עמידות לטיפולים בסרטן תורמת התקדמות המחלה והמוות. קביעת את הפסיכולוגי מכניסטית של ההתנגדות היא קריטית לשיפור תגובה טיפולית. כתב היד הזה פרטים הפרוטוקול ליצירת תאים עמידים taxane מודלים של סרטן הערמונית (PC) כדי לעזור לנתח את המסלולים מעורבים סדר דוסטקסול ההתנגדות בחולים PC.
Microtubule מיקוד סוכנים (MTAs) הם עמוד התווך בטיפול של מגוון רחב של גידולים. עם זאת, ההתנגדות רכשה תרופות כימותרפיות הוא מנגנון משותף של התקדמות המחלה, תכונה prognostic-דטרמיננטה של גידולים ממאירים. ב סרטן הערמונית (PC), עמידות MTAs כגון taxane דוסטקסול מכתיב כישלון הטיפול, כמו גם התקדמות לקראת שלבי קטלני המחלה המוגדרות על-ידי פרוגנוזה ושיעורי תמותה גבוהה. למרות למד במשך עשרות שנים, המערך של המנגנונים תורם ההתנגדות רכשה אינה מובנת לחלוטין, ובכך להוות מגבלה משמעותית להתפתחות של אסטרטגיות טיפוליות חדשות יכול להועיל לחולים אלה מתקדמים בשלבים של המחלה. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הדור של שורות תאים עמידים דוסטקסול סרטן הערמונית לחקות תכונות קטלני של סרטן הערמונית בשלב מאוחר, ולכן יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים מאת chemoresistance הנרכש אשר נשאלת. למרות מגבלות פוטנציאל מהותי מודל תא מבוסס, כגון האובדן של מאפייני עמידות לאורך זמן, הקווים תא דוסטקסול עמיד המיוצר על ידי שיטה זו שימשו בהצלחה במחקרים אחרונים ומציעים הזדמנות לקדם את שלנו הבנה מולקולרית של chemoresistance רכשה בסרטן ערמונית קטלני.
שיעור מוגבר של התפשטות הנגרמת על ידי השליטה מחזור התא מהווה סימן היכר של סרטן1. מלון פונקציונלי זה מעבד תאים סרטניים תלויות באופן ייחודי הנאמנות של תהליכים מרכזיים של מחזור התא במהלך S – ו M-שלבים, אשר הובילה להתפתחות של מחזור התא השונים perturbing תרופות יגרמו נזק לדנ א או פגמים mitotic. למרות אינספור גורמים אנטי mitotic, כמו מעכבי של mitotic kinases או חלבונים מוטוריים, כעת בשלבי פיתוח של ניסויים קליניים שנבדקו ב, סוכנים מיקוד microtubule מהדור הקודם (MTAs) להמשיך להיות הגישה רפואית אישרה רק עבור פילוח מיטוזה סרטן-2,–3,–4. MTAs או יציבות (Vinblastine, Vincristine, Vinorelbine) או לייצב microtubules (נגזר taxane סוכנים פקליטקסל, דוסטקסול או Cabazitaxel), ובכך למנוע היווצרות של תפקוד פלך mitotic5,6. סוכנים אלה לעורר את ציר הרכבה מחסום7,8, אשר תוצאות מעצר mitotic ממושך ולאחר מות תאים בסופו של דבר תאים בתרבית9,10 , פגמים mitotic גידולים11 ,12 והם ולכן יעיל לטיפול במגוון גדול של סוגי סרטן, ביניהם סרטן הערמונית13.
לעתים קרובות ביותר אובחן סרטן הערמונית סרטן, הסיבה המובילה של סרטן הקשורים מקרי מוות בקרב גברים14. סוכני antimitotic כגון דוסטקסול לשפר את ההישרדות של סרטן הערמונית החולה, עמוד התווך בטיפול של16,15,זו מחלה17. למרבה הצער, למרות הצטמקות הגידול הראשוני, תאים סרטניים לעתים קרובות לפתח עמידות לתרופות במהלך הטיפול. המנגנונים התאיים מספר היו מעורבים בגרימת ההתפתחות של chemoresistance, כולל הסרת הפיקוח של מוות מסלולים דלקתית או הפעלה/ביטוי של משאבות בזרימת סמים כמו המשגר קלטת מחייב ATP P-גליקופרוטאין (P-gp/ABCB1), הצופות על תוצאות הייצוא של כימותרפיות סוכנים מחוץ תאים18,19. התנגדות taxanes כבר מקושר גם עם גורמים אחרים, כגון שינויים בביטוי של טובולין isotypes או מוטציות טובולין, למנוע את האינטראקציה בין התרופה שלה 20,מטרה21. יתר על כן, ההתנגדות קשורה להצטברות יציבות הגנום ואת הגידול הטרוגניות22,23. עם זאת, המנגנונים תורם taxane ההתנגדות הם אינה מובנת לחלוטין, אשר מתבטא בהעדרה של אסטרטגיות טיפוליות המונעות את המראה שלה. לכן, יש צורך דחוף לייצר גרסאות ניסיוניות לסייע הקרע של מנגנונים אלה, וכן לזיהוי רומן גישות טיפוליות, למנוע ההתפתחות של עמידות לתרופות אלה.
במאמר זה אנו מתארים שיטה המאפשרת הדור של דוסטקסול עמידים (ד ר) תאים סרטניים בערמונית. בהמשך נתאר כיצד לאמת את מצב ההתנגדות של תאים אלה באמצעות מבחני היווצרות המושבה ו- RT-PCR כמותי. התאים המיוצרים על ידי שיטה זו יש את היתרון של recapitulating רבות מהתכונות מולקולרית נמצאו מסדי נתונים לדוגמה גידול אנושי זמין לציבור עם מוסף של מתן צדדיות כדי לבצע מגוון רחב של מבחני ניסיוני מעל תקופות זמן ארוכות יותר מזו שמותרת על ידי דגימות הגידול. מודלים אלה סרטן ההתנגדות טיפול יכול להיות מורחבת במשך שבועות רבים בתרבות רקמה, ובין גישות אחרות, יכול להיות גנטית מניפולציות, דמיינו ידי מיקרוסקופ שיטות וניתח על ביטוי גנים. יתר על כן, הם יכולים להיות xenotrasplanted בעכברים לנתח עוד אפקטים ב הגידול היווצרות וצמיחה בתוך vivo. כיום, השיטה החלופית העיקרית ללמוד תרופתיים בהקשר של סרטן הערמונית הוא ניתוח ישירה של דגימות הגידול. בזמן דגימות אלה להציג מערכת מאוד חזק כדי לאסוף מידע על ביטוי גנים ומצב mutational של גידולים נתון, גישה אליהם יכול להיות מוגבל מאוד והם קשה לשמור על מניפולציות נוספות וניתוח ניסיוני, אשר בקלות ניתן לעשות עם הקווים התא שנוצר עם זה פרוטוקול24,25. חשוב לציין, בעתיד, חלופה ניגש כמו הדור של האדם נגזר organoids ישירות מחולים להיות כלי רב עוצמה, אלטרנטיבה בהווה השיטה26,27. מאז, מסכם את הם הדברים בהקשר תלת-ממד איזה גידול היה לסביבתו המקורי organoids יהיה הדגם המושלם בין שורות תאים אנושיים גידולים. ובכל זאת, הדגמים תא ניסיוני שמתואר פרוטוקול זה הם סבירים כדי לשמור על עוד יותר ומתאים ניתוח מהיר יותר. התוצאות המתקבלות על ידי לימוד אלה שורות תאים יכולים להיות אקסטרפולציה, לאשר דגימות האנושי ובתרבויות תלת-ממד. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות מעניין עבור חוקרים המבקשים תא מודלים ללמוד מנגנונים chemoresistance בתור כל תא, שכן פרוטוקול שלנו ניתן להתאים המחקר של סמים, סוגי סרטן אחרים. השיטות המתוארות כאן בקרבת להחיל במעבדה כלשהי, סביר ולאפשר מחקרים ראשוניים של המנגנונים המולקולריים הסלולר של עמידות לתרופות.
כתב יד זה, אנו מתארים שיטה להפקת דוסטקסול עמידים סרטן הערמונית תאים דגם מערכות המאפשר חקר המנגנונים תורם רכישת פנוטיפ chemoresistance. אמנם גישה זו לשחזור ואמין מאוד, יש לקחת בחשבון כמה מגבלות אפשריות. מאז רק חלק קטן מהאוכלוסייה בכמות גדולה של תאים תערוכת chemoresistance28, מומלץ להתחיל עם אוכלוסיה גדולה של תאים (אנחנו בדרך כלל צלחת 20 צלוחיות של 150 ס מ2, המהוות כ 1.2 x 108 תאים). השלבים החשובים של הפרוטוקול להתייחס כדי להבטיח הצלחה של ההליך. ראשית, חשוב מאוד להשתמש את דוסטקסול אותה טריה מניות עבור שימוש לטווח ארוך (המניות 10 מ מ aliquots יכול לשמש עבור השנים בהן מאוחסנים כראוי ב- 80 ° C). שינויים קלים ב- דוסטקסול aliquot יכולים להשפיע את התוצאות של IC50, דור של התזמון קו תא ואת התוצאות היווצרות המושבה. שנית, זה הכרחי להפעיל את פרוטוקול הקובע את IC50 בכל שורה תא בודד, מאז וריאציות יכולות להתרחש בעת שימוש אוסף חדש של תאים. שלישית, זה חיוני כדי לפקח כי הטיפול בסמים הוא יעיל על-ידי בדיקת תאים במיקרוסקופ לעתים קרובות כך שגיאות במהירות ועוזרת מתוקן. לבסוף, אנו ממליצים לשמור תמיד על מלאי של שלבי הביניים במקרה של זיהום או בעיות בלתי צפויות, העלולה להשפיע על הכדאיות של התאים באמצע הפרוטוקול. חשוב, פרוטוקול שלנו שואפת ליצור מודלים של עמידות לתרופות על ידי חשיפת סרטן הערמונית תאים מינונים גבוהים של דוסטקסול עבור 72 h ואחריו תקופות החלמה ארוכה, במקום קבוע ריכוז נמוך יותר של הסם בניסיון לחקות את הטוב ביותר קליני תרחיש דיווח לטיפול בסרטן הערמונית עם זה taxane15,של הסוכן16.
בנוסף, יצוין כי תאים עמידים לתרופות התערוכה של פלסטיות גבוהה, דבר שעלול להוביל אובדן הדרגתי של מאפייני ההתנגדות רכשה לאורך זמן. לכן, הרחבת השימוש של תאים אלה עבור יותר מ 2-3 חודשים בתרבות אינו מומלץ. אם אספקת נחוצה, מומלץ ליצור באופן רציף חדש קבוצות של תאים עמידים. עם זאת, אם יש כבר תרבותי אצוות של תאים למשך זמן ממושך, מבחני היווצרות המושבה, qPCR יכול לשמש כדי להעריך מחדש את ההתנגדות שלהם. אלטרנטיבה אחרת היא להגביר את ההתנגדות המתמעט על ידי טיפול תאי עם מינון גבוה של דוסטקסול עבור 72 h (500-1, 000 ננומטר). לאחר תקופה של התאוששות של שבוע עד שבועיים, פנוטיפ יכול מחדש להיבדק על ידי היווצרות qPCR והמושבה מבחני. זה גם אפשרי, אם כי לא מומלץ, כדי לאחסן את aliquots של תאים שטופלו בחנקן נוזלי (ב FBS, דימתיל סולפוקסיד 10%). אנא שימו לב כי לאחר מחזור הפשרת ההקפאה, פנוטיפ chemoresistance צריך תמיד להיות הערכה מחדש עם השיטות דלעיל.
למרות אזהרות אלו, אנו28,29 ועוד30,31,32,33 הצליחו בהצלחה להעסיק המערכות מודל לזהות הסלולר מפתח רומן, מנגנונים מולקולריים המוביל גבוהות הגידול. מתחילה יכולת הישרדות cell, תוקפנות תאים עמידים דוסטקסול. באמצעות מערכות דגם אלה סרטן התא, גילינו שתאים מפגין פנוטיפ מובחן, המאופיינת על ידי היעדר בידול אפיתל, הקשורות הערמונית סמני והפיתוחים ביטוי של targetable (דרגה, קיפוד) איתות המסלולים, לשרוד חשיפה כימותרפיות28. במחקר השני, באמצעות מודלים אלה יחד עם הגן החולה זמין לציבור ערכות נתונים24,25, גילינו כי הגורם שעתוק פיוניר GATA2 הוא מאוד overexpressed ב גרורתי סירוס עמידים כימותרפיה-עמיד סרטן הערמונית תאים. GATA2 מגבירה את הישרדותם של תאים על ידי הפעלת ישירות קינאז במורד הזרם תלוי-IGF2 איתות ברשת29. ראוי לציין, מחקרים אלה עזר לזיהוי בתפקידי מפתח רומן של GATA2 סרטן הערמונית גרורתי מתקדם תוקפנות34.
ההתפתחות של עמידות לתרופות היא בעיה שאינה מוגבלת דוסטקסול סרטן הערמונית, כפי שהוא נפוץ בין סוגים רבים אחרים של סרטן שטופלו עם מגוון רחב של תרופות כימותרפיות. אכן, להחיל מגבלות דומות על הזמינות של גרסאות ניסיוניות, זה מתקבל על הדעת כי הפרוטוקול שלנו ניתן להתאים ללמוד סוגי סרטן אחרים ומנגנונים chemoresistance המתאימים שלהם.
הדור של תאים עמידים דוסטקסול כפי שמתואר פרוטוקול זה יכול לשמש ככלי פונקציונלי לזהות את הרומן הרלוונטיים מולקולרית, תאית מנגנונים של chemoresistance. פעולה זו פותחת את הדלת למציאת מטרות חדשות, שעליו לפיתוח טיפולים חדשים עבור סרטן הערמונית ממאיר מאוד עשוי לבטא, עוד פעם למתוח את הגבולות של מה אנחנו יודעים על המחלה הזו, איך אנחנו מתייחסים מטופליו.
The authors have nothing to disclose.
V.R.-בי מקבל מימון ממשרד הבריאות בארה ב & אדם שירותי, NIH, מכון הסרטן הלאומי מעניק מספר 1 K22 CA207458-01, ג’יי-די מקבל מימון בארה ב & אדם שירותי, NIH, מכון הסרטן הלאומי מעניק מספר 1 R01 CA207311-01.
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |