Résistance aux traitements anticancéreux contribue à la mort et de la progression de la maladie. Déterminer les bases mécanistiques de résistance est cruciale pour améliorer la réponse thérapeutique. Détails de ce manuscrit le protocole pour produire des modèles de taxane résistant aux cellules de cancer de la prostate (PC) pour aider à disséquer les voies impliqué dans la progression vers la résistance de docétaxel chez les patients de PC.
Agents de ciblage de microtubules (MTA) sont un pilier dans le traitement d’un large éventail de tumeurs. Cependant, la résistance acquise aux médicaments chimiothérapeutiques est un mécanisme commun de progression de la maladie et un élément déterminant pronostique des tumeurs malignes. Cancer de la prostate (PC), résistance aux MTA comme le taxane Docetaxel dicte un échec thérapeutique mais aussi de progression vers les stades létales de maladie qui sont définis par un mauvais pronostic et taux de mortalité élevés. Bien qu’étudié pendant des décennies, l’éventail des mécanismes qui contribuent à l’acquisition de la résistance ne sont pas complètement comprises et pose ainsi une limitation importante à l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient bénéficier des patients dans ces avancées des stades de maladie. Dans ce protocole, nous décrivons la génération de Docetaxel résistant aux lignées cellulaires de cancer de la prostate qui simulent les caractéristiques mortelles de cancer de la prostate de stade avancé et peut donc servir à étudier les mécanismes par lequel chimiorésistance acquis se pose. Malgré les limites potentielles inhérentes à un modèle de cellule en fonction, comme la perte des propriétés de résistance au fil du temps, les lignées de cellules résistant au docétaxel produites par cette méthode ont été utilisées avec succès dans des études récentes et offrent la possibilité de faire progresser notre compréhension moléculaire de chimiorésistance acquise en cancer de la prostate létal.
Une augmentation du taux de prolifération causé par la perte de contrôle du cycle cellulaire est une caractéristique de cancer1. Cette propriété fonctionnelle rend les cellules cancéreuses unique dépend de la fidélité des principaux processus du cycle cellulaire pendant S-M-phases et, qui a conduit à l’élaboration de divers cycle cellulaire perturbant les drogues qui induisent des lésions de l’ADN ou des anomalies mitotiques. Bien que de nombreux agents anti mitotiques, comme inhibiteurs de kinases mitotiques ou protéines motrices, sont actuellement développés et testés dans des essais cliniques, les agents de ciblage microtubule hérités (MTA) continuent d’être la seule approche cliniquement approuvée pour ciblage de mitose dans cancer2,3,4. MTA soit déstabilisent (Vinblastine, Vincristine, Vinorelbine) ou stabilisent les microtubules (dérivé de taxane agents Paclitaxel, le docétaxel ou Cabazitaxel) et éviter ainsi la formation d’un fuseau mitotique fonctionnement5,6. Ces agents déclenchent l’axe Assemblée checkpoint7,8, qui se traduit par un arrêt mitotique prolongée et l’éventuelle apoptose dans des cellules cultivées9,10 et anomalies mitotiques dans les tumeurs11 ,12 et sont donc utile pour traiter une grande variété de cancers, notamment cancer de la prostate,13.
Cancer de la prostate est le plus fréquemment diagnostiqué le cancer et des principales causes de cancer associés décès chez les hommes,14. Les agents antimitotiques Docetaxel améliorer la survie du patient de cancer de la prostate et sont un pilier dans le traitement de cette maladie15,16,17. Malheureusement, malgré le rétrécissement de la tumeur primitive, les cellules tumorales développent souvent la résistance aux médicaments au cours du traitement. Plusieurs mécanismes cellulaires ont été impliqués dans l’apparition de l’élaboration de chimiorésistance, y compris la déréglementation de l’apoptose et de la cascade inflammatoire ou activation/surexpression de pompes d’efflux drogues comme transporteur ATP-binding cassette P-glycoprotéine (P-gp/ABCB1), laquelle se traduit par l’exportation des chimiothérapies sur les cellules18,19. Résistance aux taxanes a également été associée avec d’autres causes, tels que les changements dans l’expression de la tubuline isotypes ou mutations de tubuline, empêchant l’interaction entre le médicament et sa cible 20,21. En outre, la résistance est liée à l’accumulation d’instabilité du génome et tumeur hétérogénéité22,23. Cependant, les mécanismes qui contribuent à la résistance de taxanes ne sont pas complètement élucidés, qui est évident par l’absence de stratégies thérapeutiques qui empêchent son apparence. Par conséquent, il y a un besoin urgent pour générer des modèles expérimentaux qui aident dans la dissection de ces mécanismes et d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques qui empêchent le développement de la résistance à ces médicaments.
Dans cet article, nous décrivons une méthode qui permet la génération de Docetaxel-résistant (DR) des cellules de cancer de la prostate. Nous décrirons plus loin comment valider l’état de résistance de ces cellules à l’aide de tests de formation de colonie et RT-PCR quantitative. Les cellules produites par cette méthode ont l’avantage de reprenant de nombreuses caractéristiques moléculaires dans les bases de données accessibles au public tumorales humaines avec l’avantage de fournir la polyvalence pour effectuer une grande variété d’essais expérimentaux sur plus longues périodes de temps que permise par des échantillons de tumeur. Ces modèles de cancer de la résistance de la thérapie peuvent être étendues pendant plusieurs semaines en culture de tissus et parmi les approches, peuvent être génétiquement manipulés, visualisées par des méthodes de microscopie et analysés pour l’expression des gènes. En outre, ils peuvent être xenotrasplanted chez les souris pour poursuivre l’analyse des effets de de formation et la croissance tumorale in vivo. Actuellement, la principale méthode alternative pour étudier la résistance aux médicaments dans le cadre du cancer de la prostate est l’analyse directe des échantillons de tumeur. Tandis que ces échantillons présentent un système très puissant pour recueillir des informations sur l’expression génique et statut mutationnel des tumeurs donnés, leur accès peut être très limité, et ils sont difficiles à maintenir pour des manipulations supplémentaires et analyse expérimentale, qui peut facilement être fait avec les lignées de cellules générées avec ce protocole24,25. Ce qui est important, à l’avenir, d’autres approches telles que la génération d’humains organoïdes dérivées directement des patients serait un outil très puissant et une alternative à l’actuelle méthode26,27. Ils récapitulera dans un contexte 3D ce qu’une tumeur était dans son milieu d’origine, organoïdes sera le modèle parfait entre les lignées de cellules et de tumeurs humaines. Pourtant, les modèles de cellule expérimentale décrites dans le présent protocole sont encore plus abordables pour les maintenir et d’analyse plus rapide. Les résultats obtenus par l’étude de ces lignées cellulaires peuvent être extrapolés à et corroborés dans des échantillons humains et cultures 3D. Par conséquent, le présent protocole peut-être être d’intérêt pour les chercheurs qui cherchent des modèles cellulaires afin d’étudier les mécanismes de la chimiorésistance dans n’importe quelle ligne de la cellule, car notre protocole peut être adapté à l’étude d’autres médicaments et les types de cancer. Les méthodes décrites ici sont faciles à appliquer dans n’importe quel laboratoire, abordable et permettent des études préliminaires des mécanismes moléculaires et cellulaires de la pharmacorésistance.
Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode pour générer des systèmes de modèles résistant au Docetaxel cancer de la prostate cellulaire qui permet l’étude des mécanismes qui contribuent à l’acquisition du phénotype chimiorésistance. Alors que cette approche est très fiable et reproductible, il faudrait quelques limitations potentielles. Depuis seulement une petite fraction de la population en masse de cellules exposera chimiorésistance28, il est recommandé de commencer avec une grande population de cellules (nous plaque généralement de 20 doses de 150 cm2, qui représentent environ 1,2 x 108 cellules). Les étapes clés du protocole devraient considérer pour assurer le succès de la procédure. Tout d’abord, il est très important d’utiliser le docétaxel même fraîchement préparé stock pour l’utilisation de long terme (stock de 10 mM aliquotes peuvent être utilisés pour les années lorsque stocké correctement dans à-80 ° C). Légers changements dans l’aliquote de docétaxel peuvent influer les résultats de la CI50, génération du moment où la ligne cellulaire et les résultats de la formation de colonie. Deuxièmement, il est crucial de commencer le protocole de détermination de la CI50 dans chaque ligne de la cellule individuelle, car les variations peuvent se produire lorsque vous utilisez un nouveau lot de cellules. En troisième lieu, il est essentiel de surveiller que le traitement de la toxicomanie est efficace en contrôlant les cellules au microscope fréquemment afin que toutes les erreurs peuvent être détectées rapidement et corrigées. Enfin, nous vous recommandons de toujours garder un stock d’étapes intermédiaires en cas de contamination ou de problèmes inattendus qui pourraient influer sur la viabilité des cellules au milieu du protocole. Important, notre protocole vise à produire des modèles de la pharmacorésistance en exposant des cellules de cancer de la prostate à des doses élevées de Docetaxel pendant 72 h, suivie de périodes de récupération long, plutôt que des concentrations plus faibles de constantes de la drogue dans une tentative d’imiter le meilleur clinique scénario a indiqué pour le traitement du cancer de la prostate avec ce taxane agent15,16.
En outre, il convient de noter que les cellules résistantes aux médicaments présentent une grande plasticité, qui peut conduire à une perte progressive des propriétés de résistance acquise au fil du temps. Par conséquent, l’extension de l’utilisation de ces cellules pour plus de 2-3 mois de culture n’est pas recommandé. Si un approvisionnement permanent est nécessaire il est recommandé de générer continuellement des nouveaux lots de cellules résistantes. Toutefois, si des lots de cellules ont été cultivés pendant une période prolongée, colonie formation essais et qPCR permet de réévaluer leur résistance. Une autre alternative consiste à accroître la résistance décroissante en traitant les cellules avec une forte dose de docétaxel pendant 72 h (500-1 000 nM). Après une période de récupération d’une à deux semaines, le phénotype peut être re-testé par formation de qPCR et colonie des essais. Il est également possible, bien que non recommandé, pour stocker les aliquotes de cellules traitées dans l’azote liquide (en BF, 10 % DMSO). Veuillez noter qu’après un cycle de gel-dégel, le phénotype de chimiorésistance devrait toujours être réévalué avec les méthodes susmentionnées.
Malgré ces mises en garde, nous avons28,29 et autres30,31,32,,33 ont été en mesure d’employer correctement ces systèmes modèles pour identifier la clé roman cellulaire et mécanismes moléculaires conduisant à élevé déclenchant les tumeur capacité, la survie des cellules et agressivité chez les cellules résistantes au Docetaxel. En utilisant ces systèmes de modèle de cellules de cancer, nous avons découvert que les cellules présentant un phénotype non différencié, caractérisé par l’absence de marqueurs de différenciation épithéliale et liés à la prostate et de la surexpression de targetable développementale (encoche et Voies de signalisation de hérisson), survivre exposition chimiothérapeutiques28. Dans une seconde étude, en utilisant ces modèles avec gène patients accessibles au public des ensembles de données24,25, nous avons découvert que le facteur de transcription pionnier GATA2 est fortement surexprimé dans métastatique résistant à la castration cellules de cancer de la prostate résistant à la chimiothérapie. GATA2 augmente la survie des cellules en activant directement une kinase en aval IGF2-dépendante de signalisation réseau29. Notamment, ces études ont permis d’identifier de nouveaux rôles clés de GATA2 dans le cancer de la prostate métastatique avancé agressivité34.
Le développement de la résistance aux médicaments est un problème qui n’est pas limité à Docetaxel et cancer de la prostate, car il est répandue parmi beaucoup d’autres types de cancers traités avec un large éventail de médicaments chimiothérapiques. En effet, les restrictions semblables sur la disponibilité de modèles expérimentaux, et il est concevable que notre protocole peut être adaptée pour étudier d’autres types de cancer et de leurs mécanismes respectifs chimiorésistance.
La génération de cellules résistantes au Docetaxel, tel que décrit dans le présent protocole peut servir comme un outil fonctionnel pour identifier de nouveaux mécanismes moléculaires et cellulaires de la chimiorésistance. Cela ouvre la voie à la recherche de nouvelles cibles, sur lequel le développement de nouveaux traitements pour le cancer de la prostate très malin pourrait articuler, repoussant une fois de plus les limites de ce que nous savons sur cette maladie et la manière de traiter ses patients.
The authors have nothing to disclose.
V.R.-B. est financé par le U.S. Department of Health & Human Services, NIH, National Cancer Institute accordez numéro 1 K22 CA207458-01 et J.D.-D. reçoit un financement du U.S. Department of Health & Human Services, NIH, National Cancer Institute accordez numéro 1 R01 CA207311-01.
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |