة إلى تاكسانيس مع أسباب أخرى، مثل التغيرات في التعبير عن إيسوتيبيس توبولين أو الطفرات tubulin، التي تمنع التفاعل بين المخدرات ولها هدف 20،21. وعلاوة على ذلك، قد تم المتصلة بالمقاومة إلى تراكم عدم الاستقرار الجينوم والورم التغايرية22،23. ومع ذلك، آليات المساهمة في المقاومة تشن هي ليست مفهومة تماما، الذي هو واضح بسبب غياب الاستراتيجيات العلاجية التي تمنع مظهره. ولذلك، هناك حاجة ملحة لإنشاء النماذج التجريبية التي تساعد في تشريح هذه الآليات وتحديد النهج العلاجية الرواية التي تحول دون تطور المقاومة لهذه الأدوية.
في هذا المقال يصف لنا أسلوب الذي يتيح توليد دوسيتاكسيل المقاوم (DR) خلايا سرطان البروستاتا. كذلك ونحن سوف تصف كيفية التحقق من صحة حالة مقاومة هذه الخلايا باستخدام فحوصات تشكيل مستعمرة والكمية RT-PCR. الخلايا التي تنتجها هذه الطريقة لها ميزة أتصدى العديد من السمات الجزيئية في الأورام البشرية متاحة لنماذج قواعد البيانات مع فائدة إضافية تتمثل في توفير براعة لأداء مجموعة متنوعة من الاختبارات التجريبية على مدى فترات أطول مما يسمح به عينات الورم. هذه النماذج السرطان مقاومة العلاج يمكن توسيعها لعدة أسابيع في زراعة الأنسجة، وبين النهج الأخرى، يمكن وراثيا التلاعب بها، وتصور بأساليب الفحص المجهري وتحليلها للتعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون إكسينوتراسبلانتيد في الفئران لمواصلة تحليل الآثار في تشكيل ونمو الورم في فيفو. الأسلوب البديل الرئيسي لدراسة مقاومة المخدرات في سياق الإصابة بسرطان البروستات حاليا تحليل عينات الورم مباشرة. حين هذه العينات الحالي نظاما قويا جداً لجمع المعلومات حول التعبير الجيني وحيث حالة أورام معينة، يمكن الوصول إليها محدودة للغاية ومن الصعب الحفاظ على مزيد من التلاعب وتحليل تجريبي، الذي يمكن أن يتم بسهولة مع خطوط الخلايا التي تم إنشاؤها مع هذا البروتوكول24،25. الأهم من ذلك، في المستقبل، النهج البديلة مثل توليد البشرية أورجانويدس المشتقة مباشرة من المرضى أن تكون أداة قوية جداً وبديل لل26،الأسلوب الحالي27. وبما أنهم سوف الخص في سياق 3D ما ورم كان في بيئتها الأصلية، سيكون أورجانويدس النموذج المثالي بين خطوط الخلايا والأورام البشرية. حتى الآن، نماذج تجريبية الخلية المبينة في هذا البروتوكول لا يزال أكثر بأسعار معقولة للحفاظ على ومناسبة لتحليل أسرع. ويمكن استقراء للنتائج التي توصلت إليها دراسة هذه الخطوط الخلية وأيد في العينات البشرية والثقافات 3D. ولذلك، قد يكون هذا البروتوكول من اهتمام الباحثين البحث عن نماذج الخلية دراسة آليات تشيموريسيستانسي في أي خط الخلية، نظراً إلى أن البروتوكول يمكن تكييفها لدراسة العقاقير وأنواع السرطان الأخرى. الأساليب الموصوفة هنا من السهل تطبيق في أي مختبر، بأسعار معقولة والسماح للدراسات الأولية للآليات الجزيئية والخلوية للمقاومة للعقاقير.
في هذه المخطوطة، يمكننا وصف أسلوب لإنشاء نظم نموذجية خلية سرطان البروستاتا المقاوم دوسيتاكسيل يسمح لدراسة آليات تسهم في اكتساب النمط الظاهري تشيموريسيستانسي. في حين أن هذا النهج موثوق بها للغاية واستنساخه، ينبغي النظر في بعض القيود المحتملة. منذ ذلك الحين فقط سوف يحمل جزء صغير من سكان الجزء الأكبر من خلايا تشيموريسيستانسي28، من المستحسن أن تبدأ مع عدد كبير من سكان من الخلايا (نحن عادة لوحة قوارير 20 من 150 سم2، التي تستأثر بحوالي 1.2 x 108 الخلايا). الخطوات الرئيسية للبروتوكول ينبغي لضمان نجاح هذا الإجراء. أولاً، من المهم جداً استخدام دوسيتاكسيل نفس طازج المخزون لفترة طويلة الأجل الاستخدام (10 ملم الأسهم يمكن أن تستخدم مختبرين لسنوات عند تخزينها بشكل صحيح في-80 درجة مئوية). تغييرات طفيفة في دوسيتاكسيل الكوة يمكن أن تؤثر نتائج IC50، جيل من توقيت خط الخلية ونتائج تشكيل مستعمرة. وثانيا، من الأهمية بمكان لبدء تشغيل بروتوكول تحديد IC50 في كل خط الخلية الفردية، لأن الاختلافات يمكن أن تحدث عند استخدام دفعة جديدة من الخلايا. وثالثاً، من الضروري رصد أن العلاج من تعاطي المخدرات بفعالية عن طريق فحص الخلايا تحت المجهر كثيرا حتى يمكن الكشف عنها بسرعة وتصحيح أية أخطاء. وأخيراً نوصي دائماً الاحتفاظ بمخزون خطوات الوسيطة في حالة التلوث أو المشاكل غير المتوقعة التي يمكن أن تؤثر على بقاء الخلايا في منتصف البروتوكول. الأهم من ذلك، لدينا بروتوكول يهدف إلى توليد نماذج مقاومة للعقاقير وذلك بتعريض خلايا سرطان البروستاتا لجرعات عالية من دوسيتاكسيل ح 72 تليها فترات الانتعاش الطويل، بدلاً من تركيزات ثابتة أقل من المخدرات في محاولة لتقليد الأفضل السريرية وأفادت السيناريو لعلاج سرطان البروستاتا بهذا تشن عامل15،16.
بالإضافة إلى ذلك، تجدر الإشارة إلى أن المعرض خلايا مقاومة للعقاقير اللدونة عالية، مما قد يؤدي إلى خسارة تدريجي في خصائص المقاومة المكتسبة على مر الزمن. ولذلك، توسيع نطاق استخدام هذه الخلايا لأكثر من 2-3 أشهر في الثقافة غير مستحسن. إذا كانت هناك حاجة إلى إمدادات دائمة فمن المستحسن أن توليد دفعات جديدة من خلايا المقاومة بشكل مستمر. ومع ذلك، إذا كان قد تم استزراع دفعات خلايا لفترة طويلة، يمكن استخدام فحوصات تشكيل مستعمرة و qPCR لإعادة تقييم مقاومتهم. ثمة بديل آخر زيادة المقاومة تراجع في علاج الخلايا مع جرعة عالية من دوسيتاكسيل ح 72 (500-1,000 nM). بعد فترة نقاهة لمدة أسبوع أو أسبوعين، النمط الظاهري يمكن إعادة اختبارها بتشكيل قبكر ومستعمرة فحوصات. من الممكن أيضا، على الرغم من أن غير مستحسن، لتخزين مختبرين للخلايا المعالجة في النتروجين السائل (في FBS، 10% [دمس]). يرجى ملاحظة أن بعد دورة تجميد أذاب، النمط الظاهري تشيموريسيستانسي ينبغي دائماً إعادة تقييمها باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه.
وعلى الرغم من هذه المحاذير، نحن28،29 وآخرون30،31،،من3233 كانت قادرة على توظيف هذه الأنظمة النموذجية لتحديد مفتاح الرواية الخلوية بنجاح و رفع الجزيئية الآليات المؤدية إلى بدء الورم القدرة وبقاء الخلية، والعدوانية في خلايا مقاومة دوسيتاكسيل. استخدام هذه النظم النموذجية خلية السرطان، فقد اكتشفنا أن الخلايا العارضة النمط الظاهري غير متمايز، تتميز بعدم وجود علامات التمايز الظهارية والمتصلة بالبروستات و overexpression من استهدافها الإنمائية (الدرجة و القنفذ) مما يشير إلى مسارات، البقاء على قيد الحياة28من التعرض للعلاج الكيميائي. في دراسة ثانية باستخدام هذه النماذج جنبا إلى جنب مع مجموعات البيانات المتاحة للعموم الجين المريض24،25، نحن اكتشفت أن عامل النسخ الرواد GATA2 هو الغاية overexpressed في المنتشر المقاوم للخصي خلايا سرطان البروستاتا المقاوم للعلاج الكيميائي. GATA2 يزيد بقاء الخلايا بتفعيل كيناز المصب تعتمد على IGF2 إشارات الشبكة29مباشرة. جدير بالذكر أن هذه الدراسات قد ساعدت على تحديد رواية أدوار رئيسية من GATA2 في سرطان البروستاتا المنتشر متقدمة العدوانية34.
تطوير مقاومة للأدوية هي مشكلة لا تقتصر على دوسيتاكسيل وسرطان البروستاتا، كما أنه منتشر بين العديد من أنواع أخرى من السرطانات تعامل مع مجموعة واسعة من العقاقير العلاج الكيميائي. في الواقع، تطبيق قيود مماثلة على التوافر نماذج تجريبية، ويمكن تصور أن لدينا بروتوكول يمكن تكييفها لدراسة أنواع السرطان الأخرى وآلياتها تشيموريسيستانسي كل منهما.
توليد خلايا مقاومة دوسيتاكسيل كما هو موضح في هذا البروتوكول يمكن استخدامها كأداة وظيفية لتحديد الآليات الجزيئية والخلوية ذات الصلة رواية تشيموريسيستانسي. وهذا يفتح الباب لإيجاد أهداف جديدة، على أساسها قد بلورة تطوير علاجات جديدة لسرطان البروستاتا الخبيث عاليا، دفع مرة أخرى في حدود ما نعرفه عن هذا المرض وكيفية التعامل مع المرضى.
The authors have nothing to disclose.
V.R.-باء. تتلقى تمويلاً من “وزارة الصحة الأميركية” & الإنسان الخدمات، المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني للسرطان منح رقم 1 K22 CA207458-01 ودكتوراه-دال. ويتلقى تمويلاً من “وزارة الصحة الأميركية” & الإنسان الخدمات، المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني للسرطان منح رقم 1 R01 CA207311-01.
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |