암 치료에 저항을 질병의 진행 및 죽음에 기여 한다. 저항의 기계 론 적인 토대를 결정 하는 것입니다 치료 응답을 개선 하기 위한 중요 한. 이 원고 전립선 암 경로 해 부 하기 (PC)의 taxane 저항 셀 모델을 생성 하는 프로토콜 PC 환자에서 Docetaxel 저항 진행에 관련 된 세부 사항.
Microtubule 대상 에이전트 (Mta)는 다양 한 종양의 치료에 주류. 그러나, 화학요법 약물에 저항을 획득된 질병 진행의 공통 메커니즘 및 악성 종양의 전조 결정 기능 이다. 전립선 암 (PC), taxane Docetaxel 같은 Mta에 저항 치료 실패 뿐만 아니라 빈약한 예 지 및 높은 사망 율에 의해 정의 된 질병의 치명적인 단계 향해 진행을 지시 한다. 수십 년 동안 공부, 인수 저항에 기여 하는 메커니즘의 배열 완전히 이해 되지 않는다 고 따라서 이러한 고급 단계에 있는 환자를 유익할 수 있던 새로운 치료 전략의 개발에 상당한 제한이 포즈 질병입니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 단계의 전립선 암의 치명적인 기능을 모방 하는 메커니즘을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 Docetaxel 내성 전립선 암 세포 라인의 세대는 인수 chemoresistance에 의해 발생. 잠재적인 제한 시간이 지남에, 저항 속성의 손실 등 셀 기반 모델에 내장에 불구 하 고이 메서드에 의해 생성 Docetaxel 저항 셀 라인 성공적으로 최근 연구에서 사용 된 및 발전 기회를 제공 우리의 치명적인 전립선 암에 인수 chemoresistance의 분자 이해.
세포 주기 통제의 손실에 의해 발생 하는 확산의 증가 속도 암1의 특징입니다. 이 기능 속성 렌더링 암 세포 고유 셀 사이클의 주요 프로세스의 충실도에 따라 동안 S-및 M-단계는 다양 한 세포 주기 perturbing DNA 손상 또는 mitotic 결함을 유발 하는 약물의 개발을 주도하 고 있다. 비록 mitotic kinases 또는 모터 단백질의 억제제 같은 수많은 안티 mitotic 에이전트는 현재 개발 되 고 임상 시험된에서 레거시 microtubule 대상 에이전트 (Mta) 계속를 위한 유일한 임상 승인 된 접근 암2,,34유사 분열을 대상으로. Mta 중 불안정 (Vinblastine Vincristine, Vinorelbine) 또는 (taxane 파생 에이전트 Paclitaxel, Docetaxel 또는 Cabazitaxel) microtubules 안정화 및 그로 인하여 작동 mitotic 스핀 들5,6의 형성을 방지. 이 트리거는 스핀 들 어셈블리 검사점7,8, 장기간된 mitotic 체포와 배양된 세포9,10 에 최후 세포 죽음 및 종양11에에서 mitotic 결함에 결과 ,12 고 따라서 전립선 암13큰 다양 한 그들의 사이에서 암 치료에 유용.
전립선 암은 가장 자주 진단 암과 암의 주요 원인이 남자14죽음 관련. Antimitotic 에이전트 Docetaxel 등 전립선 암 환자의 생존 향상 되며이 질병15,,1617의 처리에서 주류. 불행히도, 초기 종양 수축 량에도 불구 하 고 종양 세포 치료 중 약물 저항 자주 개발. 몇 가지 세포 메커니즘 chemoresistance, apoptotic와 염증 경로, 규제 완화 등 활성화/overexpression ATP 묶는 카세트 운송업 자 같은 마약 경과 펌프의 개발 원인에 연루 되어 P-당단백질 (P-gp/ABCB1), 후자는 결과 셀18,19에서 화학요법 에이전트의 수출. Taxanes 저항 또한 tubulin isotypes 또는 tubulin 돌연변이, 약물 및 그 대상 20,21사이의 상호 작용을 방지 하는 식의 변화와 같은 다른 원인으로 연결 되었습니다. 또한, 저항 게놈 불안정성 축적 및 종양이22,23관련 되어 있다. 그러나, taxane 저항에 기여 하는 메커니즘은 완전히 이해 되지,는 분명 모양을 방지 하는 치료 전략의 부재. 따라서, 이러한 메커니즘의 해 부에 지원 실험 모델을 생성 하 고 이러한 약물 저항의 개발을 방지 하는 새로운 치료 접근을 식별 하는 긴급 한 필요가 있다.
이 문서에서 우리는 전립선 암 세포 Docetaxel 저항 (DR)의 생성을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 추가 저항 상태 식민지 대형 분석 실험 및 양적 RT-PCR를 사용 하 여 이러한 셀의 유효성을 검사 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드에 의해 생성 세포 분자 기능을 통해 다양 한 실험적인 분석 실험을 수행 하는 융통성을 제공 하는 추가 혜택으로 공개적으로 사용 가능한 인간 종양 샘플 데이터베이스에서 발견의 많은 업과의 이점을 종양 샘플에서 허용 하는 것 보다 시간의 긴 기간 치료 저항의 이러한 암 모델 수 많은 주 조직 문화, 그리고 다른 접근 들에 대 한 확장, 유전자 조작, 현미경 검사 법 방법으로 시각 고 유전자 발현에 대 한 분석. 또한, 추가로 종양 형성 및 성장 vivo에서 효과 분석 하는 쥐에 xenotrasplanted 수 있습니다. 현재, 전립선 암의 맥락에서 약물 내성 연구를 주요 대체 방법 종양 샘플의 직접 분석 이다. 이러한 샘플 유전자 발현 및 주어진된 종양의 mutational 상태에 대 한 정보를 수집 하는 매우 강력한 시스템을 제시 하는 동안 그들에 게 액세스 매우 제한 될 수 있습니다 그리고 그들은 더 조작 및 실험 분석에 대 한 유지 하기 어려운이 이 프로토콜24,25생성 된 셀 라인으로 쉽게 할 수 있습니다. 중요 한 것은, 미래에 대안 같은 환자에서 인간의 파생된 organoids의 생성 될 것 이라고 매우 강력한 도구 현재 메서드26,27대안 접근 한다. 이후 그들은 어떤 종양은 그것의 원래 환경에서 3D 컨텍스트에서 정리 것 이다, organoids 세포와 인간 종양 사이의 완벽 한 모델 될 것입니다. 그러나,이 프로토콜에서 설명 하는 실험 셀 모델은 여전히 더 많은 유지 저렴 하 고 빠른 분석에 적합. 이러한 세포 선을 공부 하 여 얻은 결과를 추정 하 고 인간의 샘플 및 3 차원 문화에서 확인 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 우리의 프로토콜은 다른 약물과 암 종류의 연구에 적용할 수 있습니다 이후 어떤 셀 라인 chemoresistance 메커니즘 연구를 셀 모델을 추구 하는 연구원에 대 한 관심의 수 있습니다. 여기에 설명 된 메서드는 어떤 실험실, 저렴 한 가격에 적용 하 고 약물 내성의 분자 및 세포 메커니즘의 예비 연구를 허용 쉽습니다.
이 원고에서는 우리 chemoresistance 표현 형의 획득에 기여 하는 메커니즘의 연구에 대 한 수 Docetaxel 내성 전립선 암 세포 모델 시스템을 생성 하는 방법 설명. 이 접근은 매우 안정적이 고 재현, 일부 잠재적인 제한 사항은 고려해 야 합니다. 이후만 셀의 대량 인구의 극히 chemoresistance28을 전시할 것 이다, 것이 좋습니다 세포의 큰 인구와 함께 시작 (우리가 일반적으로 약 1.2 x 10에 대 한 계정을 150 cm2, 20 플라스 크 플레이트8 셀)입니다. 프로토콜의 주요 단계는 절차의 성공을 보장 하기 위해 고려 되어야 한다. 첫째, 그것은 매우 사용 같은 Docetaxel 갓 긴 기간 사용 (10 m m 재고-80 ° C에서에 제대로 저장 될 때 년에 aliquots를 사용할 수 있습니다)에 대 한 재고를 준비 하는 것이 중요. Aliquot Docetaxel에 약간의 변화 IC50, 셀 라인 타이밍의 세대의 결과 식민지 형성 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 그것은 유사 세포의 새로운 배치를 사용 하는 경우 발생할 수 있으므로 각 개별 셀 라인, IC50를 결정 하는 프로토콜을 시작 하는 중요 한. 셋째, 오류 수 있습니다 신속 하 게 감지 하 고 수정 현미경 세포를 자주 확인 하 여 약물 치료는 효과적인 모니터링에 필수적 이다. 마지막으로, 오염 또는 프로토콜 가운데 세포의 생존 능력에 영향을 미칠 수 있는 예기치 않은 문제 중간 단계의 재고를 항상 유지 하 고 좋습니다. 중요 한 것은, 우리의 프로토콜 72 h 뒤에 약의 더 낮은 일정 농도 보다는 긴 회복 기간, 최고의 모방 하려고 Docetaxel의 고용량을 전립선 암 세포를 노출 하 여 약물 내성의 모델을 생성 하는 것을 목표로 임상 시나리오가 taxane 에이전트15,16전립선 암 치료에 대 한 보고.
또한, 약물 내성 세포 전시 시간이 지남에 인수 저항 속성의 진보적인 손실로 이어질 수 있는 높은 소성을 주목 한다. 따라서 문화에 2-3 개월 이상에 대 한 이러한 세포를 사용 하 여 확장는 권장 하지 않습니다. 영구적인 공급 필요 하다 면 그것은 지속적으로 저항 세포의 새 일괄 처리를 생성 하는 것이 좋습니다. 그러나, 만약 셀의 일괄 처리 오랜된 시간 동안 경작 되는, 식민지 대형 분석 실험 및 정량 그들의 저항을 재평가 하 사용할 수 있습니다. 또 다른 대안은 72 h (500-1000 nM) Docetaxel의 높은 복용량으로 세포를 치료 하 여 말기 저항을 높일 것 이다. 1 ~ 2 주간의 회복 기간 후 phenotype 시험 될 수 있다 다시 정량 및 식민지 형성에 의해 분석 실험. 그것도 가능, 치료 세포의 aliquots (FBS, 10 %DMSO)에서 액체 질소에 저장을 권장 되지는 않지만. 그 후 동결-해 동 주기 chemoresistance 형 항상 다시 평가 해야 상기 방법으로 note 하시기 바랍니다.
이러한 경고에도 불구 하 고 우리28,29 등30,31,,3233 키 소설 세포를 식별 하기 위해 이러한 모델 시스템을 성공적으로 수 있었다 고 분자 메커니즘을 선도 높은 종양을 시작, 세포 생존, 용량과 Docetaxel 내성 세포에 공격. 이러한 암 세포 모델 시스템을 사용 하 여, 우리는 세포가 상피 및 전립선 관련 분화 마커의 부재와 대상의 overexpression 발달 특징 undifferentiated 형 전시 발견 (노치 및 고슴도치) 신호 경로, 화학요법 노출28살. 두 번째 연구에서 공개적으로 사용 가능한 환자 유전자 데이터 세트24,25, 함께이 모델을 사용 하 여 우리가 발견 그 초기 전사 요소 GATA2는 높은 overexpressed 전이성에 거세 저항 화학 요법에 저항력이 전립선 암 세포입니다. GATA2 신호 네트워크29IGF2 종속 다운스트림 키를 직접 활성화 하 여 세포의 생존을 증가 시킵니다. 특히, 이러한 연구 고급 전이성 전립선 암 공격34GATA2의 소설 키 역할을 식별 하는 데 도움이.
그것은 많은 다른 유형의 다양 한 화학요법 약물으로 치료 하는 암 중 널리 퍼진 약물 저항의 개발 Docetaxel과 전립선 암에 국한 되지 않습니다 하는 문제입니다. 실제로, 실험 모델의 가용성에 유사한 제한이 적용, 그리고 그것은 우리의 프로토콜 다른 암 종류 및 그들의 각각 chemoresistance 메커니즘 연구에 적용할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 설명 된 대로 Docetaxel 저항 세포의 생성 chemoresistance의 소설 관련 분자 및 세포 메커니즘을 식별 하는 기능적 도구로 사용할 수 있습니다. 이는 높은 악성 전립선 암에 대 한 새로운 치료법의 개발 수 똑, 우리가이 질병에 대해 무엇을 알고 하 고 우리는 환자를 치료 하는 방법의 경계를 한 번 더 밀고 새로운 목표를 찾아내기에 문을 엽니다.
The authors have nothing to disclose.
V.R.-B. 건강의 미국 부 로부터 자금을 받습니다 & 번호 1를 부여 하는 인간 서비스, 국립 보건원, 국립 암 연구소 K22 CA207458-01 ‘과 법학. 건강의 미국 부 로부터 자금을 받습니다 & 번호 1를 부여 하는 인간 서비스, 국립 보건원, 국립 암 연구소 R01 CA207311-01.
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |