Устойчивость к терапии рака способствует прогрессирования заболевания и смерти. Определение механистический основы сопротивления имеет решающее значение для улучшения терапевтического ответа. Эта рукопись детали протокола для создания модели taxane устойчивостью клеток рака простаты (ПК), чтобы помочь рассекает пути участвует в прогрессии Доцетаксел сопротивление в больных PC.
Микротрубочки ориентации агентами (MTA) являются опорой в лечении широкого спектра опухолей. Однако приобретенных сопротивление химиотерапевтических препаратов является общим механизмом прогрессирования заболевания и функцию прогнозно определитель злокачественных опухолей. В рак простаты (PC) устойчивость к МТС например taxane Доцетаксел диктует неэффективности лечения, а также прогрессии к смертельной стадиях заболевания, которые определяются плохой прогноз и высокой смертности. Хотя учился на протяжении десятилетий, массив механизмов, способствующих приобретенных сопротивления полностью не поняты и таким образом создают значительные ограничения для развития новых терапевтических стратегий, которые могли бы принести пользу пациентам, в эти дополнительные этапы болезни. В этом протоколе, мы описываем поколения Доцетаксел стойкие простаты рак клеточных линий, которые имитируют смертельной черты поздней стадии рака простаты и поэтому может использоваться для изучения механизмов, которые приобретенных chemoresistance возникает. Несмотря на потенциальные ограничения, присущие ячейки на основе модели, например потери свойств сопротивления со временем, доцетаксел устойчивые клеточные линии, производимые этот метод успешно применялись в недавних исследованиях и предлагают возможность для продвижения вперед наших молекулярные понимание приобретенных chemoresistance смертоносных рака простаты.
Увеличение скорость распространения, вызванные потерей контроля клеточного цикла является отличительной чертой рака1. Это функциональное свойство оказывает раковые клетки однозначно зависит от точности ключевых процессов клеточного цикла во время S – и М-фазы, которая привела к развитию различных клеточного цикла нарушается препаратов, которые вызывают повреждение ДНК или митотическая дефектов. Хотя многочисленные анти митотическая агентов, например ингибиторов митотическая киназы или моторов белков, в настоящее время разрабатываются и испытываются в клинических испытаниях, наследие микротрубочек таргетинга агентов (MTA) по-прежнему быть единственный клинически утвержденных подход для ориентация митоз в рак2,3,4. MTA либо дестабилизировать (винбластин, винкристин, винорелбин) или стабилизировать микротрубочек (taxane производные агентов паклитаксел, доцетаксел или Cabazitaxel) и тем самым предотвратить формирование функционирования митотического шпинделя5,6. Эти агенты вызвать шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускной пункт7,8, что приводит к длительной митотическая арест и возможного клеточной гибели в культивируемых клеток9,10 и митотического дефекты в опухоли11 ,12 и поэтому полезны для лечения рака простаты13большое разнообразие видов рака, среди них.
Наиболее часто диагностируется рак простаты рак и ведущей причиной рака смертей мужчин14. Antimitotic агенты, такие как Доцетаксел улучшить выживаемость рака простаты пациента и являются опорой в лечении этой болезни по15,16,17. К сожалению несмотря на первоначальные опухоли усадка, опухолевые клетки часто развиваются лекарственной устойчивости во время лечения. Несколько клеточных механизмов были причастны причиной развития chemoresistance, включая дерегулирование apoptotic и воспалительных пути, или активации/гиперэкспрессия наркотиков измеряем насосов как АТФ привязки кассеты транспортер Р-гликопротеина (P-gp/ABCB1), последний из которых в результате экспорта химиотерапевтических агентов из клетки18,19. Устойчивость к таксаны также были связаны с другими причинами, такими, как изменения в выражении тубулин изотипов или тубулин мутации, которые препятствуют взаимодействию между наркотиками и его цели 20,21. Кроме того сопротивление была связана с накоплением нестабильности генома и опухоли неоднородность22,23. Однако механизмов, способствующих taxane сопротивления являются полностью не поняты, что является очевидным отсутствием терапевтические стратегии, которые препятствуют его внешний вид. Таким образом существует настоятельная необходимость для создания экспериментальных моделей, которые помогают в рассечение этих механизмов и определить новые терапевтические подходы, которые предотвращать развитие резистентности к этим препаратам.
В этой статье мы опишем метод, который позволяет генерировать Доцетаксел стойкие (DR) раковые клетки простаты. Далее мы опишем способы проверки сопротивления статус этих клеток с помощью анализов формирования колонии и количественного RT-PCR. Клетки, производимых этим методом имеют преимущество, изложив многие молекулярные функции в публично доступных человека опухоли образцов баз данных с дополнительным преимуществом, обеспечивая гибкость для выполнения широкого ряда экспериментальных анализов более длительные периоды времени, чем разрешено в образцах опухоли. Эти модели рака терапии сопротивления может быть расширен для многих недель в культуре ткани и среди других подходов, можно генетически манипулировать, визуализируется методами микроскопии и проанализированы для экспрессии генов. Кроме того они могут быть xenotrasplanted в мышах для дальнейшего анализа эффектов для формирования и роста опухоли в естественных условиях. В настоящее время основной альтернативный метод для изучения лекарственной устойчивости в контексте рака простаты является прямой анализ образцов опухоли. Хотя эти примеры представляют очень мощные системы для сбора информации о экспрессии генов и мутационного статуса данной опухоли, доступ к ним может быть весьма ограниченным и они трудно сохранить для дальнейших манипуляций и экспериментального анализа, который легко может быть сделано с клеточных линий, созданных с этот протокол24,25. Важно отметить, что в будущем, альтернативные подходы, такие, как поколения человека organoids производные непосредственно от пациентов будет очень мощным инструментом и альтернативой нынешней метод26,27. Поскольку они будут пилки в 3D контексте, что опухоль была в его исходном среде, organoids будет идеальной моделью между клеточных линий и человека опухоли. Тем не менее экспериментальные ячейки модели, описанные в настоящем Протоколе, еще более доступным для поддержания и подходит для более быстрый анализ. Результаты, полученные путем изучения этих клеточных линий можно экстраполировать и подтверждены в образцах и 3D культур. Таким образом этот протокол может представлять интерес для исследователей, стремящихся ячейки модели для изучения механизмов chemoresistance в любой линии клетки, так как наш протокол может быть адаптирована к изучению других наркотиков и типов рака. Методы, описанные здесь легко применять в любой лаборатории, доступным и позволить предварительные исследования молекулярных и клеточных механизмов лекарственной устойчивости.
В этой рукописи мы описываем метод для создания Доцетаксел устойчивостью клеток рака простаты модель систем, что позволяет для изучения механизмов, способствующих приобретению chemoresistance фенотип. Хотя такой подход является очень надежных и воспроизводимых, следует рассмотреть некоторые потенциальные ограничения. С тех пор только малую часть массовая популяция клеток будет экспонат chemoresistance28, рекомендуется начать с большой популяции клеток (мы обычно пластины 20 колбы 150 см2, которые составляют приблизительно 1.2 x 108 клетки). Основные этапы протокола следует обеспечить успех процедуры. Во-первых очень важно использовать же Доцетаксел свежеприготовленные складе для длинный срок использования (10 мм сток аликвоты могут быть использованы для лет, когда должным образом в температуре-80 ° C). Незначительные изменения в аликвота Доцетаксел может повлиять на результаты IC50, генерации клеток линии времени и результаты формирования колонии. Во-вторых важно начать в протоколе Определение IC50 в каждой отдельной ячейки линии, так как вариации может произойти при использовании новой партии клеток. В-третьих важно отслеживать, что медикаментозное лечение является эффективным путем проверки клетки под микроскопом часто, поэтому любые ошибки могут быть быстро обнаружены и исправлены. Наконец мы рекомендуем всегда держать запас промежуточных шагов в случае загрязнения или неожиданные проблемы, которые могут повлиять на жизнеспособность клеток в середине протокол. Важно отметить, что наш протокол стремится создавать модели лекарственной устойчивости, подвергая раковых клеток простаты на высоких доз Доцетаксел за 72 ч, следуют периоды длительного восстановления, а не ниже постоянной концентрации препарата в попытке имитировать лучших клинических сценарий сообщил для лечения рака простаты с этой taxane агента15,16.
Кроме того следует отметить, что лекарственно-клетки exhibit высокая пластичность, которые могут привести к прогрессивной потере приобретенного сопротивления свойств с течением времени. Таким образом расширение использования этих клеток для более чем 2-3 месяца в культуре не рекомендуется. Если требуется постоянного питания рекомендуется постоянно создавать новые пакеты устойчивостью клеток. Однако если пакеты клеток были культивированный на длительное время, колонии формирования анализов и ПЦР может использоваться пересмотреть их сопротивление. Другой альтернативой является стимулирование убывающей сопротивления, рассматривая клетки с высокой дозой Доцетаксел за 72 ч (500-1000 Нм). После периода восстановления одной-двух недель, фенотип может быть повторно проверена путем формирования ПЦР и колонии анализов. Это также возможно, хотя это не рекомендуется, чтобы хранить аликвоты лечение клеток в жидком азоте (в FBS, 10% ДМСО). Пожалуйста, обратите внимание, что после цикла замораживания оттаивания, chemoresistance фенотип должен всегда повторно вычисляться с вышеупомянутых методов.
Несмотря на эти оговорки мы29 28,и другие30,,3132,33 смогли успешно используют эти модели системы для определения ключевой роман сотовой и молекулярные механизмы, ведущие к повышенным опухоли инициирование емкости, выживание клетки и агрессивность в Доцетаксел устойчивостью клеток. С помощью этих раковых клеток модели систем, мы обнаружили, что клетки, экспонируется недифференцированные фенотип, характеризуется отсутствием маркеры эпителия и связанных с ними простаты дифференциации и Гиперэкспрессия ориентации развития (Notch и Ежик) сигнальных путей, выжить химиотерапевтических воздействия28. В втором исследовании используя эти модели вместе с общедоступной пациента гена наборы данных24,25, мы обнаружили, что пионером транскрипционный фактор GATA2 является высоко оверэкспрессировали в метастатических кастрация стойкие устойчивость к химиотерапии раковые клетки простаты. GATA2 увеличивает выживаемость клеток напрямую активируя IGF2-зависимая киназа вниз по течению, сигнализации сети29. В частности эти исследования помогли выявить Роман ключевую роль GATA2 в передовых метастатическим раком простаты агрессивность34.
Развитие лекарственной устойчивости является проблемой, которая не ограничивается Доцетаксел и рак простаты, как это распространено среди многих других видов рака, лечение с широким набором химиотерапевтических препаратов. Действительно применяются аналогичные ограничения на наличие экспериментальных моделей, и вполне возможно, что наш протокол могут быть адаптированы для изучения других типов рака и механизмы их соответствующих chemoresistance.
Поколение Доцетаксел устойчивостью клеток, как описано в настоящем Протоколе может использоваться как функциональный инструмент для выявления роман соответствующих молекулярных и клеточных механизмов chemoresistance. Это открывает двери для нахождения новых целей, на которых могли бы сформулировать разработки новых методов лечения для высоки злокачественные рака простаты, еще раз нажав границы того, что мы знаем об этой болезни и как мы относимся к своим пациентам.
The authors have nothing to disclose.
В.Р.-Б. получает финансирование от Департамента здравоохранения США & человека услуг, низ, Национальный институт рака предоставить номер 1 K22 CA207458-01 и J.D.-D. получает финансирование от Департамента здравоохранения США & человека услуг, низ, Национальный институт рака предоставить номер 1 R01 CA207311-01.
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |