Resistens over for kræft behandlinger bidrager til sygdomsprogression og død. Bestemmelse af de mekanistiske fundament for modstand er afgørende for at forbedre terapeutisk respons. Dette manuskript detaljer protokol til at generere taxane-resistente cell modeller af prostatacancer (PC) til at dissekere veje, der er involveret i progression til Docetaxel modstand i PC patienter.
Mikrotubulus målretning agenter (MTA’er) er en grundpille i behandlingen af en bred vifte af tumorer. Erhvervet modstand mod kemoterapeutiske stoffer er imidlertid en fælles ordning for sygdomsprogression og en prognostiske faktor funktion af maligne tumorer. Prostatacancer (PC) dikterer modstand mod MTA’er såsom taxane Docetaxel behandling fiasko samt progression mod dødbringende stadier af sygdommen, der er defineret af en dårlig prognose og høj dødelighed. Selvom studerede i årtier, vifte af mekanismer bidrager til erhvervet modstand er ikke helt forstået, og dermed udgøre en væsentlig begrænsning for udviklingen af nye terapeutiske strategier, der kunne gavne patienter i disse avancerede stadier af sygdom. I denne protokol, vi beskrive generation af Docetaxel-resistente prostata cancer cellelinjer, der efterligner dødbringende funktioner af sene prostatakræft, og derfor kan bruges til at studere mekanismerne af hvilke erhvervede chemoresistance opstår. På trods af potentielle begrænsninger iboende til celle-baserede model, tab af resistens egenskaber over tid, de Docetaxel-resistente cellelinjer produceret ved denne metode held har været anvendt i de seneste undersøgelser og tilbyder mulighed for at fremme vores Molekylær forståelse af erhvervet chemoresistance i dødbringende prostatakræft.
En øget hyppighed af spredning forårsaget af tabet af cellecyklus kontrol er kendetegnende for kræft1. Denne funktionelle egenskab gør kræftceller entydigt afhængig af troskab af cellecykluss centrale processer under S – og M-faser, hvilket har ført til udviklingen af forskellige cellecyklus forstyrrende stoffer, der inducerer DNA-skader eller mitotiske defekter. Selvom mange anti-mitotiske agenter, som hæmmere af mitotiske kinaser eller motor proteiner, er i øjeblikket ved at blive udviklet og testet i kliniske forsøg, fortsat ældre mikrotubulus målretning agenter (MTA’er) at være den eneste klinisk godkendt tilgang til målretning mitosen i kræft2,3,4. MTA’er enten destabilisere (Vinblastine, Vincristin, vinorelbin) eller stabilisere (taxane-afledte agenter midlertidigt Paclitaxel eller Docetaxel Cabazitaxel) mikrotubuli og forhindre dermed dannelsen af en velfungerende mitotiske spindel5,6. Disse agenter udløse den spindel forsamling checkpoint7,8, hvilket resulterer i en langvarig mitotiske arrestation og eventuel celledød i kulturperler celler9,10 og mitotiske defekter i tumorer11 ,12 og er derfor nyttig til behandling af en lang række kræftformer, blandt dem prostatakræft13.
Prostatakræft er det hyppigst diagnosticeret kræft og en førende årsag til kræft dødsfald i mænd14. Antimitotic agenser såsom Docetaxel forbedre prostatakræft patientens overlevelse og er en grundpille i behandlingen af denne sygdom15,16,17. Desværre, trods indledende tumor krympning, tumorceller ofte udvikle resistens under behandling. Flere cellulære mekanismer har været impliceret i forårsager udviklingen af chemoresistance, herunder deregulering af apoptotiske og inflammatoriske veje eller aktivering/overekspression af stof efflux pumper som ATP-binding kassetten transportør P-glykoprotein (P-gp/ABCB1), hvor sidstnævnte resulterer i eksport af kemoterapeutiske stoffer ud af cellerne18,19. Modstand mod taxanes har også været forbundet med andre årsager, såsom ændringer i udtrykket af tubulin isotypes eller tubulin mutationer, som forhindrer interaktion mellem lægemidlet og dets mål 20,21. Derudover har modstand været relateret til genom ustabilitet ophobning og tumor heterogenitet22,23. Dog er de mekanismer, der bidrager til taxane modstand ikke helt forstået, hvilket er tydeligt i mangel af terapeutiske strategier, der forhindrer dens udseende. Derfor er der et presserende behov for at generere eksperimentelle modeller, der kan hjælpe i dissektion af disse mekanismer og identificere roman terapeutiske tilgange, der forhindrer udviklingen af resistens over for disse stoffer.
I denne artikel beskriver vi en metode, som giver mulighed for generation af Docetaxel-resistente (DR) prostata cancerceller. Yderligere vil vi beskrive, hvordan du validere modstand status for disse celler ved hjælp af kolonien dannelse assays og kvantitativ RT-PCR. Celler fremstillet ved denne metode har den fordel af recapitulating mange af de molekylære funktioner findes i offentligt tilgængelige menneskelige tumor Eksempeldatabaser med den ekstra fordel giver alsidighed for at udføre en lang række eksperimentelle assays over længere tid end tilladt af tumor prøver. Disse kræftmodeller terapi modstand kan udvides til mange uger i vævskultur og blandt andre tilgange, kan være genetisk manipuleret, visualiseret ved mikroskopi metoder og analyseret for genekspression. Derudover kan de være xenotrasplanted i mus til yderligere analysere virkningerne i tumor dannelse og vækst in vivo. I øjeblikket er den vigtigste alternative metode til at studere resistens i forbindelse med prostatakræft den direkte analyse af tumor prøver. Mens disse prøver præsenterer en meget potent system for at indsamle oplysninger om genekspression og mutationsmønstre status af en given tumorer, adgang til dem kan være meget begrænset, og de er vanskelige at vedligeholde for yderligere manipulationer og eksperimentel analyse, som kan nemt gøres med cellelinjer genereret med denne protokol24,25. Vigtigere, i fremtiden, metoder alternative som generation af menneskelige afledt organoids direkte fra patienter ville være et meget stærkt værktøj og alternativ til den nuværende metode26,27. Da de vil sammenfatte i en 3D sammenhæng hvad en tumor var i sit oprindelige miljø, vil organoids være den perfekte model mellem cellelinjer og humane tumorer. De eksperimentelle cell modeller er beskrevet i denne protokol er dog stadig mere overkommeligt at vedligeholde og egnet til hurtigere analyse. Resultaterne ved at studere disse cellelinjer kan ekstrapoleres til og bekræftet i humane prøver og 3D kulturer. Denne protokol kan derfor af interesse for forskere søger cell modeller til at studere chemoresistance mekanismer i enhver cellelinje, da vores protokol kan tilpasses til studiet af andre narkotika og kræft typer. Metoderne beskrevet her er let at anvende på et laboratorium, overkommelige og tillade indledende studier af de molekylære og cellulære mekanismer af resistens over for lægemidler.
I dette manuskript beskriver vi en metode til at generere Docetaxel-resistente prostata kræft celle modelsystemer, der giver mulighed for undersøgelse af mekanismer bidrager til erhvervelse af chemoresistance Fænotypen. Mens denne tilgang er meget pålidelig og reproducerbar, bør nogle potentielle begrænsninger overvejes. Da kun en lille brøkdel af befolkningens hovedparten af celler vil udstille chemoresistance28, anbefales det at starte med en stor population af celler (vi normalt plade 20 kolber af 150 cm2, som tegner sig for ca. 1,2 x 108 celler). Vigtige trin i protokollen bør overvejes at sikre succes i proceduren. Først, er det meget vigtigt at bruge den samme Docetaxel frisklavet lager for lang tids brug (10 mM stock delprøver kan bruges til år når gemmes korrekt i på-80 ° C). Små ændringer i den aliquot Docetaxel kan påvirke resultaterne af IC50, generation af celle linje timing og koloni dannelse resultater. For det andet er det afgørende at starte den protokol, der fastlægger IC50 i hver enkelt cellelinje, da varianter kan forekomme ved brug af et nyt parti af celler. For det tredje er det vigtigt at overvåge, at medicinsk behandling er effektiv ved at kontrollere celler under mikroskopet ofte, så eventuelle fejl kan opdages hurtigt og korrigeres. Endelig anbefaler vi altid at holde en bestand af mellemliggende trin i tilfælde af kontaminering eller uventede problemer, der kan påvirke levedygtigheden af cellerne i protokollen. Vigtigere, vores protokollen har til formål at generere modeller af resistens ved at udsætte prostata cancerceller for høje doser af Docetaxel for 72 h efterfulgt af lange hvileperioder, snarere end lavere konstant koncentrationer af stoffet i et forsøg på at efterligne bedste kliniske scenario rapporteret for prostatakræft behandling med denne taxane agent15,16.
Derudover skal det bemærkes, at resistente celler udviser en høj plasticitet, hvilket kan føre til en fremadskridende tab af erhvervede egenskaber over tid. Derfor, udvidelse af brugen af disse celler i mere end 2-3 måneder i kultur er ikke anbefalet. Hvis en permanent forsyning er nødvendigt er det tilrådeligt at løbende generere nye partier af resistente celler. Men hvis partier af celler har været kulturperler i længere tid, koloni dannelse assays og qPCR kan bruges til at revurdere deres modstand. Et andet alternativ er at øge aftagende modstand ved behandling af celler med en høj dosis af Docetaxel i 72 timer (500-1.000 nM). Efter et opsving periode på en til to uger, kan fænotype igen testet af qPCR og koloni dannelse assays. Det er også muligt, selvom det ikke anbefales at gemme delprøver af behandlede celler i flydende kvælstof (i FBS, 10% DMSO). Bemærk, at efter et fryse-tø cyklus, chemoresistance fænotype bør altid revurderes med de ovennævnte metoder.
Trods disse forbehold, vi28,29 og andre30,31,32,33 var i stand til med succes anvender disse modelsystemer at identificere centrale roman cellulære og molekylære mekanismer fører til forhøjet tumor-indlede kapacitet, celle overlevelse og aggressivitet i Docetaxel-resistente celler. Bruge systemerne kræft celle model, opdagede vi, at celler udstiller en udifferentieret fænotype, karakteriseret ved fravær af epitel og prostata-relaterede differentiering markører og overekspression af markedssegment udviklingsmæssige (hak og Pindsvin) signaling veje, overleve kemoterapeutiske eksponering28. I en anden undersøgelse, afsløret ved hjælp af disse modeller sammen med offentligt tilgængelige patient gen datasæt24,25, vi at pioner transskription faktor GATA2 er meget overexpressed i metastatisk kastration-resistente kemoterapi-resistente prostata cancerceller. GATA2 øger overlevelsen af celler med direkte aktivering af en IGF2-afhængige downstream kinase signalering netværk29. Især disse undersøgelser hjalp med at identificere roman nøgleroller i GATA2 i fremskreden metastatisk prostatacancer aggressivitet34.
Udvikling af resistens er et problem, der ikke er begrænset til Docetaxel og prostata kræft, da det er udbredt blandt mange andre typer af kræft behandlet med en bred vifte af kemoterapeutiske stoffer. Faktisk gælder lignende begrænsninger på tilgængeligheden af eksperimentelle modeller, og det er tænkeligt, at vores protokol kan tilpasses til at studere andre kræft typer og deres respektive chemoresistance mekanismer.
Generation af Docetaxel-resistente celler som beskrevet i denne protokol kan bruges som et funktionelt redskab til at identificere nye relevante molekylære og cellulære mekanismer af chemoresistance. Dette åbner døren til at finde nye mål, hvorpå udviklingen af nye behandlinger for stærkt malign prostatakræft kan formulere, skubber igen grænser for hvad vi ved om denne sygdom, og hvordan vi behandler sine patienter.
The authors have nothing to disclose.
VR-B. modtager støtte fra USA ‘s Department of Health & menneskelige tjenester, NIH, National Cancer Institute giver nummer 1 K22 CA207458-01 og J.D.-D. modtager støtte fra USA ‘s Department of Health & menneskelige tjenester, NIH, National Cancer Institute giver nummer 1 R01 CA207311-01.
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |