Resistens mot cancerbehandlingar bidrar till sjukdomsprogression och döden. Bestämma den mekanistiska underbyggnaden för motstånd är avgörande för att förbättra terapeutiskt svar. Detta manuskript Detaljer protokollet att generera taxan-resistenta cellmodeller av prostatacancer (PC) för att hjälpa dissekera pathways inblandade i progression till Docetaxel resistens hos PC patienter.
Mikrotubuli inriktning agenter (MTA) är en stöttepelare för behandling av ett brett utbud av tumörer. Förvärvad resistens mot cellgifter är dock en gemensam mekanism för sjukdomsprogression och en prognostiska-avgörande funktion av maligna tumörer. Vid prostatacancer (PC) dikterar motstånd till MTAs såsom Taxanen Docetaxel behandlingssvikt samt progression mot dödliga stadier av sjukdomen som definieras av en dålig prognos och hög dödlighet. Även om studerade i årtionden, utbudet av mekanismer som bidrar till förvärvad resistens är inte helt klarlagda, och således utgör en betydande begränsning till utvecklingen av nya terapeutiska strategier som skulle gynna patienterna i dessa avancerade stadier av sjukdom. I detta protokoll, beskriver vi generationen av Docetaxel-resistent prostatacancer cellinjer som efterliknar dödliga funktioner i sent stadium prostatacancer, och därför kan användas för att studera mekanismerna genom vilka förvärvade chemoresistance uppstår. Trots potentiella begränsningar inneboende till en cell baserat modell, såsom förlust av beständighet över tid, de Docetaxel-resistenta cellinjer som framställs med denna metod har använts framgångsrikt i nyligen genomförda studier och erbjuder möjlighet att avancera vår molekylär förståelse av förvärvade chemoresistance i dödlig prostatacancer.
En ökad frekvens av spridning som orsakas av förlust av cellcykeln kontroll är ett kännetecken för cancer1. Detta funktionella boende gör cancerceller unikt beroende av trohet i cellcykelns viktiga processer under S – och M-faser, vilket har lett till utvecklingen av olika cellcykeln störande läkemedel som inducerar DNA-skador eller mitotiska defekter. Även om många anti mitotiska ombud, som hämmare av mitotiska kinaser eller motorproteiner, är för närvarande utvecklas och testas i kliniska prövningar, fortsätta äldre mikrotubulära inriktning agenter (MTA) att vara den enda kliniskt godkänd strategin för inriktning Mitos i cancer2,3,4. MTAs antingen destabilisera (vinblastin, vinkristin, vinorelbin) eller stabilisera (taxan-derived agenter Cabazitaxel, paklitaxel eller Docetaxel) mikrotubuli och förhindra därigenom bildandet av en fungerande mitotiska spindeln5,6. Dessa agenter utlösa den spindel montering checkpoint7,8, vilket resulterar i en långvarig mitotiska gripandet och eventuell celldöd i odlade celler9,10 och mitotiska defekter i tumörer11 ,12 och är därför användbar för behandling av en stor mängd cancerformer, bland dem prostatacancer13.
Prostatacancer är den vanligaste diagnosen cancer och en ledande orsak till cancer relaterade dödsfall i män14. Mitoshämmande ämnen såsom Docetaxel förbättra prostatacancer patientens överlevnad och är en stöttepelare för behandling av denna sjukdom15,16,17. Tyvärr, trots inledande tumör krympning, tumörceller ofta utveckla resistens under behandling. Flera cellulära mekanismer har varit inblandade i att orsaka utveckling av chemoresistance, inklusive avregleringen av apoptotiska och inflammatoriska vägar eller aktivering/överuttryck av drogen effluxpumpar som ATP-bindande kassett transportören P-glykoprotein (P-gp/ABCB1), den senare som resulterar i export av kemoterapeutiska medel ur celler18,19. Resistens mot taxaner har också kopplats till andra orsaker, såsom förändringar i uttrycket av tubulin isotyper eller tubulin mutationer, som förhindrar interaktionen mellan läkemedlet och dess mål 20,21. Dessutom har motståndet varit relaterade till genomet instabilitet ackumulering och tumör heterogenitet22,23. Dock är de mekanismer som bidrar till taxan motstånd inte helt klarlagda, vilket är uppenbart av avsaknaden av terapeutiska strategier som hindrar dess utseende. Därför finns det ett brådskande behov att generera experimentella modeller som bistår i dissektion av dessa mekanismer och identifiera nya terapeutiska metoder som hindrar utvecklingen av resistens mot dessa läkemedel.
I denna artikel beskrivs en metod som möjliggör generering av Docetaxel-resistenta (DR) prostatacancerceller. Vidare kommer vi att beskriva hur validera motstånd status för dessa celler med hjälp av kolonin bildandet analyser och kvantitativ RT-PCR. Celler som produceras av denna metod har fördelen av går igenom många av de molekylära funktioner som finns i allmänt tillgängliga mänskliga tumör Exempeldatabaser med fördelen av att ge mångsidighet för att utföra en mängd olika experimentella analyser över längre tid än tillåtet enligt tumörprover. Dessa cancer modeller av terapimotstånd kan utökas för många veckor i vävnadsodling och bland andra metoder, kan genetiskt manipulerade, visualiseras genom mikroskopi metoder och analyseras för genuttryck. Dessutom kan de xenotrasplanted i möss att ytterligare analysera effekter i tumör bildande och tillväxt i vivo. För närvarande är den huvudsakliga alternativa metoden att studera läkemedelsresistens i samband med prostatacancer direkt analys av tumörprover. Medan dessa prover presenterar ett mycket potent system för att samla information om genuttryck och mutationsstatus av viss tumörer, tillgång till dem kan vara mycket begränsad och de är svåra att upprätthålla för ytterligare manipulationer och experimentell analys, som kan enkelt göras med de cellinjer som genereras med detta protokoll24,25. Ännu viktigare, i framtiden, strategier alternativ såsom generering av mänskliga härledda organoids direkt från patienter skulle vara ett mycket kraftfullt verktyg och alternativ till den nuvarande metoden26,27. Eftersom de kommer att sammanfatta i ett 3D sammanhang vad en tumör var i sin ursprungliga miljö, blir organoids den perfekta modellen mellan cellinjer och mänskliga tumörer. Men är de experimentella cellmodeller som beskrivs i detta protokoll fortfarande mer överkomligt att upprätthålla och lämplig för snabbare analys. De resultat som erhålls genom att studera dessa cellinjer kan extrapoleras till och bekräftas i mänskliga prover och 3D kulturer. Detta protokoll kan därför vara av intresse för forskare som söker cellmodeller att studera chemoresistance mekanismer i någon cellinje, eftersom våra protokoll kan anpassas till studiet av andra droger och typer av cancer. De metoder som beskrivs här är lätt att applicera i något laboratorium, prisvärd och låt preliminära studier av molekylära och cellulära mekanismer för resistens.
I detta manuskript beskriver vi en metod för att generera Docetaxel-resistent prostatacancer cell modellsystem som möjliggör för att studera mekanismer bidrar till förvärvet av chemoresistance fenotypen. Även om detta tillvägagångssätt är mycket tillförlitliga och reproducerbara, övervägas vissa potentiella begränsningar. Eftersom bara en bråkdel av celler bulk befolkning ställer ut chemoresistance28, det rekommenderas att börja med en stor population av celler (vi brukar plåt 20 kolvar 150 cm2, som står för cirka 1,2 x 108 celler). Viktiga steg i protokollet bör anses säkerställa framgång av förfarandet. Först, det är mycket viktigt att använda den samma Docetaxel nylagade lager för lång sikt användning (10 mM lager alikvoter kan användas för år då lagras korrekt i vid-80 ° C). Smärre förändringar i Docetaxel alikvotens kan påverka resultaten av IC50, generering av cell linje tidpunkten och kolonin bildandet resultaten. Det andra är det viktigt att starta protokollet att fastställa IC50 i varje enskild cell linje, eftersom variationer kan förekomma när du använder en ny sats av celler. För det tredje är det viktigt att övervaka att missbruksbehandling är effektivt genom att markera celler under mikroskopet ofta så att eventuella fel kan snabbt upptäckas och korrigeras. Slutligen rekommenderar vi att alltid hålla ett lager av mellanliggande steg vid kontaminering eller oväntade problem som kan påverka lönsamheten för cellerna i mitten av protokollet. Ännu viktigare, våra protokoll syftar till att skapa modeller av resistens genom att exponera prostatacancerceller för höga doser av Docetaxel för 72 h följt av långa återhämtningsperioder, snarare än lägre konstant koncentrationer av läkemedlet i ett försök att efterlikna bäst kliniska scenariot redovisade för prostatacancer behandling med denna taxan agent15,16.
Det bör dessutom noteras att resistenta celler uppvisar en hög plasticitet, vilket kan leda till en progressiv förlust av förvärvad resistens egenskaper över tiden. Därför rekommenderas det inte att utvidga användningen av dessa celler för mer än 2-3 månader i kultur. Om en permanent tillförsel behövs är det tillrådligt att kontinuerligt skapa nya partier av resistenta celler. Dock om partier av celler har varit odlade en längre tid, koloni bildandet analyser och qPCR kan användas att omvärdera deras motstånd. Ett annat alternativ är att öka avtagande motstånd genom att behandla cellerna med en hög dos av Docetaxel för 72 h (500-1000 nM). Efter en återställning av en till två veckor, fenotypen åter kan testas av qPCR och kolonin bildandet analyser. Det är också möjligt, rekommenderas inte att lagra alikvoter av behandlade cellerna i flytande kväve (i FBS, 10% DMSO). Observera att efter en frysning-tining cykel, chemoresistance fenotypen skall alltid omvärderas med ovan nämnda metoder.
Trots dessa varningar, vi28,29 och andra30,31,32,33 lyckades framgångsrikt anställa dessa modellsystem att identifiera nyckel-romanen cellulära och molekylära mekanismer leder till förhöjda tumör-inleda kapacitet, cellöverlevnad och aggressivitet i Docetaxel-resistenta celler. Använder dessa cancer cell modellsystem, upptäckte vi att celler uppvisar en odifferentierad fenotyp, kännetecknas av avsaknad av epitelial och prostata-relaterade differentiering markörer och överuttryck av targetable utvecklingstoxicitet (Notch och Igelkott) signalvägar, överleva kemoterapeutiska exponering28. I en andra studie, funnit med hjälp av dessa modeller tillsammans med offentligt tillgängliga patienten gen datauppsättningar24,25, vi att den banbrytande transkriptionsfaktor GATA2 är högt i ökad utsträckning i metastaserande kastrationsresistent kemoterapi-resistent prostatacancerceller. GATA2 ökar överlevnaden av celler genom att direkt aktivera en IGF2-beroende nedströms kinase signalering nätverk29. Bland annat dessa studier bidragit till att identifiera nya viktiga roller i GATA2 i avancerad metastaserande prostatacancer aggressivitet34.
Utvecklingen av resistens är ett problem som inte är begränsad till Docetaxel och prostatacancer, eftersom det är utbrett bland många andra typer av cancer som behandlas med en rad olika cellgifter. Faktiskt liknande restriktioner på tillgängligheten av experimentella modeller gäller, och det är tänkbart att våra protokoll kan anpassas att studera andra typer av cancer och deras respektive chemoresistance mekanismer.
Generering av Docetaxel-resistenta celler som beskrivs i detta protokoll kan användas som ett fungerande verktyg för att identifiera nya relevanta molekylära och cellulära mekanismer för chemoresistance. Detta öppnar dörren för att hitta nya mål, som utvecklingen av nya behandlingar för Högmaligna prostatacancer kan artikulera, en gång mer tänja på gränserna för vad vi vet om denna sjukdom och hur vi behandlar sina patienter.
The authors have nothing to disclose.
V.R.-B. får finansiering från US Department of Health & mänskliga tjänster, NIH, National Cancer Institute bevilja nummer 1 K22 CA207458-01 och J.D.-D. får finansiering från US Department of Health & mänskliga tjänster, NIH, National Cancer Institute bevilja nummer 1 R01 CA207311-01.
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |