Kanser tedavileri için direnç hastalık ilerleme ve ölüm katkıda bulunmaktadır. Direnci mekanik temelleri belirleme terapötik yanıt artırmak için önemlidir. Prostat kanseri (PC) yolları dissekan yardımcı olmak için taxane dayanıklı cep modelleri oluşturmak için protokol Docetaxel direnç PC hastalarda ilerleme dahil bu el yazması ayrıntılar.
Mikrotubul hedefleme ajanları (MTAs) çok çeşitli tümör tedavisinde bir dayanak noktası vardır. Ancak, alınan kemoterapötik ilaçlara hastalık progresyon ortak bir mekanizma ve prognostik belirleyici özelliği Malign tümörlerin dirençtir. Prostat kanseri (PC), taxane Docetaxel gibi MTAs karşı direnç başarısız tedavi gibi bir kötü prognoz ve yüksek mortalite oranları tarafından tanımlanan hastalık ölümcül aşamaları doğru ilerleme belirler. Yıllardır okudu da, Edinsel direnç katkıda mekanizmaları dizi değil tamamen anlaşılır ve böylece bu aşamaları gelişmiş hastalarda faydalı olacağını yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemli bir sınırlama poz hastalık. Bu protokol için biz taklit son aşama prostat kanserinin öldürücü özellikleri ve bu nedenle mekanizmaları incelemek için kullanılan Docetaxel dayanıklı prostat kanseri hücre hatları nesil tarif tarafından alınan hangi chemoresistance doğar. Olası sınırlamalar içsel direnç özellikleri zamanla kaybı gibi bir hücre tabanlı modeline rağmen bu yöntemle üretilen Docetaxel dayanıklı hücre satırları başarıyla son çalışmalarda kullanılan ve ilerlemek için fırsat bizim öldürücü prostat Kanserinde Edinsel chemoresistance moleküler anlayışı.
Hücre döngüsü kontrol kaybına neden nükleer silahların yayılmasına karşı bir artış oranı kanseri1bir özelliğidir. Bu işlev özellik kanser hücrelerinin sırasında S – ve M-hangi çeşitli hücre döngüsü DNA hasar veya Mitotik kusurları neden uyuşturucu perturbing gelişmesine yol açmıştır aşamaları, benzersiz hücre cycle’nın temel süreçleri sadakat bağımlı işler. Motor proteinler, ve Mitotik kinaz inhibitörleri gibi çok sayıda anti-Mitotik aracıları şu anda geliştirilmekte ve klinik olarak test edilmiş olmakla birlikte, eski Mikrotubul hedefleme ajanlar (MTAs) tek klinik olarak onaylanmış yaklaşım için olmaya devam mitoz kanser2,3,4hedefleme. MTAs ya istikrarsızlaştırmak (Vinblastine, Vincristine, Vinorelbine) veya (taxane elde edilen aracıları Paklitaksel, Docetaxel veya Cabazitaxel) mikrotübüller stabilize etmek ve böylece işleyen Mitotik iğ5,6oluşumunu önlemek. Bu ajanlar bir uzun süreli Mitotik tutuklama ve nihai hücre ölümü kültürlü hücreleri9,10 ve Mitotik ekranlarda bulunan tümörler11 iğ derleme denetim noktası7,8, tetik ,12 ve vardır bu nedenle prostat kanseri13kanserleri, aralarında büyük bir çeşitlilik tedavisinde yararlı.
Prostat kanseri tanısı en sık kanser ve kanser önde gelen nedenidir erkekler14ölümle ilgili. Docetaxel gibi antimitotic ajanlar prostat kanseri hastanın hayatta kalma geliştirmek ve bu hastalığı15,16,17tedavisinde bir dayanak noktası vardır. Ne yazık ki ilk tümör büzülme rağmen tümör hücreleri kez tedavisi sırasında ilaç direnci gelişir. Çeşitli Hücresel mekanizmalar deregülasyon apoptotik ve inflamatuar yollar veya harekete geçirmek/overexpression uyuşturucu sızma pompalar ATP-bağlayıcı kaset ışınlama gibi de dahil olmak üzere chemoresistance, gelişimi neden karıştığı olmuştur P-glikoprotein (P-gp/ABCB1), ikincisi olan hücreleri18,19dışına kemoterapötik ajanlar ihracat sonuçlanır. Taxanes direnç de tübülin isotypes veya ilaç ve onun hedef 20,21arasındaki etkileşimi önlemek tübülin mutasyonlar ifade değişiklikler gibi diğer nedenleri ile bağlantılı olmuştur. Ayrıca, direnç genom istikrarsızlık birikimi ve tümör heterojenite22,23ilgili olmuştur. Ancak, katkıda taxane direnç mekanizmaları tamamen, belirgin olduğu görünümünü önlemek tedavi stratejileri yokluğunda tarafından anlaşılır değil. Bu nedenle, bu mekanizmalar diseksiyon içinde yardımcı deneysel modelleri oluşturma ve bu ilaçların direnç gelişimini önlemek yeni tedavi yaklaşımları belirlemek için acil bir ihtiyaç vardır.
Bu makalede biz prostat kanseri hücreleri Docetaxel dayanıklı (DR) oluşturulmasını sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Daha fazla koloni oluşumu deneyleri ve kantitatif RT-PCR kullanarak bu hücreler direnç durumunu doğrulamak nasıl anlatacağım. Bu yöntemle üretilen hücreler kamuya insan tümör örnek veritabanları üzerinde çok çeşitli deneysel deneyleri gerçekleştirmeye çok yönlülük sağlayan yararı ile bulunan moleküler özelliklerinin çoğunu recapitulating avantajı var. süre tümör örnekleri tarafından izin verilenden daha uzun süre. Bu kanser modelleri terapi direnç birçok hafta doku kültürü ve diğer yaklaşımlar arasında için genişletilmiş, genetik olarak manipüle, mikroskobu yöntemler tarafından görüntülenir ve gen ekspresyonu için analiz. Ayrıca, onlar daha fazla tümör oluşumu ve büyüme içinde vivoetkileri analiz farelerde xenotrasplanted olabilir. Şu anda, ilaç direnci prostat kanseri bağlamında incelemek için ana alternatif yöntem tümör örnekleri doğrudan analizidir. Bu örnekler gen ekspresyonu ve verilen tümörlerin mutational durumu hakkında bilgi toplamak için çok güçlü bir sistem mevcut iken, onlara erişim çok sınırlı olabilir ve onlar için başka işlemler ve deneysel analizi, sürdürmek zor olan kolayca bu protokolü24,25ile oluşturulan hücre hatları ile yapılabilir. Hastalardan doğrudan insan türetilmiş organoids nesil bir çok güçlü bir araç ve mevcut yöntemi26,27için alternatif olacaktır gibi önemlisi, gelecekte, alternatif yaklaşımlar. Ne bir tümör onun orijinal ortamında yapıldı bir 3D bağlamda özetlemek, organoids hücre satırları ve insan tümörler arasında mükemmel modeli olabilir. Henüz, bu protokol için açıklanan deneysel hücre modelleri hala daha korumak için uygun fiyatlı ve daha hızlı analiz için uygundur. Bu hücre satırları inceleyerek elde edilen sonuçlar için yaygınlaştırılması ve insan örnekleri ve 3D kültürlerde doğruladı. Bu nedenle, bu iletişim kuralı için bizim iletişim kuralı diğer uyuşturucu ve kanser türleri çalışmaya adapte edilebilir beri chemoresistance mekanizmaları herhangi bir hücre doğrultusunda çalışmaya araştırmacılar hücre modelleri Aradığınız ilgi olabilir. Burada açıklanan yöntemlerden herhangi bir laboratuvar, uygun fiyatlı uygulayın ve ilaç direnci moleküler ve hücresel mekanizmaların ön çalışmalar izin kolaydır.
Bu makale, chemoresistance fenotip edinimi için katkıda mekanizmaları incelenmesi için izin veren Docetaxel dayanıklı prostat kanseri hücre modeli sistemleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım son derece güvenilir ve tekrarlanabilir olmakla birlikte, potansiyel bazı kısıtlamalar dikkate alınmalıdır. Beri sadece hücre toplu nüfusun küçük bir kısmı chemoresistance28sergileyecek, tavsiye edilir hücrelerinin büyük nüfusuyla başlatmak için (genellikle yaklaşık 1.2 x 10 için hesap 20 şişe 150 cm2, plaka8 hücreleri). Protokolü’nün önemli adımlar yordamın başarılı olmasını sağlamak için düşünülmelidir. İlk olarak, taze için uzun vadeli kullanım (10 mM hisse senedi aliquots için yıllar düzgün-80 ° C’de depolanan kullanılabilir) hisse senedi hazırlanan aynı Docetaxel kullanmak çok önemlidir. Aliquot Docetaxel hafif değişiklikler IC50, hücre satırı zamanlama nesil sonuçlarını ve koloni oluşumu sonuçları etkileyebilir. İkinci olarak, varyasyonları hücre yeni bir toplu işlemi kullanarak oluşabilir bu yana her tek hücre doğrultusunda IC50 belirleme Protokolü başlatmak çok önemlidir. Üçüncü olarak, hücrelerin mikroskop altında hataları hızlı bir şekilde algılanabilir ve düzeltilmiş bu yüzden sık sık kontrol ederek uyuşturucu tedavisi etkilidir izlemek için önemlidir. Son olarak, her zaman bir hisse senedi kirlenme veya protokol ortasında hücrelerin canlılık etkileyebilecek beklenmedik sorunlar durumunda ara adımlardan tutmak için önerilir. Önemlisi, bizim iletişim kuralı amaçlayan Docetaxel yüksek dozda 72 h ilacın sürekli düşük konsantrasyonlarda yerine uzun iyileşme dönemleri tarafından bir girişim en iyi taklit etmek için takip için prostat kanser hücrelerinin açarak ilaç direnci modelleri oluşturmak için klinik Bu taxane Ajan15,16ile prostat kanseri tedavisi için senaryo bildirdi.
Ayrıca, bu ilaca dirençli hücreler zamanla Edinsel direnç özellikleri ilerici bir kaybına yol açabilecek bir yüksek plastisite sergi unutulmamalıdır. Bu nedenle, bu hücre kullanımı için 2-3 aydan fazla kültürde genişletme önerilmez. Kalıcı bir tedarik gerekiyorsa, sürekli olarak yeni toplu dayanıklı hücre oluşturmak için tavsiye edilir. Hücreleri toplu halde uzun süre kültürlü, ancak, koloni oluşumu deneyleri ve qPCR direnişleri yeniden değerlendirmek için kullanılabilir. Yüksek doz Docetaxel 72 h (500-1000 nM) için hücrelerle davranarak azalan direnci artırmak için başka bir alternatiftir. Bir iki hafta sonra bir iyileşme döneminde, fenotip qPCR ve koloni oluşumu ile yeniden sınanabilir deneyleri. Her ne kadar aliquots tedavi hücrelerinin sıvı azot (içinde FBS, % 10 DMSO) depolamak için tavsiye edilmez, mümkündür. Donma-çözülme döngüsü sonra chemoresistance fenotip her zaman yukarıda belirtilen yöntemlerle yeniden değerlendirilmesi gerekir olduğunu unutmayın.
Bu uyarılar rağmen biz28,29 ve diğerleri30,31,32,33 başarıyla anahtar roman hücresel tanımlamak için bu modeli sistemleri istihdam başardık ve Moleküler mekanizmalar önde gelen tümör başlatılıyor kapasite, hücre hayatta kalma ve saldırganlık Docetaxel dayanıklı hücrelerdeki yüksek. Bu kanser hücre modeli sistemleri kullanarak, biz bu hücreleri epitel ve prostat ile ilgili ayırt etme belirteçleri yokluğu ve overexpression targetable, gelişimsel ile karakterize bir farklılaşmamış fenotip sergilenmesi keşfetti (çentik ve Kirpi) sinyal yolları, kemoterapötik pozlama28hayatta. İkinci bir çalışmada, bu modeller ile birlikte kamuya hasta gen veri kümeleri24,25, kullanarak biz öncü transkripsiyon faktörü GATA2 son derece içinde metastatik kastrasyon dayanıklı overexpressed da ortaya çıkardı Kemoterapi dayanıklı prostat kanseri hücreleri. GATA2 doğrudan ağ29sinyal bir IGF2 bağlı aşağı akım kinaz aktive ederek hücre yaşama artırır. Özellikle, bu çalışmalar gelişmiş metastatik prostat kanseri saldırganlık34GATA2 roman anahtar rolleri tanımlamak için yardımcı oldu.
Diğer birçok türde bir yelpazeye kemoterapötik ilaçlar ile tedavi kanserler arasında yaygın olduğu gibi ilaç direnci gelişimi Docetaxel ve prostat kanseri, sınırlı değil bir sorundur. Nitekim, deneysel modeller kullanılabilirliği hakkında benzer kısıtlamalar geçerlidir ve bu bizim iletişim kuralı diğer kanser türleri ve onların anılan sıraya göre chemoresistance mekanizmaları çalışmaya adapte edilebilir akla yatkın.
Bu protokol için açıklandığı gibi Docetaxel dayanıklı hücre üretimi chemoresistance roman ilgili moleküler ve hücresel mekanizmaları tanımlamak için işlevsel bir araç kullanılabilir. Bu yeni hedefler, bunun üzerine son derece kötü huylu prostat kanseri için yeni tedavi gelişimi, bir kez daha bu hastalık hakkında ne biliyoruz ve nasıl onun hasta tedavi sınırları iterek ifade bulmak için kapıyı açar.
The authors have nothing to disclose.
V.R.-D. ABD Sağlık Bakanlığı fon alır & İnsan Hizmetleri, NIH, Ulusal Kanser Enstitüsü vermek 1 numaralı K22 CA207458-01 ve J.D.-ö. ABD Sağlık Bakanlığı fon alır & İnsan Hizmetleri, NIH, Ulusal Kanser Enstitüsü vermek 1 numaralı R01 CA207311-01.
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |