Resistência às terapias de câncer contribui para a morte e a progressão da doença. Determinar as bases mecanicistas da resistência é crucial para melhorar a resposta terapêutica. Este detalhes de manuscrito o protocolo para gerar modelos metastizado resistente de células de câncer de próstata (PC) para ajudar a dissecar as vias envolvido na progressão para resistência de Docetaxel em pacientes de PC.
Microtubule direcionamento MTAs (agentes) são dos pilares no tratamento de uma ampla variedade de tumores. No entanto, a resistência adquirida de quimioterápicos é um mecanismo comum de progressão da doença e uma característica determinante do prognóstico de tumores malignos. No cancro da próstata (PC), resistência à MTAs como o Docetaxel taxano dita insucesso do tratamento, bem como a progressão para estágios letais da doença que são definidos por um prognóstico pobre e altas taxas de mortalidade. Apesar de estudado durante décadas, a matriz de mecanismos que contribuem para a resistência adquirida não são completamente compreendidas e, portanto, representar uma limitação significativa para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que poderia beneficiar pacientes nestas fases de avançadas doença. Neste protocolo, descrevemos a geração de Docetaxel resistentes linhas de células de câncer de próstata que imitam características letais de câncer de próstata avançado e, portanto, pode ser usado para estudar os mecanismos pelos qual chemoresistance adquirida surge. Apesar de potenciais limitações intrínsecas a um modelo de célula com base, tais como a perda das propriedades de resistência ao longo do tempo, resistente ao Docetaxel linhas celulares produzidas por esse método tem sido utilizadas com sucesso em estudos recentes e oferecer a oportunidade de avançar nosso compreensão molecular da chemoresistance adquirida no câncer de próstata letal.
Um aumento da taxa de proliferação, causada pela perda de controlo do ciclo celular é uma marca registrada de câncer1. Esta propriedade funcional processa células cancerosas exclusivamente dependente a fidelidade dos processos-chave do ciclo celular durante a S – e M-fases, que levou ao desenvolvimento de vários ciclo celular distorçer drogas que induzem o DNA danos ou defeitos mitóticos. Apesar de numerosos agentes antimitóticos, como inibidores de quinases mitóticas ou proteínas do motor, estão actualmente a ser desenvolvido e testado em ensaios clínicos, legado do microtubule direcionamento MTAs (agentes) continuam a ser a única abordagem clinicamente aprovada para direcionamento de mitose em câncer2,3,4. MTAs ou desestabilizam (vimblastina, vincristina, Vinorelbina) ou estabilizar microtúbulos (derivado de taxano agentes Paclitaxel, Docetaxel ou Cabazitaxel) e, assim, evitar a formação de um funcionamento fuso mitótico5,6. Esses agentes acionar o eixo conjunto posto7,8, que resulta em uma prolongada detenção mitótica e a morte eventual de célula em células cultivadas9,10 e defeitos mitóticos em tumores11 ,12 e são, portanto, útil para tratar uma grande variedade de cânceres, entre eles o câncer de próstata13.
Câncer de próstata é o mais frequentemente diagnosticado câncer e das principais causas de câncer relacionados a mortes em homens14. Agentes antimitóticos como Docetaxel melhorar a sobrevida do paciente com câncer de próstata e são dos pilares no tratamento desta doença15,16,17. Infelizmente, apesar do encolhimento do tumor inicial, as células do tumor frequentemente desenvolvem resistência aos medicamentos durante o tratamento. Vários mecanismos celulares têm sido implicados em causar o desenvolvimento de chemoresistance, incluindo desregulamentação de apoptotic e vias inflamatórias ou ativação/superexpressão de bombas de efluxo de drogas como o ATP-binding cassette transportador P-glicoproteína (P-gp/ABCB1), o último dos quais resulta na exportação de agentes quimioterápicos, fora as células18,19. Resistência à taxanos também tem sido associada com outras causas, tais como mudanças na expressão de tubulina isotipos ou mutações de tubulina, que impedem a interação entre a droga e seu alvo 20,21. Além disso, resistência tem sido relacionada com acúmulo de instabilidade do genoma e tumor heterogeneidade22,23. No entanto, os mecanismos que contribuem para a resistência de taxano não são completamente compreendidos, que manifesta-se pela ausência de estratégias terapêuticas que impedem a sua aparência. Portanto, há uma necessidade urgente para gerar modelos experimentais que auxiliam na dissecação desses mecanismos e identificar novas abordagens terapêuticas que impedem o desenvolvimento de resistência a estas drogas.
Neste artigo nós descrevemos um método que permite a geração de Docetaxel-resistente (DR) células cancerosas da próstata. Além disso, descreveremos como validar o status de resistência dessas células utilizando ensaios de formação de colônia e RT-PCR quantitativo. As células produzidas por esse método tem a vantagem de muitas das características moleculares encontradas em bancos de dados de amostra de tumor humano disponível publicamente com o benefício adicional de fornecer a versatilidade para executar uma grande variedade de ensaios experimentais sobre recapitulando longos períodos de tempo do que o permitido por amostras do tumor. Estes modelos de câncer de resistência de terapia podem ser expandidos por muitas semanas em cultura de tecidos e entre outras abordagens, pode ser geneticamente manipulados, visualizados por métodos de microscopia e analisados para expressão gênica. Além disso, eles podem ser xenotrasplanted em ratos para analisar mais efeitos no tumor de formação e crescimento em vivo. Atualmente, o principal método alternativo para estudar a resistência a medicamentos no contexto do câncer de próstata é a análise direta de amostras do tumor. Enquanto estas amostras apresentam um sistema muito potente para reunir informações sobre expressão gênica e status mutacional dos tumores determinados, acesso a eles pode ser muito limitado, e são difíceis de manter por mais manipulações e análise experimental, que pode ser feito facilmente com as linhas de célula geradas com este protocolo24,25. Importante, no futuro, alternativa abordagens tais como a geração de humanos organoids derivada diretamente de pacientes seria uma ferramenta muito poderosa e alternativa para o presente método26,27. Uma vez que eles serão recapitulate em um contexto 3D, um tumor que estava em seu ambiente original, organoids será o modelo perfeito entre linhagens celulares e tumores humanos. Ainda, os modelos de celular experimental descritos neste protocolo são ainda mais acessíveis para manter e apropriado para uma análise mais rápida. Os resultados obtidos através do estudo dessas linhas de células podem ser extrapolados para e corroborados em amostras humanas e culturas 3D. Portanto, este protocolo pode ser de interesse para os investigadores procuram modelos de celular estudar os mecanismos de chemoresistance em qualquer linha de celular, desde que nosso protocolo pode ser adaptado para o estudo de outros tipos de câncer e drogas. Os métodos descritos aqui são fáceis de aplicar em qualquer laboratório, acessível e permitir estudos preliminares dos mecanismos moleculares e celulares da resistência às drogas.
Este manuscrito, descrevemos um método para gerar sistemas de modelo de células de câncer de próstata resistente ao Docetaxel que permite o estudo dos mecanismos que contribuem para a aquisição do fenótipo chemoresistance. Enquanto essa abordagem é altamente confiáveis e reprodutíveis, devem ser consideradas algumas limitações potenciais. Desde que somente uma pequena fração da população em massa de células irá expor chemoresistance28, recomenda-se começar com uma grande população de células (nós geralmente chapear 20 frascos de 150 cm2, que representam aproximadamente 1,2 x 108 células). Etapas-chave do protocolo devem ser consideradas para garantir o sucesso do procedimento. Em primeiro lugar, é muito importante usar o mesmo Docetaxel preparadas ações para uso de longo prazo (estoque de 10mm alíquotas podem ser usadas por anos quando armazenado adequadamente na-80 ° C). Pequenas mudanças na alíquota do Docetaxel podem afetar os resultados de IC50, geração de sincronismo de linha da célula e os resultados de formação de colônia. Em segundo lugar, é fundamental iniciar o protocolo determinando o IC50 em cada linha da célula individual, desde que as variações podem ocorrer ao usar um novo lote de células. Em terceiro lugar, é essencial para monitorar o que o tratamento medicamentoso é eficaz, verificando as células sob o microscópio frequentemente para que quaisquer erros podem ser detectados rapidamente e corrigidos. Finalmente, recomendamos sempre manter um estoque de etapas intermediárias em caso de contaminação ou problemas inesperados que poderiam afetar a viabilidade das células no meio do protocolo. Importante, o nosso protocolo visa gerar modelos de resistência aos medicamentos, expondo as células de câncer de próstata a altas doses de Docetaxel para 72 h seguido por períodos de tempo de recuperação, em vez de concentrações constantes da droga na tentativa de imitar o melhor clínico cenário relatado para tratamento de câncer de próstata com este agente de taxano15,16.
Além disso, note-se que as células resistentes apresentam uma alta plasticidade, o que pode levar a uma perda progressiva das propriedades de resistência adquirida ao longo do tempo. Portanto, estendendo o uso dessas células para mais de 2-3 meses em cultura não é recomendado. Se uma fonte permanente é necessário é aconselhável gerar continuamente novos lotes de células resistentes. No entanto, se os lotes de células têm sido cultivadas por um tempo prolongado, ensaios de formação de colônia e qPCR podem ser usados para reavaliar sua resistência. Outra alternativa é aumentar a resistência minguante, tratando as células com uma alta dose de Docetaxel para 72 h (500-1.000 nM). Após um período de recuperação de uma a duas semanas, o fenótipo pode ser re-testado por qPCR e colônia formação ensaios. Também é possível, embora não seja recomendado, para armazenar as alíquotas de células tratadas em nitrogênio líquido (em FBS, 10% DMSO). Por favor, note que depois de um ciclo de congelamento e descongelamento, o fenótipo chemoresistance deve sempre ser reavaliado com os métodos acima mencionados.
Apesar dessas limitações, nós28,29 e outros30,31,32,33 foram capazes de empregar com êxito esses sistemas modelo para identificar a chave romance celular e mecanismos moleculares, levando a elevados tumor-iniciando capacidade de sobrevivência da célula e agressividade nas células resistentes ao Docetaxel. Usando estes sistemas de modelo de células de câncer, descobrimos que as células exibem um fenótipo indiferenciado, caracterizado pela ausência de marcadores de diferenciação epitelial e relacionadas com a próstata e a superexpressão de targetable do desenvolvimento (entalhe e Vias de sinalização Hedgehog), sobreviver exposição quimioterápicos28. Em um segundo estudo, usando estes modelos juntamente com os conjuntos de dados de gene paciente publicamente disponível24,25, descobrimos que o fator de transcrição pioneiro GATA2 é altamente overexpressed em metastático resistente a castração células de câncer de próstata resistente a quimioterapia. GATA2 aumenta a sobrevivência das células, ativando diretamente uma quinase a jusante IGF2 dependente sinalização rede29. Notadamente, estes estudos ajudados a identificar novos papéis-chave de GATA2 no câncer de próstata metastático avançado agressividade34.
O desenvolvimento de resistência às drogas é um problema que não está limitado a Docetaxel e câncer de próstata, como é comum entre muitos outros tipos de cancros tratados com uma grande variedade de medicamentos quimioterápicos. Com efeito, aplicam restrições semelhantes sobre a disponibilidade de modelos experimentais, e é concebível que nosso protocolo pode ser adaptado para estudar outros tipos de câncer e seus mecanismos de chemoresistance respectivos.
A geração de células resistentes ao Docetaxel, conforme descrito no presente protocolo pode ser usada como uma ferramenta funcional para identificar mecanismos moleculares e celulares relevantes romance de chemoresistance. Isso abre a porta para encontrar novos destinos, sobre a qual o desenvolvimento de novos tratamentos para câncer de próstata altamente maligno pode articular, mais uma vez empurrando as fronteiras do que sabemos sobre essa doença e como tratar seus pacientes.
The authors have nothing to disclose.
V.R.-B. recebe financiamento do departamento E.U. de saúde & humanos serviços, NIH, National Cancer Institute conceder número 1 K22 CA207458-01 e J.D.-D. recebe financiamento do departamento E.U. de saúde & humanos serviços, NIH, National Cancer Institute conceder número 1 R01 CA207311-01.
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |