Summary
Kraakbeen en huid-analogen waren bioprinted met behulp van een nanocellulose-alginaat gebaseerd bioink. De bioinks waren cellularized voorafgaand aan het afdrukken via een enkele stap passieve mengen eenheid. De constructies werden gedemonstreerd worden uniforme cellularized, hebben hoge levensvatbaarheid en gunstige markers van differentiatie vertonen.
Abstract
Bioprinting is een krachtige techniek voor de snelle en reproduceerbare fabrikatie van constructies voor weefsel technische toepassingen. In deze studie werden zowel kraakbeen en huid-analogen na bioink pre-cellularization met behulp van een roman passief mengen eenheid techniek vervaardigd. Deze techniek werd ontwikkeld met het oog op het vereenvoudigen van de stappen betrokken bij het mengen van een celsuspensie in een zeer viskeuze bioink. De resolutie van de gloeidraden gestort via bioprinting vereist de verzekering van eenvormigheid in de cel distributie voorafgaand aan druk om te voorkomen dat de afzetting van regio's zonder de cellen of het behoud van grote cel bosjes die de naald kan verstoppen. We laten zien dat de mogelijkheid om snel mengen een celsuspensie met een bioink voorafgaand aan de bioprinting van zowel kraakbeen en huid-analogen. Beide weefsel analogen kunnen worden gekweekt voor maximaal 4 weken. Histologische analyse aangetoond dat zowel de levensvatbaarheid van de cellen en de afzetting van weefsel specifieke extracellulaire matrix (ECM) markeringen zoals glycosaminoglycanen (GAGs) en collageen ik respectievelijk.
Introduction
In de afgelopen jaren, is driedimensionale (3D) bioprinting technologie beter toegankelijk zijn voor onderzoekers, waardoor de techniek om wijder worden gebruikt voor de fabricage van weefsel-analogen geworden. Bioprinting belooft om een ommekeer teweeg van biomedisch onderzoek door de bevordering van de snelle en herhaalbare fabricage van veelzijdige weefsel constructies. De kern van de bioprinting-technologie legt in de mogelijkheid om precies de afzetting van biomaterialen (bekend als bioinks) in drie dimensies. Hierdoor is de generatie van complexe steigers met verschillende regio's van de matrix composities, bioactieve factoren en cellen die nauwkeuriger inheemse weefsel structuur recapituleren kunnen.
Bioprinting is gebruikt voor de fabricage van constructies voor veel weefsel toepassingen met inbegrip van kraakbeen1, huid2, spier3en bot4. Deze weefsels zijn aantrekkelijk voor bioprinting te wijten aan hun intrinsieke Locustella micro-platforms die geschikt voor recapitulatie via laag-voor-laag depositie zijn. In het bijzonder huid beschikt over een goed gedefinieerde structuur van meerdere lagen5, die is geschikt voor de vervaardiging door middel van laag-voor-laag depositie technieken zoals bioprinting. Bovendien, bioprinting kan worden gebruikt voor het genereren van constructies die beschikken over de nodige anatomische afmetingen en vormen te repareren het weefsel defect. De mogelijkheid voor het genereren van biomaterialen met patiënt-specifieke grootte en vorm6 kunt beginnen met het aanpakken van de vraag voor gedeeltelijke reparaties van vele weefsels, met inbegrip van maar niet beperkt tot bot gebreken, kraakbeenletsels, en waarvan de omvang verschilt van de letsels van de huid patiënt-te-patiënt.
In deze studie werden twee weefsel analogen (articulair kraakbeen en huid) vervaardigd door de bioprinting van pre-cellularized bioinks. Het waarborgen van voldoende vermenging van een bioink met celsuspensie die voor uniforme cel distributie zorgen kan terwijl het behoud van de levensvatbaarheid van de cellen kan een uitdaging. Bioinks geschikt voor bioprinting via extrusie vaak zeer viskeuze en daarom vereisen uitgebreide mengen zodat een homogeen mengsel. Mechanische schade aan cellen kan plaatsvinden onder barre omstandigheden zijn een mengen en negatieve invloed hebben op de levensvatbaarheid. Studies hebben aangetoond dat de meeste celdood tijdens het drukproces inkjet tijdens bereiding optreedt, zoals het mengen van7,8. Hoewel traditionele mengen met agitatie9 mogelijk voldoende voor lage viscositeit bioinks geschikt voor inkjet afdrukken10, is mengen van cellen in een hoge viscositeit bioink meer geschikt voor extrusie bioprinting moeilijker. Het aanpakken van deze behoefte, het gebruik van het mengen van sproeiers meer populair geworden voor het mengen van bioinks tijdens het afdrukken proces11. Deze mixers hebben ook wijd gebruikt in microfluidics onderzoek waar het mengen van vloeistoffen met lage Reynolds getal belangrijk12 is. Het gebruik van een continu mengen proces te mengen een celsuspensie in een bioink zou voor uniformiteit tijdens het drukproces. Echter omdat cel schorsingen lage viscositeit in vergelijking met een bioink bezitten, ontstaat problemen bij het voorkomen van sedimentatie van de cellen tijdens het afdrukken proces9,13,14. U kunt ook kan het mengen van cellen in een bioink voorafgaand aan druk deze kwestie aanpakken.
U wilt minimaliseren celdood tijdens het mengen in een bioink, ontwikkelden we een techniek gebaseerd op een passieve mengen eenheid te mengsel van cellen in een bioink in het minimale aantal stappen. Het chaotische mengen gegenereerd door de stroom van de materialen door de vermenging eenheid is voldoende om de reproducibly mix twee componenten samen15,16. Deze methode is hoofdzakelijk ontwikkeld ter vereenvoudiging van het mengen van elke opschorting van de cel met een bioink dat geschikt is voor 3D-bioprinting. Het aantal stappen in het proces van mengen werd geminimaliseerd om te elimineren van gebruiker tot gebruiker variatie in mengen. Buitensporige mengen stappen kunnen tijdrovend en niet van toepassing op alle bioinks, met name wanneer cellen betrokken zijn. Secundaire, we gericht op het ontwikkelen van een mengen proces dat self-contained was om zowel behouden steriliteit en monster verlies te minimaliseren.
In dit manuscript tonen we de vermenging van een celsuspensie met een bioink met behulp van een passief mengen eenheid techniek die behandeling minimaliseert en resulteert in hoge cel levensvatbaarheid en uniforme verdeling. Deze pre-cellularized bioinks worden vervolgens gebruikt om bioprint of de huid een kraakbeen construeren met één of twee celtypes, respectievelijk die worden gekweekt voor maximaal 6 weken. De bioink gebruikt is een alginaat-nanocellulose-mix, die eerder geschiktheid voor bioprinting1 gebleken.
Protocol
Dit protocol volgt de richtsnoeren van Chalmers University's menselijke onderzoek ethisch comité.
Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd binnen een steriele bioveiligheid kabinet.
1. bereiding van verbruiksartikelen, Bioink en cellen
- Verkrijgen van twee spuiten, één spuit (Figuur 1een) is voor de celsuspensie, terwijl de andere spuit is voor de bioink (Figuur 1b).
- Een steriele passieve mengen eenheid (Figuur 1c) die kan worden gekoppeld aan dual spuiten via een Luer lock-verbinding te verkrijgen.
- Het verkrijgen van een verstrekking eenheid (Figuur 1d), die kan het extruderen van een volume uit twee steriele injectiespuiten gelijktijdig met een gecontroleerde snelheid.
Opmerking: De mengverhouding gebruikt in deze studie is 10:1. Gebruik daarom een 12 mL spuit en een spuit van 1 mL zoals vereist door de 10:1 mengen eenheid. - Een steriele cartridge (Figuur 1e) en een steriele vrouw-vrouw Luer lock connector direct gemengd de schorsing van het bioink en de cel in te krijgen.
- Verkrijgen of bereiden van het bioink voor het mengen met een celsuspensie.
Opmerking: In dit protocol, een nanocellulose/alginaat gebaseerd bioink werd gebruikt. Deze bioink is kruislings door de toevoeging van een oplossing van de steriele 100 mM CaCl2 post afdrukken. - Loskoppelen van cellen met een trypsine/EDTA-oplossing van 0,5% en het totale aantal cellen met behulp van de methode van trypan blauwe uitsluiting17tellen.
Opmerking: In dit protocol, menselijke fibroblasten werden gebruikt. - Bepalen welke celdichtheid in de uiteindelijke afgedrukte construct is gewenst. Bereken met behulp van de volgende vergelijkingen de concentratie van de geoogste cellen die moeten worden verdund om te bereiken van het uiteindelijke celdichtheid van dit doel.
Opmerking: In dit protocol, een definitieve celdichtheid van 5 x 106 cellen/mL werd gebruikt.- Selecteer een gewenste cel concentratie voor de experimenten: C-cel (cellen/mL).
- Bereken de hoeveelheid bioink nodig, Vbioink, gebaseerd op het totale aantal constructies gewenst:
Vbioink = Vbouwen × NContructs
Opmerking: het volume van bioink per construct is bijvoorbeeld 100 µL. Als 30 constructies worden afgedrukt, is het benodigde volume van bioink 3 mL. - Bereken het aantal cellen die nodig zijn:
Ncellen = C-cel (1,1 × Vbiolink) - Resuspendeer de cellen (Ncellen) in 1/10th het volume van de bioink:
Vcelsuspensie = 0,1 × Vbiolink
Opmerking: als u bijvoorbeeld als Vbioink = 3 mL, dan Vcelsuspensie = 0,1 × 3 mL = 0,3 mL
2. mengen van celsuspensie en Bioink
- Spoel de celsuspensie in de cel schorsing spuit.
- De bioink overbrengen in een andere spuit of verkrijgen van een spuit met de bioink.
- Trek de zuiger van de spuit bioink terug en plaats de injectiespuit in de verstrekking eenheid. Plaats het toestel verticaal met de Luer lock connector naar boven (Figuur 1f1).
- Trek de zuiger van de spuit cel terug naar een vergelijkbare lengte als de bioink spuit en invoegen in de verstrekking eenheid (Figuur 1f2).
- Beide spuiten aan de vermenging eenheid koppelen door het draaien van de Luer lock-connectors (Figuur 1f3).
- Prime het mengen systeem door te drukken op de verstrekking eenheid te extruderen van de lucht in de spuit. Stop de priming vóór de oplossing bereiken de Luer-lock (Figuur 1g4).
- Na priming, de cartridge vullen aan het einde van de vermenging eenheid via de Luer lock connector (Figuur 1g5) te koppelen. Zorg ervoor dat de zuiger in de cartridge vullen onderaan voorafgaand aan bijlage.
- Langzaam comprimeren (Figuur 1h6) de verstrekking unit om de bioink en cel schorsing Meng in de cartridge (Figuur 1i7).
- Duw de zuiger in de cartridge vullen naar beneden met een steriele Pipetteer tip om het contact met de bioink-cel mengsel na mengen. Houd de aflevering tot gecomprimeerd om ervoor te zorgen dat de cel/bioink mengsel is niet geëxtrudeerd terug in de vermenging eenheid.
- Cap de cartridge en zachtjes kraan op het werkvlak om eventuele luchtbellen naar de bovenkant van de cartridge (zuiger eind).
Opmerking: Op dit punt, het mengsel van cel/bioink is klaar om te worden afgedrukt. In de volgende gedeelten zal worden specifieke toepassingen en afdrukken procedures.
3. bepaling van de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van een vermenging eenheid ten opzichte van handmatige spatel mengen
- Loskoppelen van menselijke fibroblasten (doorgang 7) met een trypsine/EDTA-oplossing van 0,5% bij 80% samenvloeiing, tellen en resuspendeer in een kweekvloeistof bij voldoende celdichtheid om een eindconcentratie na mengen met de bioink (1:10 cel: bioink verhouding) van 5 x 10 6 cellen/mL.
- Blend cellen in de bioink met behulp van hetzij de passieve mengen eenheid techniek (stap 2) of via de spatel te evalueren van het effect van beide technieken op de levensvatbaarheid van de cellen.
- Meng de cellen in de bioink met behulp van de passieve eenheid techniek 1, 2, of 3 keer vóór de verstrekking in een mal voor dwarsbinding gebruik 100 mM CaCl2mengen.
Opmerking: Voor het uitvoeren van extra mengsels, meng de cel/bioink rechtstreeks in een spuit in plaats van een cartridge. Vervolgens remix het mengsel door de vermenging eenheid na het vorige protocol, maar zonder de cel spuit component. - Meng de cellen in een aparte bioink met behulp van handmatige mechanische mengen via een spatel voor een duur van 30, 60 of 90 s. overdracht het mengsel (voor elke mixing tijd) in een mal voor dwarsbinding 100 mM CaCl2gebruikt.
- De monsters overbrengen in een goed plaat na de voltooiing van de cross-linking en cultuur onder standaardomstandigheden.
- Na 1 dag van cultuur, het wassen van de constructies (n = 3-4 per groep) in cel serumvrij cultuurmedium voor 30 min. vlek de cellen in de constructies met een kleurstofoplossing (4 µM calceïne AM, 1 µM Ethidium homodimer-1) voor 30 min.
- Twee extra keer wassen en Incubeer de monsters in cel serumvrij cultuurmedium voor een totaal van 1 uur bij 37 ° C.
4. Bioprinting van kraakbeen-analogen met een enkele celtype
- Tekenen van een 3D-model van het gewenste weefsel analoge. Converteren naar een bestand Gcode voor bioprinting en laad het bestand Gcode op de bioprinter1.
Opmerking: In dit protocol was een vierkante structuur met afmetingen 4,8 x 4.8 x 0,9 mm3 als een STL-bestand geëxporteerd. Een Gcode-bestand is gegenereerd op basis van de structuur van het lattice met behulp van de volgende instellingen: laagdikte, 0.3 mm; "infill"-patroon, rechtlijnige; "infill" dichtheid, 25%; toerental (10 mm/s). - Isoleren en primaire menselijke nasale chondrocyten (hNC) van patiënten na de waarnaar wordt verwezen protocol1cryopreserve.
- Ontdooien en vouw cryopreserved hNCs en eenmaal in enkelgelaagde cultuur met behulp van standaard kweekvloeistof bij 37 ° C. Loskoppelen van de cellen bij 80-90% samenloop met een trypsine/EDTA-oplossing van 0,5% en tellen met behulp van een trypan blauwe uitsluiting protocol. Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van hNCs bij passage 2.
- Resuspendeer de hNCs bij 100 x 106 cellen/mL binnen 300 µL cultuurmedium aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% penicilline-streptomycine en 50 µg Mo/mL ascorbinezuur, in voorbereiding voor het mengen met de bioink.
- Mix de hNC celsuspensie in een nanocellulose/alginaat gebaseerd bioink volgende de passieve mengen eenheid protocol op een 10:1 bioink:cell schorsing in verhouding tot het verkrijgen van een concentratie van de laatste cel van 9 x 106 cellen/mL.
- Zorg ervoor dat de bioprinter is gesteriliseerd via UV-blootstelling en veeg beneden met 70% ethanol. Steriliteit handhaven door te plaatsen in een laminaire flow kabinet.
- Steriele afdrukken sproeiers hechten aan de cartridges met de bioink/cel schorsing mengsels en invoegen in de bioprinter.
- Kalibreer de bioprinter hetzij handmatig, hetzij door de protocollen die specifiek zijn voor de printer.
- Bioprint de rooster-gestructureerd, cel-beladen constructies met behulp van de volgende afdrukparameters: 25G conische mondstuk bij een druk van 25 kPa. Bioprint cel-gratis constructies (gemengd met cel medium dat geen cellen) als een besturingselement.
- Cross-link van de constructies door toevoeging van een Ionische oplossing van 100 mM CaCl2 voor 5 min. spoelen de constructies en broeden in een kweekvloeistof onder standaard kweekomstandigheden (37 ° C, 5% CO2en 95% relatieve vochtigheid). Veranderen de media elke tweede of derde dag.
- Het verzamelen van monsters histologische p.a. op weken 2 en 4. De monsters voor GAG productie met behulp van een Alcian blauwe vlek18vlek.
5. Bioprinting van huid-analogen met twee celtypes
- Tekenen van een 3D-model van het gewenste weefsel analoge en converteren naar een bestand Gcode voor bioprinting. Laad het bestand Gcode op de bioprinter.
Opmerking: In dit protocol was een vierkante structuur met afmetingen 4,8 x 4.8 x 0,9 mm3 als een STL-bestand geëxporteerd. Dan een Gcode-bestand is gegenereerd op basis van de structuur van het lattice met behulp van de volgende instellingen: laagdikte, 0.3 mm; "infill"-patroon, rechtlijnige; "infill" dichtheid, 25%; toerental (10 mm/s). - Voorbereiden op de cellen mengen in de bioink voor bioprinting. Voor de fabrikatie van huid-analogen, werden twee celtypes gebruikt. De twee celtypes werden gemengd in de bioink en de bioprinting.
- Primaire HDF verkrijgen. Het handhaven van deze cellen in DMEM groei media aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% penicilline-streptomycine en 50 µg Mo/mL ascorbinezuur. Loskoppelen cellen bij 80-90% samenloop met een trypsine/EDTA-oplossing van 0,5% en de graaf.
- Isoleren en primaire hNC van patiënten na de waarnaar wordt verwezen protocol1cryopreserve. Ontdooien en cryopreserved hNCs in enkelgelaagde cultuur uit te breiden. Loskoppelen cellen bij 80-90% samenloop met een trypsine/EDTA-oplossing van 0,5% en de graaf.
- Resuspendeer beide celtypen bij 100 x 106 cellen/mL binnen groei media. Meng de cel schorsingen samen op een 1:1 verhouding tot het bereiken van een totale eindconcentratie van 100 x 106 cellen/mL in 300 µL van media.
- Mix de 50:50 celsuspensie van HDF en hNC in een nanocellulose/alginaat gebaseerd bioink volgende de passieve mengen eenheid protocol op een 10:1 bioink:cell schorsing in verhouding tot het verkrijgen van een concentratie van de laatste cel van 9 x 106 cellen/mL.
- Zorgen ervoor dat de bioprinter is gesteriliseerd of wordt geplaatst in een laminaire flow kabinet te handhaven van de steriliteit.
- Steriele afdrukken sproeiers hechten aan de cartridges met de bioink/cel schorsing mengsels en invoegen in de bioprinter.
- Kalibreren van het bioprinter ofwel handmatig of de protocollen die specifiek zijn voor de printer.
- Bioprint de rooster-gestructureerd, cel-beladen constructies met behulp van de volgende afdrukparameters: 25G conische mondstuk bij een druk van 25 kPa. Bioprint cel-gratis constructies (gemengd met cel medium dat geen cellen) als een besturingselement.
- Cross-link van de constructies door toevoeging van een Ionische oplossing van 100 mM CaCl2 voor 5 min. spoelen de constructies en broeden in een kweekvloeistof onder standaard kweekomstandigheden (37 ° C, 5% CO2en 95% relatieve vochtigheid). Veranderen de media elke tweede of derde dag.
- Het verzamelen van monsters histologische p.a. op weken 2 en 4. Vlekken van de monsters voor collageen ik productie met behulp van een Masson trichrome vlek19.
Representative Results
Resultaten in dit manuscript zijn onderverdeeld in twee secties. Ten eerste was de levensvatbaarheid van de cellen geanalyseerd na mengen met behulp van de mechanische methode of de passieve mengen eenheid. Het kraakbeen en huid constructies werden vervolgens gekweekt en geanalyseerd voor relevante histologische markeringen.
Cel distributie verscheen homogene in beide gevallen. De actie van het mengen met de hand met behulp van een spatel (Figuur 2b) heeft echter meer variantie dan mengen met een passieve mengen eenheid (Figuur 2een). De omvang, snelheid en mengen techniek met een spatel is sterk afhankelijk van de gebruiker. Echter het mengen van cellen in een bioink met een passieve mengen eenheid standaardiseert mengen en minimaliseert variatie in batches. Bovendien, de 30, 60 en 90 s mengen tijd mei niet volstaan voor het mengen van een grote hoeveelheid cellen in een grote hoeveelheid bioink. Strengere mengen door mengen met een spatel kan nodig zijn. Ter vergelijking, beter gebruik te maken van een passieve mengen eenheid onderhoudt de mengverhouding van de cellen te bioink tijdens het mengen en zorgt ervoor dat een homogeen mengen wordt uitgevoerd. Bovendien, is steekproef verlies een zorg met traditionele mengen technieken waar bioink kunnen worden achtergelaten in de petrischalen, buizen en mixing tools als gevolg van hun hoge viscositeit. De levensvatbaarheid van de cellen was hoog voor het mengen met een vermenging eenheid (> 90%) 1, 2 of 3 keer. Toen de passieve mengen eenheid werd gebruikt, nam mengen ongeveer 1 minuut langzaam overvloeien gestaag. Terwijl het mengen met een spatel tentoongesteld hoge levensvatbaarheid na het mengen voor 30 en 60 s, groter is dan 90 s van mengen resulteerde in een significante afname van de levensvatbaarheid in vergelijking met de andere fracties (77,9 ± 14%, p < 0.05) (Figuur 2c). Dit kan worden veroorzaakt door overmatige mengen die schade aan de cellen veroorzaakt. Op lange termijn leven/dood kleuring na 14 dagen en 28 dagen voor cultuur is vermeld in aanvullende figuur 1. Cellen beginnen verspreiding door dag 14, zijn zeer verspreid door dag 28 en geven goede levensvatbaarheid.
Na cultuur, zijn zowel kraakbeen en huid weefsel analogen geanalyseerd door middel van histologie. Analyse van kraakbeen constructies op dag 0, 14 en 28 blijkt een toename in de hoeveelheid en de dekking van GAGs zoals aangetoond door een Alcian blauw-vlek (Figuur 3a-3_c). Het ontbreken van de vlek is opgemerkt op dag 0, terwijl op dag 14 kleuring beperkt tot locaties proximale aan de cellen is. Echter door dag 28 van cultuur, de Alcian-blauwe soort komt verspreid over de constructie, de vorming van een chondrocytic ECM demonstreren. Bioprinted huid constructies werden geanalyseerd door middel van histologisch kleuring van collageen ik met behulp van een Masson van Trichrome vlek (Figuur 3d-3f). Gelijkaardig aan het kraakbeen constructies, dag 0 monsters tentoongesteld geen afzetting van collageen. Dag 14 van cultuur, waren substantiële deposito's van collageen aangetekend rond de cellen en langs het oppervlak van de constructie. Dit werd verder versterkt door dag 28, zoals dichte collageen lagen werden gevonden op het oppervlak van de constructie en binnen het grootste deel.
Figuur 1 : Passieve Unit systeem mengen. (een) 1 mL spuit voor celsuspensie, (b) 12 mL spuit met bioink, de verstrekking eenheid (c), (d) passieve mengen eenheid (e) patroon, (f) vergadering van de bioink spuit (1) en cel vullen schorsing spuit (2) in de verstrekking eenheid, bevestiging van de passieve mengen eenheid aan het einde van zowel spuiten (3), (g) beslag op de vrouw-vrouw Luer lock connector (4) als gehechtheid van de cartridge vullen (5) voltooit het montage-, (h ) comprimeren de verstrekking eenheid prime de vermenging eenheid (6), (ik) blijven drukken op de verstrekking eenheid te mengen van de celsuspensie met de bioink en afzien in de cartridge vullen (7). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Cel levensvatbaarheid beelden en analyse. Representatieve afbeeldingen tonen live (groen) en doden (rood) menselijke fibroblasten na het mengen met de passieve mengen van eenheid 1, 2 of 3 keer (een) of spatel voor 30, 60 of 90 seconden (b) en 3D cultuur voor 1 dag. Beelden op 4 X vergroting worden getoond. Schaal staven geven 200 µm. (c) percentage gemiddelde levensvatbaarheid van menselijke fibroblasten na het mengen met de passieve unit of spatel en 3D cultuur mengen voor 1 dag. Foutbalken Toon standaarddeviatie van het gemiddelde, * 0.005. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: weefsel specifieke extracellulaire Matrix depositie. Bioprinted kraakbeen constructies gekleurd voor glycosaminoglycanen met behulp van Alcian op (een) blauw dag 0, (b) 14, en (c) 28. Afbeeldingen die zijn vastgelegd op 5 X vergroting. Bioprinted huid constructies voor collageen mij using Masson van Trichrome (d) dag 0, (e) 14, gekleurd en (f) 28. Afbeeldingen die zijn vastgelegd op 5 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: de levensvatbaarheid van de cellen op dag 14 (een), en dag 28 (b). Schaal bar is 200 µm, groene verwijst naar de levende cellen, rood verwijst naar de dode cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Zoals aangetoond in dit manuscript, moesten pre-cellularized bioinks bioprinted fabriceren of kraakbeen of huid analogen die werden gekweekt voor maximaal 4 weken. Levensvatbaarheid van de cellen na mengen met behulp van de passieve mengen eenheid techniek was hoger dan de traditionele mengen methoden. Bovendien, de vereenvoudiging van de overvloeimodus proces met behulp van de vermenging eenheid minimaliseert het aantal stappen afhandelen en zorgt voor betere consistentie in de omvang van het mengen. Uiteindelijk, dit resulteert in betere reproduceerbaarheid in beide cel distributie binnen de bioink, en over constructies en experimentele groepen. Afzetting van weefsel specifieke ECM componenten zoals GAGs en collageen ik werd waargenomen voor zowel het kraakbeen en huid-analogen, respectievelijk na 4 weken van cultuur. Dit geeft de flexibiliteit van zowel de mengen techniek en de geometrie van de gekozen constructie te fabriceren van verschillende weefsel doelen. De fabricage van zowel kraakbeen en huid-analogen tentoongesteld de flexibiliteit van zowel het gebruik van een nanocellulose-alginaat-bioink en de bioprinting-techniek voor de doelstellingen van de verschillende gemanipuleerde weefsel. We zullen twee componenten van de studie hieronder: (1) de passieve mengen eenheid techniek, en (2) het gedrag van de cellen binnen kraakbeen en huid-analogen.
De ontwikkeling en de optimalisatie van een techniek voor het mengen van een celsuspensie in een bioink was primordiaal voor de fabrikatie van deze constructies. In tegenstelling tot traditionele lage viscositeit hydrogel materialen resulteerde de hoge viscositeit van het bioinks in moeilijkheden in de pre-cellularization van een bioink voorafgaand aan druk. Als alternatief voor de traditionele methode van cel opneming in een bioink, is een protocol voor het mengen van de stap van een celsuspensie in een viskeus bioink ontwikkeld en besproken. Bovendien, werd de praktische toepassing van deze mengen techniek in de fabricage van weefsel constructies geëvalueerd. Deze mengen one-step-aanpak heeft verscheidene voordelen over traditionele technieken opgenomen gecontroleerde mengen mengverhouding, minimalisering van hoge en onregelmatig schuifspanningen, en een gesloten systeem te elimineren monster sluit in het mengen van vaartuigen. Er zijn echter verschillende kritische stappen in deze techniek om haar voordelen ten opzichte van de traditionele methoden voor het mengen van de cel/bioink. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de cellen in de cel spuit zijn opgeschort en goed vermengd voordat het overvloeien. Te groot van een tijdsverschil tussen het opheffen en de overdracht van de cellen in de spuit en begin het mengen proces kan de cellen sediment, die leiden ongelijke mengen en distributie in een afgedrukte gloeidraad tot zal. Als sedimentatie waargenomen, eenvoudige inversie (2 - 3 maal) van is is de passieve mengen eenheid vergadering onmiddellijk voorafgaand aan het mengen voldoende om resuspendeer de cellen en te zorgen voor een uniforme verdeling voorafgaand aan vermenging. Het is ook cruciaal dat luchtbellen in de spuiten zijn uitgeschakeld of geminimaliseerd voorafgaande om ervoor te zorgen dat de mengverhouding constant blijft. Als grote luchtbellen in de bioink-cartridge voorafgaand aan vermenging blijven, is het raadzaam dat de oplossing worden uitgevoerd via de vermenging eenheid een extra tijd om homogenisatie van het mengsel. Als luchtbellen blijven, kan zachte aftappen van de afdrukken cartridge/spuit verdringen residuele luchtbellen. Bovendien, als meerdere materiaal mengen (meerdere mengen eenheden of materialen) voor complexere constructies nodig is, moeten de concentraties van de bioinks/cel schorsingen worden gemengd worden aangepast om ervoor te zorgen dat na verdunning door mengen, de juiste eindconcentratie is nog steeds bereikt.
In vergelijking met andere overvloeimodus technieken is de passieve mengen eenheid een nieuwe benadering voor cellularize bioinks. In tegenstelling tot andere mengen technieken zoals dual spuit mengen en roeren met een spatel of ander gereedschap, kunt de passieve mengen eenheid meer consistentie in het mengen van in batches en gebruikers. De aard van handmatig mengen technieken, zoals een spatel mengen, resulteert in een grotere variatie van de gebruiker-tot-gebruiker in de omvang van en de snelheid van het mixen. Daarnaast hebben gesloten systemen zoals de passieve mengen eenheid en dual spuit mengen weinig tot geen monster verlies in vergelijking met handmatig mengen in een petrischaal of buis.
Beide analogen van de weefsel vervaardigd in dit manuscript bestond uit één enkel type van bioink en één of twee celtypes. De bioprinting van weefsel-analogen die bestaan uit platforms die bevatten van de regio's van verschillende bioinks met verschillende celtypes kan evenwel nodig zijn voor de fabricage van meer fysiologische weefsel constructies20,21, 22. Meer gespecialiseerd bioinks met unieke composities of functionaliteiten kunnen worden gegenereerd door het mengen van verschillende soorten bestaande bioinks samen te maken multimaterial bioinks die verschillende composities of functionaliteiten23hebben, 24. Dit kan zijn met name belangrijk bij weefsel overgangsregio's zoals de huid tot subcutane laag of het kraakbeen aan de regio van een weefsel waar een helling van25,26 van de samenstelling van de bioink kunnen nodig zijn om de ontwikkeling van de bot deze kritische gebieden gevonden in native weefsels27. Bovendien, kan een vermenging eenheid worden gebruikt om te mengen in de factoren die de groei en morphogens in de bioinks voorafgaand aan de bioprinting. De afschaffing van de steekproef verlies met de gesloten mengen systeem is aantrekkelijk voor het gebruik van dure en lage concentratie bioactieve factoren, waar monster verlies kan leiden tot een wijziging van hun uiteindelijke concentratie binnen de bioprinted constructie, met name wanneer Kleurovergangen zijn betrokken.
Een beperking met elke mengen techniek, met inbegrip van de passieve mengeenheid gebruikt in deze studie is het risico van schade aan mechanisch gevoelige celtypes. Bijvoorbeeld, geïsoleerd stamcellen dergelijke die uit het beenmerg of embryo of geïnduceerde pluripotente stamcellen zijn meer vatbaar voor mechanische schade28,29. De handeling van het mengen van abnormale mechanische belasting op de cellen als gevolg van de shear krachten die betrokken zijn bij het mengen proces worden doorgegeven, en zij moeten worden afgewogen voor het behoud van levensvatbaarheid30. Terwijl het gebruik van primaire fibroblasten en chondrocyten in deze studie resulteerde in goede levensvatbaarheid (Figuur 2), zijn meer studies nodig om te bepalen van de veilige mengen tarieven en ratio's voor gevoeliger celtypes. Tot dan is het aangeraden dat het mengen worden uitgevoerd onder een langzame gestaag aan het maximaliseren van de levensvatbaarheid. Bovendien was de celdichtheid in deze studie gekozen bepaald op basis van eerdere studies1. Deze celdichtheid wellicht niet ideaal voor alle celtypes.In het bijzonder, mengen van cellen met een hogere concentratie kan leiden tot grotere cel-cel-contactpersonen die levensvatbaarheid van de cellen en weefsel vorming31,32kunnen verbeteren. In dezelfde geest, kan de passieve mengen eenheid gelden voor het mengen van de cel spheroïden of andere cel aggregaten33 in bioinks.
Zoals voorgesteld en gedemonstreerd in deze studie, een passief mengen unit systeem kunt snel een celsuspensie te verwerken in een viskeus bioink. Terwijl het risico van mechanische schade aan de cellen nog steeds, de aanpak maakt het mogelijk meer consistentie in het mengen van binnen een enkel onderzoek en tussen gebruikers. Pre-cellularized bioinks met behulp van deze aanpak werden gebruikt om het fabriceren van beide kraakbeen en huid analogen die werden gekweekt voor maximaal 4 weken, en aangetoond afzetting van weefsel specifieke ECM markers. Toekomstige studies zal zich richten op het gebruik van de passieve unit systeem om het mengen van de gespecialiseerde bioinks van gestandaardiseerde bioinks voor de fabrikatie van meer complexe weefsel analogen mengen.
Disclosures
De auteurs van dit manuscript zijn werknemers van CELLINK LLC.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen bevestigingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STARTINK Kit | CELLINK | SK0001 | Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure |
| Live/Dead Kit | Life Technologies | L3224 | Kit for the analysis of cell viability after mixing |
| Masson's Trichrome | Sigma Aldrich | HT15-1KT | Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs |
| Alcian Blue | Sigma Aldrich | B8438-250ML | Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs |
| INKREDIBLE+ bioprinter | CELLINK | Gen1+ | Printer utilized in the study |
| DMEM with Glutamax | Thermofisher | 10566016 | Media for culture of the cells |
| 10% fetal bovine serum | Thermofisher | A3160402 | Media supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | Media supplement |
| live cell imaging solution | thermofisher | A14291DJ | component utilized using live/dead imaging |
| inverted microscope | Olympus | IX73 | microscope utilized |
| a digital color camera | Olympus | XC10 | microscope camera utilized |
| cellSens imaging software | Olympus | n/a | stock software with the microscope |
| ImageJ | NIH | n/a | open source image analysis software |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | n/a | software for statistical analysis |
| Slic3r software (v1.2.9) | Slic3r | n/a | open-source software to convert .stl file to gcode |
| primary adult human dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | cell source for fibroblasts |
References
- Avila, H. M., Schwarz, S., Rotter, N., Gatenholm, P. 3D bioprinting of human chondrocyte-laden nanocellulose hydrogels for patient-specific auricular cartilage regeneration. Bioprinting. 1, 22-35 (2016).
- Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Eng Part C Methods. 20 (6), 473-484 (2013).
- Costantini, M., et al. Microfluidic-enhanced 3D bioprinting of aligned myoblast-laden hydrogels leads to functionally organized myofibers in vitro and in vivo. Biomaterials. 131, 98-110 (2017).
- Fedorovich, N. E., et al. Biofabrication of Osteochondral Tissue Equivalents by Printing Topologically Defined, Cell-Laden Hydrogel Scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 18 (1), 33-44 (2011).
- Vijayavenkataraman, S., Lu, W. F., Fuh, J. Y. H. 3D bioprinting of skin: a state-of-the-art review on modelling, materials, and processes. Biofabrication. 8 (3), 032001 (2016).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P. W., Grijpma, D. W., Kellomäki, M. A review of rapid prototyping techniques for tissue engineering purposes. Ann Med. 40 (4), 268-280 (2008).
- Xu, T., Jin, J., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing of viable mammalian cells. Biomaterials. 26 (1), 93-99 (2005).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Bioeng. 106 (6), 963-969 (2010).
- Parsa, S., Gupta, M., Loizeau, F., Cheung, K. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).
- Derby, B. Inkjet printing of functional and structural materials: fluid property requirements, feature stability, and resolution. Annu Rev Mater Res. 40, 395-414 (2010).
- Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Adv Mater. 28 (4), 677-684 (2016).
- Ober, T. J., Foresti, D., Lewis, J. A. Active mixing of complex fluids at the microscale. Proc Natl Acad Sci. 112 (40), 12293-12298 (2015).
- Shabnam, P., Madhuja, G., Frédéric, L., Karen, C. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnol Bioeng. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Niu, X., Lee, Y. -K. Efficient spatial-temporal chaotic mixing in microchannels. J Micromech Microeng. 13 (3), 454 (2003).
- Liu, R. H., et al. Passive mixing in a three-dimensional serpentine microchannel. J Microelectromech Syst. 9 (2), 190-197 (2000).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr protoc immunol. , A3. B. 1-A3. B (2001).
- Scott, J., Dorling, J. Differential staining of acid glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) by alcian blue in salt solutions. Histochem Cell Biol. 5 (3), 221-233 (1965).
- Garvey, W. Modified elastic tissue-Masson trichrome stain. Stain technol. 59 (4), 213-216 (1984).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. -M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- KÖpf, M., Campos, D. F. D., Blaeser, A., Sen, K. S., Fischer, H. A tailored three-dimensionally printable agarose-collagen blend allows encapsulation, spreading, and attachment of human umbilical artery smooth muscle cells. Biofabrication. 8 (2), 025011 (2016).
- Gurkan, U. A., et al. Engineering anisotropic biomimetic fibrocartilage microenvironment by bioprinting mesenchymal stem cells in nanoliter gel droplets. Mol Pharm. 11 (7), 2151-2159 (2014).
- Ma, Y., Ji, Y., Huang, G., Ling, K., Zhang, X., Xu, F. Bioprinting 3D cell-laden hydrogel microarray for screening human periodontal ligament stem cell response to extracellular matrix. Biofabrication. 7 (4), 044105 (2015).
- Lu, H. H., Thomopoulos, S. Functional attachment of soft tissues to bone: development, healing, and tissue engineering. Annu Rev Biomed Eng. 15, 201-226 (2013).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2011).
- Parisi-Amon, A., Mulyasasmita, W., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-Engineered Injectable Hydrogel to Improve Retention of Transplanted Adipose-Derived Stem Cells. Adv Healthc Mater. 2 (3), 428-432 (2013).
- Qiu, X., De Jesus, J., Pennell, M., Troiani, M., Haun, J. B. Microfluidic device for mechanical dissociation of cancer cell aggregates into single cells. Lab Chip. 15 (1), 339-350 (2015).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14 (5), 633-640 (2002).
- Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
