Resistenza alle terapie del cancro contribuisce alla progressione di malattia e morte. Determinazione delle basi meccanicistiche di resistenza è cruciale per il miglioramento della risposta terapeutica. Dettagli di questo manoscritto, il protocollo di generare modelli di taxano-resistenti delle cellule di carcinoma della prostata (PC) per aiutare le vie di dissezione coinvolti nella progressione alla resistenza di Docetaxel in pazienti del PC.
Agenti di targeting dei microtubuli (MTA) sono un sostegno nel trattamento di una vasta gamma di tumori. Tuttavia, la resistenza acquisita ai farmaci chemioterapici è un meccanismo comune di progressione di malattia e una caratteristica determinante prognostici dei tumori maligni. Nel carcinoma della prostata (PC), resistenza a MTA come taxani Docetaxel dettami guasto del trattamento così come progressiva e letale fasi di malattia che sono definite da una prognosi sfavorevole e alti tassi di mortalità. Anche se studiato per decenni, la matrice di meccanismi che contribuiscono alla resistenza acquisita completamente non sono capiti e quindi rappresentano una limitazione significativa per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche che potrebbero beneficiare i pazienti in queste fasi avanzate di malattia. In questo protocollo, descriviamo la generazione di Docetaxel-resistente linee cellulari di carcinoma della prostata che imitano le caratteristiche letali di carcinoma della prostata di stadio avanzato e pertanto può essere utilizzato per studiare i meccanismi da cui chemioresistenza acquisita si pone. Nonostante i potenziali limiti intrinseci ad un modello di cella in base, ad esempio la perdita di proprietà di resistenza nel tempo, le linee cellulari resistenti a Docetaxel prodotte da questo metodo sono state utilizzate con successo in studi recenti e offrono l’opportunità di avanzare la nostra comprensione dei meccanismi molecolari della chemioresistenza acquisita nel carcinoma della prostata letale.
Un aumento del tasso di proliferazione causata dalla perdita di controllo del ciclo cellulare è un marchio di garanzia di cancro1. Questa struttura funzionale rende le cellule tumorali unicamente dipendente dalla fedeltà dei processi chiave del ciclo cellulare durante S-M-fasi e, che ha portato allo sviluppo di vari ciclo cellulare perturbante farmaci che inducono il danno del DNA o difetti mitotici. Anche se numerosi agenti anti-mitotici, come inibitori di chinasi mitotiche o proteine motrici, sono attualmente in fase di sviluppo e testati in studi clinici, agenti mirati ai microtubuli legacy (MTA) continuano ad essere l’unico approccio clinicamente approvato per targeting per mitosi in cancro2,3,4. MTA o destabilizzano (vinblastina, vincristina, vinorelbina) o stabilizzano i microtubuli (agenti di derivazione taxano Paclitaxel, Docetaxel o Cabazitaxel) e quindi evitare la formazione di un funzionamento del fuso mitotico5,6. Questi agenti innescano il mandrino Assemblea checkpoint7,8, che si traduce in un prolungato arresto mitotico e la morte finale delle cellule in cellule coltivate9,10 e alterazioni mitotiche nei tumori11 ,12 e sono pertanto utili per trattare una grande varietà di tumori, tra cui13di carcinoma della prostata.
Carcinoma della prostata è il più frequentemente diagnosticato cancro e delle cause principali del cancro decessi in uomini14. Agenti antimitotici come Docetaxel migliorare la sopravvivenza del malato di cancro alla prostata e sono un sostegno nel trattamento di questa malattia15,16,17. Purtroppo, nonostante il restringimento del tumore iniziale, le cellule del tumore spesso sviluppano resistenza ai farmaci durante il trattamento. Diversi meccanismi cellulari sono stati implicati nel causare lo sviluppo di chemioresistenza, tra cui deregolamentazione di apoptotic e vie infiammatorie, o attivazione/sovraespressione di pompe di efflusso del farmaco come il trasportatore di ATP-binding cassette P-glicoproteina (P-gp/ABCB1), l’ultima delle quali comporta l’esportazione degli agenti chemioterapeutici fuori le cellule18,19. Resistenza ai taxani è stato collegato anche con altre cause, quali i cambiamenti nell’espressione di isotipi di tubulina o mutazioni di tubulina, che impediscono l’interazione tra il farmaco e la sua destinazione 20,21. Inoltre, la resistenza è stato collegato con accumulo di instabilità del genoma e tumore eterogeneità22,23. Tuttavia, i meccanismi che contribuiscono alla resistenza di taxano completamente non sono capiti, che risulta evidente dall’assenza di strategie terapeutiche che impediscono il suo aspetto. Di conseguenza, c’è un urgente bisogno di generare modelli sperimentali che assistono nella dissezione di questi meccanismi e di identificare approcci terapeutici che impediscono lo sviluppo della resistenza a questi farmaci.
In questo articolo descriviamo un metodo che consente la generazione di Docetaxel-resistente (DR) cellule di carcinoma della prostata. Inoltre descriviamo come convalidare lo stato di resistenza di queste cellule utilizzando dosaggi di formazione di Colonia e RT-PCR quantitativa. Cellule prodotte da questo metodo hanno il vantaggio di ricapitolare molte delle caratteristiche molecolari trovati nei database di esempio pubblicamente disponibili e umane del tumore con l’ulteriore vantaggio di fornire la versatilità per eseguire un’ampia varietà di analisi sperimentale su lunghi periodi di tempo rispetto a quanto consentito dai campioni del tumore. Questi modelli di cancro di resistenza di terapia possono essere espansi per molte settimane nella coltura del tessuto e tra altri approcci, possono essere geneticamente manipolati, visualizzati tramite metodi di microscopia e analizzati per l’espressione genica. Inoltre, possono essere xenotrasplanted nei topi per analizzare ulteriormente gli effetti di formazione e la crescita del tumore in vivo. Attualmente, il principale metodo alternativo per studiare la resistenza ai farmaci nel contesto di carcinoma della prostata è l’analisi diretta di campioni di tumore. Mentre questi campioni presentano un sistema molto potente per raccogliere informazioni sull’espressione genica e stato mutazionale dei tumori dato, accesso a loro può essere molto limitata e sono difficili da mantenere per ulteriori manipolazioni e analisi sperimentale, che può essere fatto facilmente con le linee cellulari generate con questo protocollo24,25. Importante, in futuro, i metodi alternativi come la generazione dei organoids umana derivata direttamente dai pazienti sarebbe uno strumento molto potente e alternativa per il presente metodo26,27. Poiché essi saranno ricapitolare in un contesto 3D, quale un tumore era nel suo ambiente originale, organoids sarà il modello perfetto tra linee cellulari e tumori umani. Ancora, i modelli di cellulare sperimentale descritti in questo protocollo sono ancora più adatto per analisi più veloce e conveniente per mantenere. I risultati ottenuti studiando queste linee cellulari possono essere estrapolati per e confermati in campioni umani e culture 3D. Di conseguenza, questo protocollo può essere di interesse per i ricercatori che cercano modelli cellulari per lo studio dei meccanismi di chemioresistenza in qualsiasi linea cellulare, poiché il nostro protocollo può essere adattato allo studio di altri tipi di cancro e di droghe. I metodi descritti qui sono facili da applicare in qualsiasi laboratorio, a prezzi accessibili e permettono studi preliminari dei meccanismi cellulari e molecolari della resistenza ai farmaci.
In questo manoscritto, descriviamo un metodo per generare il Docetaxel-resistente sistemi di modello delle cellule di carcinoma della prostata che consente lo studio dei meccanismi che contribuiscono all’acquisizione del fenotipo chemioresistenza. Mentre questo approccio è altamente affidabile e riproducibile, alcune limitazioni potenziali dovrebbero essere considerate. Poiché solo una piccola frazione della popolazione alla rinfusa delle cellule esporrà chemioresistenza28, si raccomanda di iniziare con una grande popolazione di cellule (abbiamo solitamente piastra 20 boccette di 150 cm2, che rappresentano circa 1.2 x 108 cellule). Passaggi chiave del protocollo dovrebbero essere considerati per garantire il successo della procedura. In primo luogo, è molto importante utilizzare il Docetaxel stesso preparata stock per utilizzo a lungo termine (stock di 10 mM le aliquote possono essere utilizzate per anni se conservato correttamente a-80 ° C). Lievi modifiche nel Docetaxel aliquota possono influire i risultati di IC50, generazione della tempistica linea cellulare e i risultati di formazione della Colonia. In secondo luogo, è fondamentale avviare il protocollo di determinazione il IC50 in ogni linea cellulare individuale, poiché variazioni possono verificarsi quando si utilizza un nuovo lotto di cellule. In terzo luogo, è essenziale monitorare che il trattamento farmacologico è efficace controllando frequentemente le cellule al microscopio, così eventuali errori possono essere rilevati rapidamente e rettificati. Infine, si consiglia di tenere sempre una scorta di tappe intermedie in caso di contaminazione o problemi imprevisti che potrebbero influenzare la vitalità delle cellule nel mezzo il protocollo. D’importanza, il nostro protocollo mira a generare modelli di farmacoresistenza esponendo le cellule di carcinoma della prostata ad alte dosi di Docetaxel per 72 h seguita da periodi di recupero lunghi, piuttosto che una concentrazione costante del farmaco nel tentativo di imitare la migliore clinica scenario segnalati per il trattamento di carcinoma della prostata con questo taxano agente15,16.
Inoltre, si deve osservare che le cellule farmaco-resistenti presentano un’elevata plasticità, che può portare a una progressiva perdita delle proprietà di resistenza acquisita nel tempo. Pertanto, l’estensione dell’uso di queste cellule per più di 2-3 mesi nella cultura non è raccomandato. Se è necessaria una fornitura permanente si consiglia di generare continuamente nuovi lotti di cellule resistenti. Tuttavia, se lotti delle cellule sono state coltivate per un tempo prolungato, Colonia formazione saggi e qPCR può essere utilizzati per rivalutare la loro resistenza. Un’altra alternativa è di Spinta Waxing resistenza trattando le cellule con un’alta dose di Docetaxel per 72 h (500-1.000 nM). Dopo un periodo di recupero di una o due settimane, il fenotipo può essere ri-testato da formazione qPCR e Colonia saggi. È anche possibile, sebbene non sia consigliato, per conservare le aliquote delle cellule trattate in azoto liquido (in FBS, 10% DMSO). Siete pregati di notare che dopo un ciclo di gelo-disgelo, il fenotipo di chemioresistenza dovrebbe sempre essere ri-valutato con i metodi di cui sopra.
Nonostante queste riserve, abbiamo28,29 e gli altri30,31,32,33 sono stati in grado di impiegare con successo questi sistemi modello per identificare romanzo chiave cellulare e meccanismi molecolari che portano ad elevata capacità d’inizio, la sopravvivenza delle cellule e aggressività in cellule resistenti a Docetaxel. Utilizzando questi sistemi di modello delle cellule di cancro, abbiamo scoperto che le cellule che esibiscono un fenotipo indifferenziato, caratterizzato da assenza di marcatori di differenziazione epiteliale e prostata-relativi e la sovraespressione di indirizzabile inerente allo sviluppo (tacca e Vie di segnalazione di Hedgehog), sopravvivere chemioterapeutici esposizione28. In un secondo studio, utilizzando questi modelli insieme a gene paziente pubblicamente disponibili set di dati24,25, abbiamo scoperto che il fattore di trascrizione pioneer GATA2 altamente è overexpressed in metastatico resistente alla castrazione cellule di carcinoma della prostata chemioterapia-resistente. GATA2 aumenta la sopravvivenza delle cellule attivando direttamente una IGF2-dipendente chinasi a valle segnalazione rete29. In particolare, questi studi ha contribuiti ad identificare nuovi ruoli chiave di GATA2 nel carcinoma della prostata metastatico avanzato aggressività34.
Lo sviluppo della resistenza ai farmaci è un problema che non è limitato a Docetaxel e carcinoma della prostata, come è diffusa tra molti altri tipi di tumori trattati con una vasta gamma di farmaci chemioterapici. Infatti, si applicano restrizioni simili sulla disponibilità di modelli sperimentali, ed è concepibile che il nostro protocollo può essere adattato per studiare altri tipi di cancro e dei loro meccanismi di chemioresistenza rispettivi.
La generazione di cellule resistenti a Docetaxel come descritto in questo protocollo utilizzabile come uno strumento funzionale per identificare nuovi meccanismi molecolari e cellulari rilevanti di chemioresistenza. Questo apre la porta a trovare nuovi obiettivi, su cui lo sviluppo di nuovi trattamenti per il cancro della prostata altamente maligno potrebbe articolare, ancora una volta i confini di ciò che sappiamo su questa malattia e come trattiamo i suoi pazienti.
The authors have nothing to disclose.
V.R.-B. riceve finanziamenti dal U.S. Department of Health & Human Services, NIH, National Cancer Institute concedere numero 1 K22 CA207458-01 e J.D.-D. riceve finanziamenti dal U.S. Department of Health & Human Services, NIH, National Cancer Institute concedere numero 1 CA207311 R01-01.
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |