抗肿瘤治疗有助于疾病的进展和死亡。确定阻力的机械基础对于改善治疗反应是至关重要的。这份手稿详细的协议, 以产生紫杉抗性细胞模型的前列腺癌 (pc), 以帮助解剖的路径涉及的进展, 多西紫杉醇耐药性的 pc 患者。
微管靶向剂 (mta) 是治疗范围广泛的肿瘤的主干。然而, 获得的抗化疗药物是一种常见的疾病进展机制和预后决定因素的特点恶性肿瘤。在前列腺癌 (PC), 抗 mta, 如紫杉多西紫杉醇规定治疗失败, 以及进展到致命阶段的疾病, 是由一个糟糕的预测和高死亡率的定义。尽管研究了几十年, 但对后天抵抗的一系列机制还没有完全理解, 因此对新的治疗策略的发展有很大的限制, 这些战略可以使患者在这些先进阶段受益。疾病.在本议定书中, 我们描述了一代多西紫杉醇耐药前列腺癌细胞系模仿晚期前列腺癌的致命特征, 因此可以用来研究的机制, 获得化疗产生。尽管细胞模型存在潜在的局限性, 如随着时间的推移阻力特性的丧失, 这种方法所产生的多西紫杉醇抗性细胞系已经成功地应用于最近的研究中, 并提供了促进我们在致命的前列腺癌中获得化疗的分子理解。
细胞周期控制的丢失导致的增殖率增加是癌症的一个标志1。这种功能性的特性使癌细胞在 s-和 M 阶段的细胞周期的关键过程中具有独特的依赖性, 从而导致了各种细胞周期扰动药物的形成, 引起 DNA 损伤或有丝分裂缺陷。虽然许多 anti-mitotic 剂, 如有丝分裂激酶或运动蛋白抑制剂, 目前正在开发和测试的临床试验, 传统微管靶向剂 (mta) 继续是唯一的临床认可的方法靶向肿瘤有丝分裂2,3,4。mta 不稳定 (长春, 长春碱, 长春瑞滨) 或稳定性 (紫杉衍生的药物紫杉醇, 多西紫杉醇或 Cabazitaxel) 微管, 从而防止形成一个功能分裂纺锤5,6。这些代理触发主轴组件检查点7,8, 这会导致培养细胞中的有丝分裂停止和最终细胞死亡9,10和肿瘤中的有丝分裂缺陷11 ,12 , 因此对治疗多种癌症非常有用, 其中前列腺癌的患者有13。
前列腺癌是最常见的癌症, 是导致男性癌症相关死亡的主要原因14。多西紫杉醇等有丝分裂剂改善前列腺癌患者的生存率, 是治疗本病的主要15,16,17。不幸的是, 尽管最初的肿瘤萎缩, 肿瘤细胞往往发展抗药性在治疗期间。一些细胞机制已经牵连到导致化疗的发展, 包括解除对凋亡和炎症通路的放松, 或像 ATP 结合盒式转运器的药物外排泵的活化/过度表达p-糖蛋白 (P-gp/ABCB1), 后者的结果是输出的化疗药物的细胞18,19。对紫杉的抗性也与其他原因相关, 如蛋白 isotypes 或蛋白突变表达的变化, 这就阻止了药物与其目标2021之间的交互。此外, 抗病性一直与基因组不稳定积累和肿瘤非均质22,23有关。然而, 导致紫杉抵抗的机制还没有完全被理解, 因为缺乏治疗策略来防止其出现。因此, 迫切需要产生实验模型, 协助解剖这些机制, 并确定新的治疗方法, 防止对这些药物的抗药性的发展。
在这篇文章中, 我们描述了一种方法, 允许产生多西紫杉醇耐药 (DR) 前列腺癌细胞。我们将进一步描述如何通过菌落形成检测和定量 rt-pcr 来验证这些细胞的抗性状态。这种方法产生的细胞具有综述的优势, 可以在公开提供的人类肿瘤样本数据库中发现许多分子特征, 并增加了提供多功能性以进行多种实验分析的好处。比肿瘤标本所允许的时间长。这些癌症模型的治疗耐药性可以扩展许多周的组织培养, 并在其他方法, 可以遗传操作, 可视化的显微镜方法和分析的基因表达。此外, 它们还可以在小鼠体内xenotrasplanted, 进一步分析肿瘤的形成和生长的作用。目前, 研究前列腺癌耐药性的主要替代方法是直接分析肿瘤标本。虽然这些样本提供了一个非常强大的系统收集有关基因表达和突变状态的特定肿瘤的信息, 他们的访问可能是非常有限的, 他们很难保持进一步的操纵和实验分析,可以很容易地用此协议生成的单元格行24,25。重要的是, 在未来, 替代方法, 如人类衍生 organoids 直接从病人的生成将是一个非常强大的工具和替代目前的方法26,27。因为他们将在3D 的背景下重述肿瘤在其原始环境中的情况, organoids 将是细胞系和人类肿瘤之间的完美模型。然而, 本协议中所描述的实验性细胞模型仍然更能维持并适于更快的分析。通过研究这些细胞系的结果可以推断和证实在人类样本和3D 文化。因此, 这项协议可能是感兴趣的研究人员寻求细胞模型研究化疗机制在任何细胞系, 因为我们的协议可以适应研究的其他药物和癌症类型。这里描述的方法很容易应用于任何实验室, 价格适中, 并允许对耐药性分子和细胞机制的初步研究。
在这篇手稿中, 我们描述了一种方法来产生多西紫杉醇耐药的前列腺癌细胞模型系统, 允许研究的机制, 有助于获得化疗表型。虽然这种方法是高度可靠和可重复性的, 但应该考虑一些潜在的限制。由于只有一小部分的细胞的大部分人口将展出化疗28, 建议开始与大量的细胞 (我们通常板20烧瓶150厘米2, 占约 1.2 x 108细胞)。应考虑该议定书的关键步骤, 以确保程序的成功。首先, 这是非常重要的使用相同的多西紫杉醇新鲜准备的股票长期使用 (10 毫米股票等分可用于多年时, 储存在适当的-80 ° c)。多西紫杉醇分的微小变化会影响 IC50 的结果、细胞线定时的生成和菌落形成的结果。其次, 在每个单独的单元格中开始确定 IC50 的协议是至关重要的, 因为在使用新的一批单元格时可能会发生变化。第三, 监测药物治疗的有效性, 必须经常检查显微镜下的细胞, 以便及时发现和纠正任何错误。最后, 我们建议始终保持一股中间步骤的情况下, 污染或意想不到的问题, 可能会影响细胞的生存能力在协议的中间。重要的是, 我们的协议的目的是产生耐药性的模式, 通过暴露前列腺癌细胞的高剂量多西紫杉醇72小时后, 长期恢复期, 而不是较低的恒定浓度的药物试图模仿最好的临床使用此紫杉代理15,16进行前列腺癌治疗的情况报告。
此外, 应该指出, 耐药细胞表现出很高的可塑性, 这可能导致逐渐丧失获得的耐药性的特性随着时间的推移。因此, 不建议在文化中延长这些细胞的使用超过2-3 月。如果需要永久性的供应, 最好不断地生成新的抗性细胞。然而, 如果大量的细胞被培养了很长时间, 菌落形成分析和 qPCR 可以用来重新评估他们的抵抗力。另一种方法是通过对72小时 (500-1, 000 nM) 高剂量多西紫杉醇的细胞进行治疗, 从而提高抗衰退性。经过一、两周的恢复期后, qPCR 和菌落形成分析可重新表型。也有可能, 虽然不建议, 储存等分的处理细胞在液氮 (在 FBS, 10% 亚甲基亚砜)。请注意, 在冻融循环后, 化疗表型应始终用上述方法进行重新评估。
尽管有这些警告, 我们28、29和其他30、31、32、33都能够成功地使用这些模型系统来识别关键的新型蜂窝和分子机制导致肿瘤启动能力升高, 细胞存活, 多西紫杉醇耐药细胞的侵袭性。利用这些癌细胞模型系统, 我们发现细胞表现出未分化的表型, 特征是缺乏上皮和前列腺相关的分化标记和过度表达的可发育 (缺口和刺猬) 信号通路, 生存化疗暴露28。在第二项研究中, 使用这些模型与公开提供的患者基因数据集24,25, 我们发现先驱转录因子 GATA2 是高度表达的转移性去势耐药性抗化疗的前列腺癌细胞。GATA2 通过直接激活 IGF2-dependent 下游激酶信号网络29来提高细胞的存活率。值得注意的是, 这些研究有助于鉴别 GATA2 在晚期转移性前列腺癌中的新的关键作用34。
耐药性的发展是一个不限于多西紫杉醇和前列腺癌的问题, 因为它在许多其他类型的癌症治疗中普遍存在, 包括多种化疗药物。实际上, 对实验模型的可用性也有类似的限制, 可以想象, 我们的协议可用于研究其他癌症类型及其各自的化疗机制。
本协议所述的多西紫杉醇耐药细胞的生成可作为一种功能性工具, 用于鉴别化疗的相关分子和细胞机制。这为寻找新的目标打开了大门, 对高恶性前列腺癌的新治疗方法的发展可能会阐明, 再次推动我们对这种疾病的了解, 以及我们如何治疗病人的界限。
The authors have nothing to disclose.
检定规程 B。接受美国卫生部和 #38 的资助; 人类服务, NIH, 国家癌症研究所赠款 1 K22 CA207458-01 和法学博士。接受美国卫生部和 #38 的资助; 人类服务, NIH, 国家癌症研究所赠款 1 R01 CA207311-01。
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |