Brosk och hud analoger var bioprinted med en nanocellulosa-alginat baserat bioink. Bioinks var cellularized före utskrift via ett enda steg passiva skakningsenheten. Konstruktioner visades vara enhetligt cellularized, har hög lönsamhet och uppvisar goda markörer för differentiering.
Bioprinting är en kraftfull teknik för snabba och reproducerbara tillverkning av konstruktioner för vävnad tekniska tillämpningar. I denna studie var både brosk och hud analoger fabricerade efter bioink pre-cellularization utnyttja en roman passiv enhet blandningsteknik. Denna teknik utvecklades i syfte att förenkla de olika stegen i blandning av en cellsuspension i en mycket trögflytande bioink. Resolution av filament deponeras genom bioprinting nödvändiggör försäkran om enhetlighet i cell distribution innan du skriver ut att undvika nedfall av regioner utan celler eller kvarhållande av stora cell klumpar som kan täppa till nålen. Vi visa förmåga att snabbt blanda en cellsuspension med en bioink före bioprinting av både brosk och hud analoger. Båda vävnad analoger kunde vara odlade i upp till 4 veckor. Histologisk analys visat både cellernas viabilitet och nedfall av vävnad specifika extracellulär matrix (ECM) markörer såsom glykosaminoglykaner (GAG) och kollagen jag respektive.
Under de senaste åren, har tredimensionella (3D) bioprinting tekniken blivit mer tillgängliga för forskare, så att tekniken blir mer allmänt utnyttjade för tillverkning av vävnad analoger. Bioprinting lovar att revolutionera biomedicinsk forskning genom att underlätta snabba och repeterbar tillverkning av mångfacetterade vävnad konstruktioner. Den springande punkten i den bioprinting tekniken lägger i förmågan att exakt kontrollera nedfall av biomaterial (känd som bioinks) i tre dimensioner. Detta tillåter generationen av komplexa ställningar med distinkta regioner av matrix kompositioner, bioaktiva faktorer och celler som kan mer exakt recapitulate infödda vävnadsstrukturen.
Bioprinting har använts för tillverkning av konstruktioner för många vävnad program inklusive brosk1, hud2, muskel3och ben4. Dessa vävnader är attraktiva för bioprinting på grund av deras inneboende tvärstrimmig mikro-arkitekturer som är lämpliga för rekapitulation via lager-för-lager nedfall. Särskilt äger huden en väldefinierad mångbottnat struktur5, som passar för tillverkning genom lager-för-lager nedfall tekniker såsom bioprinting. Dessutom bioprinting kan utnyttjas för att skapa konstruktioner som besitter de nödvändiga anatomiska dimensionerna och former att reparera vävnad defekt. Förmågan att generera biomaterial med patientspecifika storlek och form6 kan börja möta efterfrågan för partiell reparationer av många vävnader inklusive men begränsat inte till ben defekter, broskskador och hudlesioner vars omfattning varierar från patient-till-patient.
I denna studie var två vävnad analoger (ledbrosk och hud) fabricerade genom bioprinting av pre-cellularized bioinks. Säkerställa adekvat blandning av en bioink med cellsuspension som kan säkerställa enhetliga cell fördelning medan bevara cellviabilitet kan vara en utmaning. Bioinks lämpar sig för bioprinting via extrudering är ofta mycket trögflytande och kräver därför omfattande blandning för att säkerställa en homogen blandning. Mekaniska skador på celler kan uppstå under hård blandning och negativt påverka livskraft. Studier har visat att de flesta celldöd under inkjet utskriften sker under beredning såsom blandning7,8. Medan traditionell blandning med agitation9 kan räcka för låg viskositet bioinks lämplig för inkjet utskrifter10, är blandning av celler i en hög viskositet bioink mer lämplig för extrudering bioprinting svårare. Att möta detta behov, har användning av blandning munstycken blivit mer populärt för blandning av bioinks under utskrift processen11. Dessa blandare har också använts allmänt i mikrofluidik forskning där blandning av vätskor med låga Reynoldstal är viktigt12. Utnyttjandet av en kontinuerlig blandning process att smälta en cellsuspension in en bioink skulle möjliggöra enhetlighet under tryckprocessen. Men sedan cellsuspensioner äger låg viskositet jämfört med en bioink, kommer uppstår svårigheter att förhindra sedimentering av celler under utskrift processen9,13,14. Alternativt, blandning av celler i en bioink före utskrift kan lösa problemet.
För att minimera celldöd under blandning i en bioink, utvecklat vi en teknik som bygger på en passiv skakningsenheten till smälta celler in i en bioink i det minimala antalet steg. Kaotisk blandning genereras genom flödet av material genom skakningsenheten räcker till reproducibly blandning två komponenter tillsammans15,16. Denna metod utvecklades främst för att förenkla blandning av någon cellsuspension med någon bioink som passar för extrudering bioprinting. Antalet steg i blandningen var minimeras för att eliminera användare-till-användare variation i blandning. Överdriven blandande steg kan vara tidskrävande och inte gäller för alla bioinks, särskilt när celler är inblandade. Sekundära, syftar vi till att utveckla en blandande process som var fristående att både bevara sterilitet och minimera prov förlust.
I detta manuskript visar vi att blanda en cellsuspension med en bioink som använder en passiv enhet blandningsteknik som minimerar hanteringen och resulterar i hög cell livskraft och enhetlig fördelning. Dessa pre-cellularized bioinks utnyttjas sedan till bioprint brosk eller hud konstruera med en eller två celltyper, respektive som odlas för upp till 6 veckor. Den bioink som utnyttjas är en alginat-nanocellulosa blandning, som tidigare visat lämplighet för bioprinting1.
Som visat i detta manuskript, var pre-cellularized bioinks bioprinted att tillverka antingen brosk eller hud analoger som odlades för upp till 4 veckor. Cellernas viabilitet efter blandning med passivummen blandningsteknik enhet var högre än de traditionella blanda metoderna. Dessutom en förenkling av blandning processen med skakningsenheten minimerar antalet hantering steg och möjliggör bättre enhetlighet i omfattningen av blandning. Slutligen, detta resulterar i bättre reproducerbarhet i båda cell fördelning inom bioink, och över konstruktioner och experimentella grupper. Nedfall av vävnad specifika ECM komponenter såsom GAGs och kollagen jag observerades för både brosk och hud analoger, respektive efter 4 veckor av kultur. Detta indikerar flexibilitet både blandning tekniken och valt konstruera geometri att fabricera olika vävnad mål. Tillverkning av både brosk och hud analoger utställda flexibiliteten i både användningen av en nanocellulosa-alginat bioink och bioprinting teknik för distinkta bakåtkompilerade vävnad mål. Vi kommer att diskutera två komponenter i studien nedan: (1) passiv blandning enhet teknik och (2) beteendet hos celler inom brosk och hud analoger.
Utveckling och optimering av en teknik för blandning av en cellsuspension till en bioink var avgörande för tillverkning av dessa konstruktioner. Till skillnad från traditionella låg viskositet hydrogel material resulterade av bioinks höga viskositet i svårigheter i pre-cellularization av en bioink före utskrift. Som ett alternativ till den traditionella metoden att cellen införlivande i en bioink, ett protokoll för one-step blandning av en cellsuspension i en trögflytande bioink utvecklades och diskuterade. Dessutom utvärderades den praktiska tillämpningen av denna blandning teknik vid tillverkning av vävnad konstruktioner. Detta one-step blandande tillvägagångssätt har flera fördelar jämfört med traditionella tekniker ingår kontrollerad blandning blandningsförhållandet, minimering av hög och oregelbundna skjuvspänningar, och ett slutet system att eliminera prov Stäng i blandning fartyg. Dock finns det flera kritiska steg i denna teknik för att säkerställa dess fördelar jämfört med traditionella metoder för cell/bioink blandning. Det är viktigt att säkerställa att cellerna i cell sprutan är upphängd och väl blandade innan man blandar. Alltför stor av en tidslucka mellan lyft och överföring av cellerna i sprutan och börjar blandningen kan orsaka cellerna att sediment, som kommer att resultera i ojämn blandning och fördelning i en tryckt glödtråd. Om sedimentering är observerade, enkla inversion (2 – 3 gånger) av är sammansättningen för passiv enhet för blandande omedelbart före blandning tillräcklig för att resuspendera cellerna och säkerställa en enhetlig fördelning innan man blandar. Det är också viktigt att luftbubblor i sprutorna elimineras eller minimeras före så att mixningsförhållandet förblir konstant. Om stora luftbubblor kvar i bioink tonerkassetten innan man blandar, rekommenderas det att lösningen kan köras genom skakningsenheten en ytterligare tid för att säkerställa omsorgsfull blandning. Om luftbubblor finns kvar, kan mild avlyssning av utskrift patron/sprutan förskjuta kvarvarande luftbubblor. Dessutom, om flera material blandning (flera blandande enheter eller material) är nödvändigt för mer komplexa konstruktioner, måste koncentrationerna av de bioinks/cellsuspensioner blandas justeras för att säkerställa att efter spädning genom blandning, rätt slutlig koncentration uppnås ändå.
I jämförelse med andra blandningstekniker är passiv skakningsenheten en ny metod för cellularize bioinks. Till skillnad från andra blandande tekniker såsom dubbla spruta blandning, eller omrörning med en spatel eller annat verktyg, tillåter passiv skakningsenheten mer konsekvens att blanda över partier och användare. Arten av manuell blandande tekniker, såsom en spatel blandning, resulterar i större användare-till-användare variation i omfattningen av och graden av blandning. Dessutom har slutna system såsom passiv blanda enhet och dubbla spruta blandning lite till ingen prov förlust jämfört med manuell blandning i en petriskål eller tub.
Båda vävnad analoger fabricerade i denna manuskriptet bestod av en enda typ av bioink och en eller två celltyper. Bioprinting av vävnad analoger som består av arkitekturer som innehåller regioner av olika bioinks med olika celltyper kan dock vara nödvändiga för tillverkning av mer fysiologiska vävnad konstruktioner20,21, 22. Mer specialiserade bioinks med unika kompositioner eller funktioner kan genereras genom en blandning av flera typer av befintliga bioinks för att skapa multimaterial bioinks som har distinkta kompositioner eller funktioner23, 24. Detta kan vara särskilt viktigt på vävnad övergångsregioner såsom huden för subkutan lager eller brosket till ben regionen av en vävnad där en gradient av bioink sammansättning25,26 kan vara nödvändiga för att säkerställa utvecklingen av dessa kritiska regioner hittade i native vävnader27. Dessutom skulle en skakningsenheten kunna utnyttjas för att blanda i tillväxtfaktorer och morphogens in bioinks före bioprinting. Eliminering av prov förlust med stängda blandande system är attraktiv för användning av dyra och låg koncentration bioaktiva faktorer, där prov förlust kan leda till en förändring till deras slutliga koncentration inom den bioprinted konstruktionen, särskilt när lutningar är inblandade.
En begränsning med någon blandning teknik, inklusive den passiva blandarenhet utnyttjas i denna studie, är risken för skador på mekaniskt känsliga celltyper. Exempelvis isolerade sådana stamceller från benmärg eller embryot, eller inducerade pluripotenta stamceller är mer mottagliga för mekaniska skador28,29. Handlingen att blanda förmedlar onormala mekaniska spänningar i celler på grund av de skeva styrkorna involverade i processen blandning, och de måste vara balanserade för att bevara livskraften30. Användning av primära fibroblaster och kondrocyter i denna studie resulterade i bra lönsamhet (figur 2), är fler studier nödvändiga för att fastställa säkra blandning priser och kvoter för känsligare celltyper. Tills dess rekommenderas det att blandning utförs under stadig långsamt att maximera lönsamheten. Dessutom bestämdes cell densiteten valt i denna studie baserat på tidigare studier1. Denna cell densiteten kan inte vara perfekt för alla celltyper.I synnerhet kan blandning celler vid en högre koncentration resultera i ökad cell-cell kontakter som kan förbättra cellernas viabilitet och vävnad formation31,32. På liknande sätt kunna passiv skakningsenheten tillämpas att blanda cell spheroids eller andra cell aggregat33 i bioinks.
Som föreslås och visat i denna studie en passiv blandning enhet systemet kan snabbt blanda en cellsuspension till en trögflytande bioink. Medan risken för mekaniska skador på cellerna fortfarande, tillåter metoden mer konsekvens i blandning inom en enda studie och över användare. Pre-cellularized bioinks utnyttja denna metod användes för att tillverka både brosk och hud analoger som var odlade för upp till 4 veckor, och visat nedfall av vävnad specifika ECM markörer. Framtida studier kommer att fokusera på användningen av den passiva blandning enhet systemet för att blanda specialiserade bioinks från standardiserade bioinks för tillverkning av mer komplexa vävnad analoger.
The authors have nothing to disclose.
Författarna har inga bekräftelser.
STARTINK Kit | CELLINK | SK0001 | Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure |
Live/Dead Kit | Life Technologies | L3224 | Kit for the analysis of cell viability after mixing |
Masson's Trichrome | Sigma Aldrich | HT15-1KT | Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs |
Alcian Blue | Sigma Aldrich | B8438-250ML | Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs |
INKREDIBLE+ bioprinter | CELLINK | Gen1+ | Printer utilized in the study |
DMEM with Glutamax | Thermofisher | 10566016 | Media for culture of the cells |
10% fetal bovine serum | Thermofisher | A3160402 | Media supplement |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | Media supplement |
live cell imaging solution | thermofisher | A14291DJ | component utilized using live/dead imaging |
inverted microscope | Olympus | IX73 | microscope utilized |
a digital color camera | Olympus | XC10 | microscope camera utilized |
cellSens imaging software | Olympus | n/a | stock software with the microscope |
ImageJ | NIH | n/a | open source image analysis software |
GraphPad Prism 7 | GraphPad | n/a | software for statistical analysis |
Slic3r software (v1.2.9) | Slic3r | n/a | open-source software to convert .stl file to gcode |
primary adult human dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | cell source for fibroblasts |