Brusk og hud analoger blev bioprinted ved hjælp af en nanocellulose-calciumalginat baseret bioink. Bioinks var cellularized før udskrivning via et enkelt skridt passiv blanding enhed. Konstruktioner påvistes at være ensartet cellularized, har høj rentabilitet og udstille gunstige markører for differentiering.
Bioprinting er en kraftfuld teknik for den hurtige og reproducerbare fabrikation af konstruktioner til tissue engineering applikationer. I denne undersøgelse, var både brusk og hud analoger fremstillet efter bioink pre-cellularization udnytte en roman passiv blanding enhed teknik. Denne teknik blev udviklet med formålet at forenkle de forskellige trin i en blanding af en cellesuspension til en meget tyktflydende bioink. Opløsning af filamenter deponeret gennem bioprinting nødvendiggør forsikringen om ensartethed i celle distribution inden udskrivning for at undgå aflejring af regioner uden celler eller fastholdelse af store celle klumper, der kan tilstoppe nålen. Vi demonstrere evnen til hurtigt blend en cellesuspension med en bioink før bioprinting af både brusk og hud analoger. Begge væv analoger kunne være kulturperler i op til 4 uger. Histologiske analyse viste både cellernes levedygtighed og deposition af væv specifikke ekstracellulære matrix (ECM) markører som glycosaminoglycans (GAGs) og kollagen jeg henholdsvis.
I de seneste år, er tre-dimensionelle (3D) bioprinting teknologi blevet mere tilgængelige for forskere, så teknik til at blive mere bredt udnyttet til fremstilling af væv analoger. Bioprinting lover at revolutionere biomedicinsk forskning ved at lette den hurtige og repeterbare fabrikation af mangefacetteret væv konstruktioner. Kernen i bioprinting teknologien lægger i evnen til at netop kontrol aflejring af biomaterialer (kendt som bioinks) i tre dimensioner. Dette giver mulighed for generation af komplekse stilladser med forskellige regioner af matrix kompositioner, bioaktive faktorer og celler, der mere præcist kan sammenfatte indfødte væv struktur.
Bioprinting er blevet udnyttet til fabrikation af konstruktioner til mange væv applikationer herunder brusk1, huden2, muskel3og knogle4. Disse væv er attraktive for bioprinting på grund af deres iboende tværstribede mikro-arkitekturer, der er egnet til Rekapitulering via lag på lag deposition. Især besidder hud en veldefineret flerlaget struktur5, som er egnet til fabrikation gennem lag på lag deposition teknikker som bioprinting. Derudover bioprinting kan udnyttes til at generere konstruktioner, der besidder de nødvendige anatomiske dimensioner og figurer til at reparere væv defekt. Evnen til at generere biomaterialer med patienten-specifikke størrelse og figur6 kan begynde at imødegå efterspørgsel efter delvis reparationer af mange væv, herunder men begrænset ikke til knogledefekter, bruskskader og hudlæsioner hvis omfang varierer fra patient til patient.
I denne undersøgelse, var to væv analoger (ledbrusken og hud) fremstillet ved bioprinting af pre-cellularized bioinks. At sikre tilstrækkelig blanding af et bioink med cellesuspension, der kan sikre ensartet celle distribution, mens bevare cellernes levedygtighed kan være en udfordring. Bioinks egnet til bioprinting via ekstrudering ofte er meget tyktflydende og derfor kræver omfattende blanding for at sikre en homogen blanding. Mekaniske skader på celler kan optræde under barske blanding og negativt påvirker levedygtighed. Undersøgelser har vist, at de fleste celledød under inkjet print proces forekommer under forberedelse som blanding7,8. Mens traditionelle blanding med agitation9 kan være tilstrækkeligt til lav viskositet bioinks egnet til inkjet print10, blanding af celler ind i en høj viskositet bioink mere velegnet til ekstrudering bioprinting er vanskeligere. Tackle dette behov, er brugen af blande dyser blevet mere populært for blanding af bioinks under udskrivning proces11. Disse blandere har også udnyttet bredt i mikrofluidik forskning hvor blanding af væsker med lav Reynolds tal er vigtige12. Udnyttelse af en kontinuerlig blanding proces at blande en cellesuspension ind en bioink ville give mulighed for ensartethed under udskrivningsprocessen. Men da celle suspensioner besidde lav viskositet i forhold til en bioink, vanskeligheder vil opstå i forebyggelsen sedimentation af cellerne under udskrivning proces9,13,14. Alternativt, en blanding af celler ind i en bioink før udskrivning kan løse dette problem.
For at minimere celledød under blanding i en bioink, udviklet vi en teknik baseret på en passiv blanding enhed til at blande celler ind i en bioink i den minimalt antal trin. Den kaotiske blanding genereret gennem strømmen af materialer gennem blanding enheden er tilstrækkeligt at reproducerbar blanding to komponenter sammen15,16. Denne metode blev primært udviklet til at forenkle blanding af enhver cellesuspension med nogen bioink der egner sig til ekstrudering bioprinting. Antallet af trin i miksningen blev minimeret for at fjerne bruger til bruger variation i blanding. Overdreven blanding skridt kan være tidskrævende og ikke gælder for alle bioinks, især når cellerne er involveret. Sekundære, vi sigter mod at udvikle en blanding proces, der var selvstændig til både bevare sterilitet og minimere prøve tab.
I dette manuskript vise vi blanding af en cellesuspension med en bioink ved hjælp af en passiv blanding enhed teknik der minimerer håndtering og resultater i høj celle levedygtighed og ensartet distribution. Disse pre-cellularized bioinks der derefter udnyttet til bioprint enten en brusk eller hud konstruere med én eller to celletyper, henholdsvis at er kulturperler i op til 6 uger. Bioink udnyttede er en natriumalginat-nanocellulose blanding, som tidligere har vist egnethed for bioprinting1.
Som påvist i dette manuskript, var pre-cellularized bioinks bioprinted til at fabrikere enten brusk eller hud analoger, der var kulturperler i op til 4 uger. Cellernes levedygtighed efter blanding ved hjælp af den passive blanding enhed teknik var højere end de traditionelle blanding metoder. Derudover forenkling af blending processen ved hjælp af enhedens blanding minimerer antallet af håndtering af trin og giver mulighed for bedre sammenhæng i omfanget af blanding. I sidste ende, dette resulterer i bedre reproducerbarhed i begge celle fordeling inden for bioink, og på tværs af konstruktioner og eksperimentelle grupper. Deposition af væv specifikke ECM komponenter såsom GAGs og kollagen jeg blev observeret for både brusk og hud analoger, henholdsvis efter 4 uger af kultur. Dette angiver fleksibiliteten i både den blanding teknik og den valgte konstruktion geometri til at fremstille forskellige væv mål. Fabrikation af brusk og hud analoger udstillet fleksibilitet både anvendelsen af en nanocellulose-calciumalginat bioink og bioprinting teknik til særskilte manipuleret væv mål. Vi vil diskutere to komponenter i undersøgelsen nedenfor: (1) den passive blande enhed teknik, og (2) opførslen af celler i brusk og hud analoger.
Udvikling og optimering af en teknik for blanding af en cellesuspension i en bioink var altafgørende for fabrikation af disse konstruktioner. I modsætning til traditionelle lav viskositet hydrogel materialer resulterede høj viskositet af bioinks i vanskeligheder i pre-cellularization af en bioink før udskrivning. Som et alternativ til den traditionelle metode til celle indarbejdes i en bioink, blev en protokol for et-trins blanding af en cellesuspension til en tyktflydende bioink udviklet og drøftet. Derudover blev den praktiske anvendelse af denne blanding teknik i fabrikation af væv konstruktioner evalueret. Denne et-trins blanding tilgang har flere fordele frem for traditionelle teknikker indgår kontrolleret blanding blandingsforholdet, minimering af høj og uregelmæssige selvdestruerende understreges, og et lukket system til at fjerne prøve lukke i blande fartøjer. Men der er flere vigtige skridt i denne teknik til at sikre dens fordele i forhold til traditionelle metoder for celle/bioink blanding. Det er afgørende at sikre, at cellerne i celle sprøjten er suspenderet og godt blandet inden blanding. For store af tidsforskydninger mellem løfter og overførsel af cellerne i sprøjten og start miksningen kan bevirke, at cellerne til sediment, som vil resultere i ujævn blanding og distribution i en trykt glødetråd. Hvis sedimentation er observeret, enkle inversion (2 – 3 gange) af er den passive blanding enhed forsamling umiddelbart inden blanding tilstrækkeligt at resuspend cellerne og sikre en ensartet fordeling inden blanding. Det er også afgørende at luftbobler i sprøjter er elimineret eller minimeret forudgående for at sikre, at den blandingsforholdet forbliver konstant. Hvis store luftbobler forbliver i bioink patron inden blanding, anbefales det, at løsningen kan køres gennem blanding enheden en ekstra tid for at sikre grundig blanding. Hvis luftbobler forblive, kan blid tappe af print cartridge/sprøjten fortrænge resterende luftbobler. Desuden, hvis flere materiale blanding (flere blande enheder eller materialer) er nødvendige for mere komplicerede konstruktioner, bør koncentrationer af bioinks/celle suspensioner bliver blandet tilpasses for at sikre, at efter fortynding gennem blanding, rette endelig koncentration opnås stadig.
I forhold til andre blanding teknikker er passiv blanding enheden en ny tilgang til cellularize bioinks. I modsætning til andre blande teknikker som dobbelt sprøjte blanding eller omrøring med en spatel eller andet værktøj, tillader den passive blanding enhed mere konsekvens i blanding på tværs af partier og brugere. Arten af manuel blanding teknikker, som en spatel blanding, resulterer i større bruger-til-bruger variation i omfanget af og sats af blanding. Derudover har lukkede systemer som passiv blande enhed og dobbelt sprøjte blanding lidt at ingen prøve tab i forhold til manuel blanding i en petriskål eller tube.
Begge væv analoger fabrikeret i dette manuskript bestod af en enkelt type af bioink og enten én eller to celletyper. Bioprinting af væv-analoger, der består af arkitekturer, der indeholder regioner i forskellige bioinks med forskellige celletyper kan dog være nødvendigt for fabrikation af flere fysiologisk væv konstruktioner20,21, 22. Mere specialiserede bioinks med unikke kompositioner eller funktionaliteter kan genereres gennem blanding af flere typer af eksisterende bioinks sammen for at skabe multimaterial bioinks, der har forskellige kompositioner eller funktionaliteter23, 24. Dette kan være særlig vigtigt på væv overgangsregioner såsom hud til subkutane lag eller brusk til knogle region af en væv hvor et forløb af bioink sammensætning25,26 kan være nødvendigt at sikre udviklingen af disse kritiske regioner findes i native væv27. Derudover kunne en blanding enhed udnyttes til at blande i vækstfaktorer og morphogens ind i bioinks før bioprinting. Fjernelse af prøven tab med det lukkede blanding system er attraktivt for brug af dyrt og lav koncentration bioaktive faktorer, hvor prøven tab kan resultere i en ændring til deres endelige koncentration i bioprinted konstruktion, især når gradienter er involveret.
En begrænsning med enhver blanding teknik, herunder passiv blanding enhed udnyttes i denne undersøgelse, er risikoen for beskadigelse af mekanisk følsomme celletyper. For eksempel, isolerede stamceller sådan dem fra knoglemarv eller embryo eller induceret pluripotente stamceller er mere modtagelige for mekaniske skader28,29. Handlingen at blande formidler unormale mekaniske belastninger på celler på grund af shear kræfter involveret i miksningen, og de skal være afbalanceret for at bevare levedygtigheden30. Mens brugen af primære fibroblaster og chondrocytter i denne undersøgelse resulterede i god levedygtighed (figur 2), er yderligere undersøgelser nødvendige for at bestemme sikkert blande priser og nøgletal for mere følsomme celletyper. Indtil da anbefales det, at blandingen udføres under en jævn langsom hastighed til at maksimere levedygtighed. Derudover blev celle tæthed valgt i denne undersøgelse fastsat baseret på tidligere undersøgelser1. Denne celle tæthed kan ikke være ideel til alle celletyper.Især kan blanding celler på en højere koncentration resultere i øget celle-celle kontakter, der kan forbedre cellernes levedygtighed og væv dannelse31,32. I samme retning, kunne den passive blanding enhed anvendes blanding celle spheroids eller andre celle aggregater33 i bioinks.
Som foreslået og påvist i denne undersøgelse, en passiv blanding enhed system kan hurtigt blend en cellesuspension til en tyktflydende bioink. Mens risikoen for mekaniske skader på cellerne er stadig, tilgangen giver mulighed for mere sammenhæng i blending inden for en enkelt undersøgelse og på tværs af brugere. Pre-cellularized bioinks udnytte denne tilgang blev brugt til at fremstille begge brusk og hud analoger, der blev dyrket til op til 4 uger, og demonstreret aflejring af væv specifikke ECM markører. Fremtidige undersøgelser vil fokusere på udnyttelse af den passive blanding enhed system for at blande specialiserede bioinks fra standardiserede bioinks for fabrikation af mere komplekse væv analoger.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har ingen anerkendelser.
STARTINK Kit | CELLINK | SK0001 | Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure |
Live/Dead Kit | Life Technologies | L3224 | Kit for the analysis of cell viability after mixing |
Masson's Trichrome | Sigma Aldrich | HT15-1KT | Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs |
Alcian Blue | Sigma Aldrich | B8438-250ML | Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs |
INKREDIBLE+ bioprinter | CELLINK | Gen1+ | Printer utilized in the study |
DMEM with Glutamax | Thermofisher | 10566016 | Media for culture of the cells |
10% fetal bovine serum | Thermofisher | A3160402 | Media supplement |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | Media supplement |
live cell imaging solution | thermofisher | A14291DJ | component utilized using live/dead imaging |
inverted microscope | Olympus | IX73 | microscope utilized |
a digital color camera | Olympus | XC10 | microscope camera utilized |
cellSens imaging software | Olympus | n/a | stock software with the microscope |
ImageJ | NIH | n/a | open source image analysis software |
GraphPad Prism 7 | GraphPad | n/a | software for statistical analysis |
Slic3r software (v1.2.9) | Slic3r | n/a | open-source software to convert .stl file to gcode |
primary adult human dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | cell source for fibroblasts |