Motstand mot kreft terapi bidrar til sykdomsprogresjon og død. Avgjøre mekanistisk grunnlaget motstand er avgjørende for å forbedre terapeutiske svar. Dette manuskriptet detaljer protokollen for å generere taxane-resistente celle modeller av prostatakreft (PC) å dissekere veier involvert i progresjon til Docetaxel motstand i PC pasienter.
Microtubule målretting agenter (MTAs) er en bærebjelke i behandlingen av en rekke svulster. Ervervet motstand mot cellegifter er imidlertid en vanlig mekanisme av sykdomsprogresjon og Prognostisk-determinant kjennetegner ondsinnethet svulst. I prostatakreft (PC) dikterer motstand mot MTAs som taxane Docetaxel behandling feil samt progresjon mot dødelige stadier av sykdom som er definert av en dårlig prognose og høy dødelighet. Men studerte i flere tiår, en rekke mekanismer bidra til ervervet motstand er ikke fullstendig forstått, og dermed utgjør en vesentlig unntak til utvikling av nye strategier som kan nytte pasientene i disse avanserte stadier av sykdom. I denne protokollen, beskriver vi generering av Docetaxel-motstandsdyktig prostatakreft linjer som etterligner dødelige funksjoner for sent prostatakreft, og derfor kan brukes å studere mekanismer av hvilke ervervet chemoresistance oppstår. Til tross for potensielle begrensninger iboende å en cellen basert modell, som tap av motstand egenskaper over tid, de Docetaxel-resistente cellelinjer produsert av denne metoden har blitt brukt i studier og tilbyr muligheten til å fremme vår molekylær forståelse av ervervet chemoresistance i dødelige prostatakreft.
Økt hastighet på spredning forårsaket av tap av cellen syklus kontroll er et kjennetegn på kreft1. Denne funksjonelle egenskapen gjengir kreftceller unikt avhengig gjengivelsen av cellen syklus nøkkelprosesser i S – og M-faser, som har ført til utviklingen av ulike celle syklus perturbing medikamenter som forårsaker DNA skade eller mitotisk defekter. Selv om mange anti-mitotisk agenter, liker hemmere av mitotisk kinaser eller motoren proteiner, er nå utviklet og testet i kliniske studier, fortsette eldre microtubule målretting agenter (MTAs) å være eneste klinisk godkjent tilnærming for målretting mitose i kreft2,3,4. MTAer enten destabilisere (Vinblastine, Vincristine, Vinorelbine) eller stabilisere (taxane-avledet agenter paklitaxel, Docetaxel eller Cabazitaxel) piskehale som henger, og hindre dermed dannelse av en fungerende mitotisk spindel5,6. Disse agentene utløse spindelen montering checkpoint7,8, som resulterer i en langvarig mitotisk arrestasjon og eventuell celledød i kulturperler celler9,10 og mitotisk defekter i svulster11 ,12 og er derfor nyttig for behandling av en rekke kreftformer, blant dem prostatakreft13.
Prostatakreft er mest diagnostisert kreft og en ledende årsak til kreft dødsfall i menn14. Antimitotic stoffer som Docetaxel forbedre prostatakreft pasientens overlevelse og er en bærebjelke i behandling av denne sykdommen15,16,17. Dessverre, til tross for innledende svulst krymping, kreftceller ofte utvikle resistens under behandling. Flere cellulære mekanismer har vært innblandet i forårsaker utvikling av chemoresistance, inkludert dereguleringen av apoptotisk og provoserende trasé eller aktivisering/overuttrykte narkotika middelklasseinnbyggere pumper som den ATP-bindende kassett transporter P-glykoprotein (P-gp/ABCB1), som resulterer i eksport av chemotherapeutic agenter av celler18,19. Motstand mot taxanes har også vært knyttet til andre årsaker, for eksempel endringer i uttrykk for tubulin isotypes eller tubulin mutasjoner, hvilke forhindre samspillet mellom stoffet og sine mål 20,21. Videre har motstand vært knyttet til genomet ustabilitet akkumulering og svulst heterogenitet22,23. Men er mekanismer bidra til taxane motstand ikke fullstendig forstått, som er tydelig ved fravær av strategier som hindrer utseendet. Derfor er det et presserende behov for å generere eksperimentelle modeller som hjelper i Disseksjon av disse mekanismene og å identifisere romanen terapeutiske metoder som forhindrer utvikling av resistens mot disse stoffene.
I denne artikkelen beskriver vi en metode som tillater generering av Docetaxel-resistente (DR) prostata kreftceller. Videre vil vi beskrive hvordan validere statusen motstand for disse cellene kolonien formasjon analyser og kvantitative RT PCR. Celler produsert av denne metoden har fordelen av recapitulating mange av molekylære funksjonene i offentlig tilgjengelige menneskelige svulst Eksempeldatabaser med fordelen av å gi allsidigheten for å utføre en rekke eksperimentelle analyser lengre perioder enn tillatt svulst prøver. Modellene kreft terapi motstand kan utvides i mange uker på vev kultur og blant andre tilnærminger, kan genetisk manipulerte, visualisert ved mikroskopi metoder og analysert for genuttrykk. Videre kan de være xenotrasplanted i mus å analysere effektene i tumor formasjon og vekst i vivo. Foreløpig er den viktigste alternative metoden å studere resistens i sammenheng med prostatakreft direkte analyse av tumor prøver. Mens disse prøvene presentere en svært potent system for å samle informasjon om genuttrykk og mutational status for den angitte svulst, tilgang til dem kan være svært begrenset og de er vanskelig å opprettholde for ytterligere manipulasjoner og eksperimentelle analyse, som kan enkelt gjøres med cellelinjer generert med denne protokollen24,25. Viktigere, i fremtiden, tilnærminger alternative som generering av menneskelig avledede organoids direkte fra pasienter ville være et svært kraftig verktøy og alternativ til den nåværende metoden26,27. Siden de vil recapitulate i 3D sammenheng hva en svulst var i sine opprinnelige omgivelser, vil organoids være perfekt modellen mellom linjer og menneskelige svulster. Likevel, eksperimentelle celle-modellene som er beskrevet i denne protokollen er fortsatt mer rimelig å opprettholde og egnet for raskere analyse. Resultatene som oppnås ved å studere disse linjer kan være extrapolated til og bekreftet i prøver fra mennesker og 3D kulturer. Derfor kan denne protokollen være av interesse for forskere søker celle modeller å studere chemoresistance mekanismer i enhver celle linje, siden våre protokollen kan tilpasses til studiet av andre rusmidler og typer kreft. Metodene som er beskrevet her er enkel å bruke i et laboratorium, rimelig og lar Foreløpige undersøkelser av molekylære og cellulære mekanismer for resistens.
I dette manuskriptet beskriver vi en metode for å generere Docetaxel-resistente prostatakreft celle modellsystemer der for å studere mekanismer bidra til anskaffelse av chemoresistance fenotypen. Mens denne tilnærmingen er svært pålitelig og reproduserbar, anses noen potensielle begrensninger. Siden bare en liten brøkdel av befolkningen bulk celler har chemoresistance28, er det anbefalt å starte med en stor befolkning av celler (vi vanligvis plate 20 flasker av 150 cm2, som står for ca 1.2 x 108 celler). Nøkkeltrinn protokollen anses å sikre suksess av prosedyren. Først, er det svært viktig å bruke de samme Docetaxel nylagde lager for lang tids bruk (10 mM stock dele kan brukes til år når lagret riktig i-80 ° c). Små endringer i Docetaxel aliquot kan påvirke resultatene av IC50, generasjon av cellen linje timing og kolonien formasjon resultatene. Det andre, er det avgjørende å starte protokollen bestemmer IC50 i hver enkelt celle linje, siden variasjoner kan oppstå når du bruker en ny gruppe med celler. For det tredje er det viktig å overvåke at behandlingsapparatet er effektivt ved å merke celler under microscope ofte så feil kan oppdages raskt og korrigert. Til slutt, vi anbefaler å alltid holde et lager av mellomliggende trinn ved forurensning eller uventede problemer som kan påvirke levedyktigheten til cellene i protokollen. Viktigere, våre protokollen skal generere modeller av resistens ved å utsette prostatakreft cellene til høye doser av Docetaxel 72 h etterfulgt av lang utvinning perioder, snarere enn lavere konstant konsentrasjoner av stoffet i et forsøk på å etterligne best kliniske scenariet rapportert prostatakreft behandling med denne taxane agent15,16.
I tillegg bør det bemerkes at stoff-resistent celler ha en høy plastisitet, som kan føre til en progressiv tap av ervervet motstand egenskaper over tid. Derfor er utvide bruken av disse cellene for mer enn 2-3 måneder i kultur ikke anbefalt. Hvis en permanent forsyning er nødvendig er det tilrådelig å kontinuerlig generere nye grupper av motstandsdyktig celler. Men hvis grupper av celler har blitt kultivert for en lengre periode, kan koloni formasjon analyser og qPCR brukes til å revurdere sin motstand. Et annet alternativ er å øke avtagende motstand ved behandling av celler med en høy dose Docetaxel 72 h (500-1000 nM). Etter en restitusjonsperiode en til to uker, fenotypen kan bli re-testet av qPCR og kolonien formasjon analyser. Det er også mulig, men ikke anbefalt, lagre dele behandlet celler i flytende nitrogen (i FBS, 10% DMSO). Vær oppmerksom på at etter en fryse-Tin syklus, chemoresistance fenotypen bør alltid revurderes med de nevnte metodene.
Til tross for disse begrensningene, vi28,29 og andre30,31,32,33 kunne vellykket benytter disse modellsystemer å identifisere viktige romanen mobilnettet og molekylære mekanismer fører til opphøyet svulst-starte kapasitet, celle overlevelse og aggressivitet i Docetaxel-resistente celler. Bruker disse kreft celle modellsystemer, oppdaget vi at cellene viser en udifferensierte fenotype, preget av fravær av epitel og prostata-relaterte differensiering markører og overuttrykte targetable utviklingsmessige (hakk og Hedgehog) signalveier, overleve chemotherapeutic eksponering28. I en annen studie, avdekket bruker disse modellene med offentlig tilgjengelig pasienten genet datasett24,25, vi at pioneer transkripsjonstjenester faktoren GATA2 er svært overexpressed i metastatisk kastrering-motstandsdyktig kjemoterapi-resistente prostata kreftceller. GATA2 øker overlevelse av celler ved å aktivere direkte en IGF2-avhengige nedstrøms kinase signalering nettverk29. Spesielt disse studiene bidratt til å identifisere romanen nøkkelroller av GATA2 i avansert metastatisk prostatakreft aggressivitet34.
Utvikling av resistens er et problem som ikke er begrenset til Docetaxel og prostata kreft, som det er utbredt blant mange andre typer kreft behandles med en rekke cellegifter. Faktisk ligner på tilgjengeligheten av eksperimentelle modeller restriksjoner, og det er tenkelig at våre protokollen kan tilpasses andre typer av kreft og deres respektive chemoresistance mekanismer.
Generering av Docetaxel-motstandsdyktig celler som beskrevet i denne protokollen kan brukes som et funksjonelle verktøy for å identifisere romanen relevante molekylære og cellulære mekanismer for chemoresistance. Dette åpner døren for å finne nye mål, som utvikling av nye behandlinger for svært ondartet prostatakreft kan velformulerte, skyve gang grensene for hva vi vet om denne sykdommen og hvordan vi behandler sine pasienter.
The authors have nothing to disclose.
V.R.-B. mottar midler fra det amerikanske Department of Health & menneskelige tjenester, NIH, National Cancer Institute gi nummer 1 K22 CA207458-01 og J.D.-D. mottar støtte fra USAs Department of Health & menneskelige tjenester, NIH, National Cancer Institute gi nummer 1 R01 CA207311-01.
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |