Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine einfache, schnelle und effiziente Prion-Verstärkung-Technik, die Echtzeit-Beben-induzierte (RT-QuIC) Konvertierungsmethode beschreiben.
Abstract
Die RT-QuIC-Technik ist ein sensibler in-vitro- zellfreie Prion Verstärkung Assay basiert hauptsächlich auf die kernigen Fehlfaltung und Aggregation von rekombinanten Prion Protein (PrP) Substrat mit Prion Samen als Vorlage für die Konvertierung. RT-QuIC ist eine neuartige Hochdurchsatz-Technik, analog zur Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Nachweis von Amyloid Fibrille Wachstum basiert auf den Farbstoff Thioflavin T, die auf spezifische Wechselwirkung mit ᵦ-Blatt reichen Proteinen fluoresziert. So kann Amyloid Bildung in Echtzeit erkannt werden. Wir haben versucht, zuverlässige nicht invasive Screening-Test zur Erkennung von chronischen wasting Disease (CWD) Prionen in fäkale Extrakt zu entwickeln. Hier haben wir speziell die RT-QuIC Technik zu offenbaren, dass PrPSc Aussaat Aktivität im Kot von CWD Hirschartigen infiziert. Anfangs war die Sämaschinen Aktivität der fäkalen Extrakte, die wir vorbereitet in RT-QuIC, möglicherweise wegen eines möglichen Assay-Hemmer im fäkalen Material relativ gering. Zur Verbesserung Sämaschinen Aktivität von Kot-Extrakten und entfernen mögliche Assay-Inhibitoren, homogenisiert wir Stuhlproben in einem Puffer mit Wasch- und Protease-Inhibitoren. Wir reichten auch Proben unterschiedlicher Methoden, PrPSc auf der Grundlage von Proteinfällung mit Natrium Phosphotungstic Acid und Zentrifugalkraft zu konzentrieren. Schließlich wurden die Kot-Extrakte durch optimierte RT-QuIC getestet, die Substrat-Ersatz in das Protokoll zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit enthalten. So haben wir ein Protokoll für empfindliche Detektion von CWD Prion Aussaat Aktivität im Kot der vorklinischen und klinischen Hirschartigen durch RT-QuIC, die ein praktisches Werkzeug für nichtinvasive Diagnostik der CWD sein kann.
Introduction
Prion-Krankheiten oder transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) sind Neurodegenerative Erkrankungen einschließlich der Creutzfeldt - Jakob-Krankheit (CJK) beim Menschen, bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern, Scrapie bei Schafen und Ziegen und chronische verschwenden Disease (CWD) in Hirschartigen 1,2. TSE zeichnen sich durch markante spongiforme aussehen und Verlust von Nervenzellen im Gehirn. Nach der Hypothese "Protein nur" sind Prionen hauptsächlich bestehend aus PrPSc ("Sc" für Scrapie) 3, fehlgefaltete Isoform des Host-kodierten zellulären Prion-Proteins, PrPC. PrP-Sc ergibt sich aus der Umrechnung von PrPC eine Konformation in ᵦ-Blätter 4,5,6 dienen kann, wie ein Samenkorn zu binden und konvertieren andere PrPC Moleküle angereichert. Die neu generierten PrPSc -Moleküle sind in wachsenden Polymer 7,8 eingearbeitet in kleineren Oligomere, wodurch höhere Anzahl von infektiösen Kerne einbricht. PrP-Sc ist anfällig für Aggregation und teilweise resistent gegen Proteasen 9,10.
CWD betrifft, Wild- und Zuchtfisch Elche (Cervus Canadensis), Maultierhirsch (Odocoileus Hemionus), weiß - angebundene Rotwild (WTD; Odocoileus Virginianus), Elch (Alces Alces) und Rentiere (Rangifer Tarandus Tarandus) 11,12,13. Es gilt die ansteckende Prion-Krankheit mit horizontale Übertragung von Cervid Interaktionen und Umwelt Fortbestehen der Infektiosität 14,15begünstigt. Im Gegensatz zu anderen Prion-Krankheiten wo PrPSc Akkumulation und Infektiosität des Gehirns beschränkt sind, in CWD diese finden auch in peripheren Geweben und Körperflüssigkeiten z.B. Speichel, Urin und Kot 16,17, 18.
Immunohistochemistry gilt als der Goldstandard für CWD Diagnose zur Erkennung von PrPSc Verteilung und spongiformen Läsionen 19,20. ELISA und western-Blot sind in seltenen Fällen auch für CWD Diagnostik verwendet. Somit basiert hauptsächlich aktuelle Prion-Krankheit-Diagnose auf der Erkennung von Prionen in Post-Mortem-Geweben. Ante-Mortem-Diagnose für CWD steht mit Mandeln oder Gewebebiopsien Recto-anal Mukosa-assoziierten lymphatischen (RAMALT); aber dieses Verfahren ist invasiv und erfordert die Erfassung der Tiere. Somit wäre die Verwendung von leicht zugänglichen Exemplare, wie Urin und Kot, eine praktische Möglichkeit für CWD Prion-Erkennung. Aber diese Ausscheidungen Hafen relativ niedrige Konzentrationen von Prionen unterhalb der Nachweisgrenze der aktuellen diagnostischen Methoden. Infolgedessen ist ein empfindlicher und hohen Durchsatz-Diagnose-Tool erforderlich. In-vitro- Conversion-Systeme, wie z. B. Protein misfolding cyclic Amplification assay (PMCA) 21, Amyloid Aussaat Assay und Echtzeit-Beben-induzierte Umwandlung (RT-QuIC) Assay 22,23, 24 sind sehr mächtige Werkzeuge, der selbst verbreitende Fähigkeit der PrP-Sc , in Vitro zu imitieren die Prion-Konvertierung zu nutzen und dadurch verstärken die Präsenz der winzige Mengen von PrPSc zu nachweisbaren Konzentrationen 25 ,26. Die RT-QuIC-Methode nutzt jedoch die Tatsache, dass die Konvertierung Produkt bereichert in β-Sheet Sekundärstruktur speziell Thioflavin T (TEN-T) binden kann. Daher wächst rekombinante PrP (rPrP) bei der gesäten Wandlung zu Amyloid-Fibrillen, die Th-T zu binden und können somit in Echtzeit durch die Messung der Fluoreszenz von Th-T ausgedrückt als relative Fluoreszenz Einheiten (RFU) im Laufe der Zeit erkannt werden. Sobald überwacht, kann die RFU verwendet werden, um relative seeding Aktivitäten und quantitative Parameter wie der Lag-Phase zu bewerten. Die Lag-Phase stellt die Uhrzeit (h) erforderlich, um die Schwelle zu erreichen, während die rPrP Umsatz in der frühen Phase der Reaktion unter der Nachweisgrenze der Th-T Fluoreszenz ist. Zum Jahresende die scheinbare Verzögerung Phase, zur Bildung von einem ausreichend Amyloid-Kern (Keimbildung/Dehnung), begleitende tritt auf, wenn die Th-T Fluoreszenz den Schwellenwert überschreitet und wird positiv. Das Wachstum von Amyloid Fibrillen in Echtzeit und die anfängliche PrPSc oder Sämaschinen Aktivität in der Probe enthaltenen nachgewiesen werden können wird durch Segmentierung verstärkt die mehr Samen erzeugt. Diese Samen verursachen wiederum eine raschere exponentielle Wachstumsphase Amyloid Faser.
Da dieser Test so niedrig wie 1 zu erkennen ist fg PrPSc 24, die hohe Empfindlichkeit qualifiziert diese Technik, Ante-Mortem oder nichtinvasive Diagnostik zu erreichen durch das Erkennen von PrPSc in verschiedenen peripheren Geweben, Ausscheidungen oder andere Arten der Probe geringe Infektiosität beherbergen. RT-QuIC bietet auf jeden Fall Vorteile gegenüber anderen Assays für die Reproduzierbarkeit, Funktionalität, Schnelligkeit (weniger als 50 h) und niedrige Kosten im Vergleich zu Bioassays. Es vermeidet die technische Komplexität wie Beschallung in PMCA verwendet; Darüber hinaus wird es in einem Klebeband versiegelt Mikrotestplatte die Gefahr der Aerosol-Kontamination von jedem Bohrloch minimiert durchgeführt. Die Multi-well-Format ermöglicht die Analyse von bis zu 96 Proben im gleichen Experiment. Um das immer wiederkehrende Problem der Fehlalarme und spontanen Umwandlung von rPrP in der in-vitro- Konvertierung Assays zu begegnen ist die Umsetzung ein Grenzwert (Cut-off) in RT-QuIC sehr nützlich. In der Tat ist basierend auf den Ergebnissen der Negativkontrolle (durchschnittliche RFU von negativen Proben + 5 SD 27), eine Baseline eingerichtet, aus denen Diskriminierung zwischen positiven und negativen Proben erfolgen kann. Die Verwendung von vier Wiederholungen für jede Probe kann somit helfen, definieren eine Probe als positiv, wenn mindestens 50 % der Wiederholungen ein positives Signal zeigen, d.h. cross cut-off- 28. Die Homologie zwischen Samen und Substrat ist in RT-QuIC, nicht erforderlich, wie z. B. in einer früheren Studie, Hamster rPrP gefunden wurde, ein empfindlicher Untergrund im Vergleich zu den homologen Substrat in menschlichen PrPvCJD entkernt und Schafen Scrapie ausgesät Reaktionen 29. Hamster-Schafe chimärer rPrP wurde auch vorgeschlagen, um ein gut geeigneter Substrat als menschliche rPrP, menschliche Variante CJD Prionen 30zu erkennen sein. Somit ist die Verwendung von rPrP Substraten aus verschiedenen Arten sehr häufig in diesem Test. Dieser Test wurde erfolgreich auf mehrere Prion-Krankheiten, wie z. B. sporadischer CJD 31,32,33, Gen angewendetSchulrhythmus Prion Krankheiten 34, BSE- 35,36,37, Scrapie 23,36und CWD 38,39,40,41, 42. Studien mit verarbeitet, Liquor, Blut, Speichel und Urin als Samen in RT-QuIC alle erfolgreich waren, PrPSc 38,39,40,41, zu erkennen 42., die Erkennung Fähigkeit in Proben wie Blutplasma zu fördern, die Inhibitoren des Amyloid Bildung enthalten kann Orrú Et Al. (2011) entwickelt eine Strategie, um potentielle Inhibitoren Amyloid Formation entfernen durch Kämmen PrPSc Immunopräzipitation (IP) Schritt und RT-QuIC, benannt "enhanced QuIC" Assay (eQuIC). Darüber hinaus wurde ein Substrat Ersatz Schritt nach ~ 24 h Reaktionszeit beschäftigt, um die Empfindlichkeit zu verbessern. Schließlich, als niedrig wie 1 ag von PrPSc wurde mit eQuIC 30nachweisbar.
Um Kot Extrakte reinigen und entfernen mögliche Assay-Hemmer im Kot, wurden Kotproben von Elch auf experimentelle orale Infektion in präklinischen und klinischen Stadien gesammelt in Puffer mit Wasch- und Protease-Inhibitoren homogenisiert. Die Kot-Extrakte wurden weitere verschiedene Methoden PrPSc in den Proben unter Verwendung Proteinfällung über Natrium Phosphotungstic Acid (NaPTA) Niederschlag konzentrieren vorgelegt. Die NaPTA Niederschlag Methode, erstmals beschrieben von Safar Et al. 43, wird verwendet, um die PrP-Sc in Proben zu konzentrieren. Die Inkubation von NaPTA mit der Probe führt zu bevorzugten Ausfällung von PrPSc anstatt PrPC. Der molekulare Mechanismus ist jedoch noch unklar. Dieser Schritt hat auch geholfen, Eindämmung und Verhinderung der spontanen Umwandlung von rPrP, die in einigen Fällen beobachtet wird. Zu guter Letzt wurden die Kot-Extrakte von optimierten RT-QuIC mit Maus rPrP (aa 23-231) als Substrat und unter anderem Substrat Ablösung im Protokoll zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit getestet.
Die Ergebnisse zeigen, dass diese verbesserte Methode sehr geringe Konzentrationen von CWD Prionen erkennt und die Empfindlichkeit der Erkennung und Spezifität in Stuhlproben im Vergleich zu einem Protokoll NaPTA Niederschlag und Substrat ersatzlos erhöht. Diese Methode kann möglicherweise kann zu anderen Geweben und Körperflüssigkeiten angewendet werden und von großem Nutzen für die CWD Überwachung im wilden und Gefangenschaft Hirschartigen.
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Protocol
1. RT QuIC mittels fäkal Material
- machen Aufstellungdes Cervid Kot extrahiert fäkale Homogenat durch Zugabe von 1 g fäkal Material bis 10 mL von Kot extrahieren Puffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,1, 130 mM NaCl, 0,05 % Tween 20, 1 mM PMSF und 1 X komplette Protease-Inhibitoren, EDTA-frei), eine Endkonzentration von 10 % (w/V) zu geben. Der Homogenisierung Puffer kann vor der Nutzung vorbereitet und bei-20 ° c
- Homogenize fäkale Pellets (1 g) und Puffer (10 mL) in Tuben (z. B. GentleMACS M Rohre) mit einem Dissociator mit einem vorgegebenen Programm vom Hersteller für Proteine für 1 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei-bis dreimal, bis die Stuhlproben im Puffer vollständig homogenisiert werden.
- Abdichtung der Rohre mit Parafilm und legen Sie sie auf einem schaukelnden Plattform oder Rotary Shaker für eine 1 h Inkubation bei Raumtemperatur.
- Zentrifugieren der Rohre bei 18.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Sammeln die Überstände enthält das Protein extrahiert und aliquoten in 1,5 mL Röhrchen. Aliquote bei-80 ° C für weitere Anwendungen gespeichert werden können.
- Konzentration von PrP Sc im Kot extrahiert
Hinweis: um CWD Prionen in den Kot Extrakt Proben, wodurch die Nachweisempfindlichkeit von RT-QuIC, konzentrieren wird ein Eiweiß Niederschlag Schritt hinzugefügt des Protokolls.- NaPTA Niederschlag Methode
- fügen Sie 250 µL 10 % (w/V) des N-Natriumlaurylsulfat Sarcosinate (Sarkosyl) zu 1 mL der fäkalen Protein zu extrahieren, um eine Endkonzentration von Sarkosyl von 2 % (V/V) geben.
- Dichtung die Schläuche, die enthalten der Proben mit Parafilm und Inkubation bei 37 ° C für 30 min unter konstanten Schütteln bei 1.400 u/min in einem Thermomixer.
- Stellen Sie die Mischung aus fäkalen Proteinextrakt und Sarkosyl mit einer Stammlösung mit 10 % (w/V) Natrium Phosphotungstic Acid und 170 mM Magnesiumchlorid, pH 7,4, eine Endkonzentration von 0,3 % (w/V) Natrium Phosphotungstic Acid in den Proben zu erhalten.
- Der Proben bei 37 ° C für 2 h mit konstanter Schütteln bei 400 u/min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 14 ° C für 30 min bei 15.800 x g. Entfernen Sie vorsichtig die Überstände.
- Waschen die Pellets von resuspending sie in Waschpuffer (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0,5 % Triton X 100, 10 mM EDTA, 0,5 % Natrium Deoxycholate (w/V) und 0,1 % Sarkosyl (w/V)).
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 14 ° C für 15 min bei 15.800 x g. Entfernen Sie vorsichtig die Überstände.
- Aufschwemmen der Pellets in 100 µL (1/10 des ursprünglichen Volumens des fäkalen Proteins Auszug) von RT-QuIC Verdünnungspuffer.
Hinweis: RT QuIC Verdünnungspuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 6,9, 130 mM NaCl, 0,1 % SDS (w/V) und 1 X N2 Ergänzung) ist vor der Nutzung bereit. Einem Gesamtvolumen von 10 mL gefiltert durch einen 0,2 µm Acrodisc Spritze Filter mit einer Spritze und dann bis zur Verwendung bei-20 ° C gelagert. - Speichern die NaPTA behandelt Proben bei-20 ° C bis nutzen sie in RT-QuIC Assay.
- RT-QuIC Assay
- bereiten Sie eine frische 10 mM Th-T-Stammlösung (0,032 g Th-T in 10 mL doppelt destilliertem H 2 O).
- Machen eine Verdünnung von 01:10 der Stammlösung doppelt H 2 O destilliert um einer Endkonzentration von Th-T von 1 mM machen die Filter Filtern mit einer Spritze durch eine 0,2 µm Acrodisc Spritze Th-T.
- Tauen Sie Maus rekombinante PrP (rPrP, aa 23-231) Substrat (10 µg/mL pro RT QuIC Reaktion) aufbewahrt bei-80 ° C auf Eis.
- Last 500 µL rPrP Substrat einzeln in 100 kDa Größe Ausgrenzung Filter Mikroröhrchen und Zentrifuge bei 14.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur (eine Röhre/Filter kann bis zu zwei Mal verwendet werden).
- Übertragen die eluierten Substrat in einem sterilen 1,5 mL-Tube und halten Sie es bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Auftauen RT-QuIC Verdünnungspuffer gespeichert bei-20 ° c
- Machen Verdünnungen des Samens (fäkal Proteinextrakt) in RT-QuIC Verdünnungspuffer:
Unverdünnte Probe: die fäkale Proteinextrakt unverdünnt verwenden
verdünnt, 2 x 10 -1
verdünnt, 2 x 10 -2
verdünnt, 2 x 10 -3 - RT-QuIC Reaktionsgemisch Stammlösungen vorbereiten:
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ( PBS): 5 X
NaCl: 2 M auf Lager Lösung von NaCl vorbereitet in doppelt destilliertem H 2 O.
EDTA: 100 mM Stammlösung von EDTA im Doppelzimmer vorbereitet destilliert H 2 O. - Vor der Verwertung aller Lösungen (Schritt 1.3.8), jede Lösung getrennt durch einen 0,2 µm Acrodisc Spritze Filter mit einer Spritze zu filtern und steril bei Zimmertemperatur aufbewahren.
- Bereiten ein Gesamtvolumen von RT-QuIC Reaktionsgemisch nach der Anzahl der Proben (98 µL Volumen der Reaktion pro Probe und vier Wiederholungen pro Probe) zzgl. 10 % dieses Volumens verwendet werden, um sicherzustellen, dass genügend Mischung für alle Reaktionen haben.
- Verwendung eine 15 mL-Tube, das RT-QuIC Reaktionsgemisch vorzubereiten (20 mM Natriumphosphat, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, 10 µg/mL rPrP Substrat und doppelt destilliertes Wasser, die rPrP endgültige Konzentration in der Reaktion einzustellen) unter Verwendung der Lager Sol Eigei.
- Alle Lösungen mischen auch nach oben und unten mit einer Pipette mit eine Filterspitze pipettieren. Die Verwendung von Wirbel so weit wie möglich vermeiden.
- Gießen Sie die Mischung in ein 50 mL Einweg Pipettieren Reservoir.
- Verwenden, eine Mehrkanal-Pipette 98 µL RT-QuIC Reaktionsgemisch in jede Vertiefung eine 96-Well optische Bodenplatte laden.
- Jeder RT QuIC Reaktion 2 µL unverdünnte oder 10-divisibel seriell verdünnt fäkale Proteinextrakt hinzufügen. Testen Sie jede Probe in vier Wiederholungen.
Hinweis: In jedem Experiment Verdünnungsreihen Stuhlproben (von unverdünnt bis zu 2 x 10 -3) von CWD-Negative und verifizierte CWD-positiven Tieren dienen als negative und positive Kontrollen bzw.. - Die Platte mit einem Dichtband vor der Inkubation in einem Teller-Reader bei 42 ° C für 25 h mit wiederholten Zyklen 1 min Doppel orbital schütteln (700 u/min) und 1 min ruhen während der Inkubation zu versiegeln.
- Fluoreszenz-Messeinstellungen definieren:
Anregung: 450 nm
Emission: 480 nm
unten lesen, Anzahl der Blitze: 20
manuelle Verstärkung: 1000 (je nach Maschine)
Integrationszeit: 20 µs - Entfernen Sie die Platte aus dem Teller Leser am Ende des 25 h.
- Spin-down der Platte bei 3.000 x g für 3 min zur Vermeidung von möglichen Kontaminationen zwischen den Wells.
- Entfernen Sie die Dichtung von der Platte.
- Bereiten eine neue 96-Well-Platte durch das Hinzufügen von 90 µL RT-QuIC Reaktionsmischung enthalten frisches Substrat und frischen Fluoreszenz färben Th-T, wie in Abschnitt 1.3.1, 1.3.6 beschrieben.
- Transfer 10 µL aus jedem Brunnen der ersten Platte auf die neu vorzubereitenden 96 gut Platte.
- Die neue Dichtplatte und RT-QuIC Assays für zusätzliche 50 h die beschriebenen Schritte in Schritt 1.3.13. weiter. Dieser zusätzliche Schritt von 50 h machen die gesamte Reaktionszeit der 75 h.
Hinweis: Die Verfahren der RT-QuIC Assay erfolgen unter Biosafety Schrank. - Die Daten sammeln.
- Lesen und dokumentieren die Th-T Fluoreszenzsignal jeder gut alle 15 min.
- Daten der Gesamtzahl der Zyklen mit Datenanalyse-Software und die Übertragung in eine Tabellenkalkulation mit dem Durchschnitt der vierfach Reaktionen erfassen.
- Zeichnen die Durchschnitte der Daten. Die x-Achse entspricht die Reaktionszeit der RT-QuIC (h) und die y-Achse entspricht die relative Fluoreszenz-Einheiten (RFU). Jede Kurve entspricht einer Verdünnung von einem bekannten Probe.
- In jedem Experiment abzugrenzen eine Schwelle durch die Berechnung der höchsten Mittelwerte der negativen Kontrolle plus 5 Standardabweichungen in aktuellen beschrieben veröffentlicht Literatur 41.
HINWEIS: Alle Replikate, die die definierte Schwelle überschritten gelten als positiv. Wenn mindestens zwei von vier Wiederholungen die Schwelle überschritten, gilt die Probe dann positive.
2. Reinigung von rekombinanten Prion-Protein (rPrP)
- Wachstum von bakteriellen Lager und Ausdruck des rPrP
Hinweis: Escherichia coli (E. Coli) Stamm Rosetta (DE3) transformiert mit Vektor-Haustier-24 Codierung der Maus PrP (Rückstände 23-231) wurde verwendet, um die rPrP vorzubereiten.- Auftauen Glycerin Bestand an Rosetta (DE3) transformiert mit Haustier-24 mPrP(23-231) auf Eis.
- Streifen LB (Luria Bertani) Platten mit einer Endkonzentration von Kanamycin von 50 µg/mL und über Nacht in einem Inkubator 37 ° C inkubieren. Stellen Sie sicher, dass die Platten auf den Kopf gestellt zur Vermeidung von Kondensation der Luftfeuchtigkeit in den festen Medien, die die Bakterien enthalten. Bereiten Sie zwei Platten zu achten, Wachstum in mindestens einer der beiden Platten haben.
- Bereiten Sie 1 L LB und Autoklaven um es steril machen.
- Ergänzung 1 L sterile LB Medien mit 1 mL Kanamycin (50 mg/mL) und 1 mL Chloramphenicol (34 mg/mL).
- Wählen Sie eine Kolonie von jeder Platte mit einem Einweg-Impfschlinge 3 mL LB-Medium mit Kanamycin und Chloramphenicol impfen.
- Ort der Mini-Kulturen im Brutschrank bei 37 ° C mit konstanter Schütteln bei 225 u/min für 5-6 h.
- Fügen Sie die Mini-Kulturen auf den Rest des ursprünglichen 1 l LB Medien zusammen mit Express Autoinduktion System 1 für die Induktion der Proteinexpression.
- Ort der Kultur in 2 L Flasche oder größer, in einem Inkubator bei 37 ° C mit konstanter Schütteln bei 200 u/min für 20-24 h.
- 4 x 250 mL Zentrifuge Röhren 1 L Kultur aufgeteilt.
- Spin-down das Röhrchen mit der Kultur bei 3.750 x g für 20 min bei Raumtemperatur.
- Überstand verwerfen und die bakterielle Pellets in 50 mL Zentrifuge Röhren sammeln, dann frieren sie bei-80 ° C bis zu Weiterverarbeitung. Die daraus resultierende Pellets haben 3 bis 4 g für eine gute Protein-Ausbeute gewogen.
- Vorbereitung der Einbeziehung Körper
- tauen die gefrorenen Pellet (3 bis 4 g) bei 37 ° C für einige Minuten.
- Pellet ein weiteres Mal für 10 min bei-80 ° C Einfrieren und wieder Auftauen. Wiederholen Sie diesen Schritt von Einfrieren und Auftauen zweimal.
- Aufschwemmen der bakterielle Pellet in 1 X Lyse-Reagenz (z. B. BugBuster Master Mix) durch Pipettieren gründlich. Verwenden Sie 5 mL Reagenz für 1 g bakterielle Pellets. Achten Sie darauf, die Mischung vollständig zu homogenisieren.
- Das Homogenat auf einer Wippe für 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Zentrifugieren Homogenat bei 16.000 x g für 20 min bei Raumtemperatur.
- Entsorgen Sie die Überstände durch sorgfältig Gießen off
- Der Pellets in das gleiche Volumen von 1 X Lyse-Reagenz wie im vorherigen Schritt zu homogenisieren.
- Das Homogenat für 15 min auf einer Wippe bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie ein ausreichendes Volumen an 01:10 (0,1 X) Lyse-Reagenz zu einem insgesamt Homogenat Volumen von 40 mL. Mix durch Umkehrung gut Homogenisieren sicherstellen.
- Zentrifugieren Homogenat bei 7.900 x g für 15 min bei 4 ° c
- Verwerfen den Überstand vorsichtig gießen it.
- Das Pellet in 40 mL 0,1 x Lyse-Reagenz Aufschwemmen.
- Zentrifugieren Homogenat bei 16.000 x g für 15 min bei 4 ° c
- Verwerfen den Überstand vorsichtig durch Gießen und das Pellet mit Einschlusskörperchen bei-20 ° C bis Weiterverarbeitung zu speichern.
- Proteinreinigung
- Einschlusskörperchen bei Raumtemperatur auftauen.
- Lösen sich die aufgetauten Inclusion Bodies in 14 mL 8 M Guanidin-HCl (38 g Guanidin-Hydrochlorid in 0,1 M NaPO 4 pH 8.0 und füllen Sie das Fahrwerk mit H 2 O bis 50 mL; pH bei endgültige Lösung nicht verstellen), Proteine zu solubilisieren.
- Achten Sie darauf, auch von oben und unten Pipettieren homogenisieren.
- Inkubation der lysate auf einer Wippe bei Raumtemperatur für 50 min.
- Bereiten 18 g Ni-NTA Harz Perlen (18 g für 3 bis 4 g bakterielle Pellet); mit 100 mL Wasser mit Vakuum und einen 100 mL 0,22 µm Flasche Top Filter spülen.
- Die 18 g Ni-NTA Harzkügelchen in 50 mL-Tube und ausreichend Volumen der Denaturierung Puffer (100 mM Natriumphosphat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M Guanidin-Hydrochlorid, pH 8) um das Endvolumen zu machen bis zu 50 mL.
- Die Perlen in der denaturierenden Puffer für 50 min auf einer Wippe bei Raumtemperatur equilibrate.
- Zentrifugieren der Einbeziehung Körper lysate 16.000 x g für 5 min, unlösliche Ablagerungen zu entfernen.
- Äquilibriert Perlen der Überstand hinzu und die Pellets zu verwerfen.
- Setzen Sie die Mischung auf ein Rocker für 40 min bei Raumtemperatur erlauben Proteinbindung an Ni-NTA Harz.
Hinweis: Nickel Chelat Perlen dienen zur PrP reinigen durch seine Nickel-Affinität. Die Histidin-reiche N-terminalen Region von PrP rendert die Affinität zu Nickel(II)-Oxid, wodurch das Protein binden an nickel-Ionen ohne irgendwelche seiner-Tag. - Waschen FPLC mit Wasser zu reinigen, beide Linien (A und B).
- Ausführen von Geruchsstoffen Puffer (100 mM Natriumphosphat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M Guanidin-Hydrochlorid, pH 8) durch beide Linien (A und B) das System Prime (die Spalte ist noch nicht zugeordnet).
- Laden der Harz auf Spalte. Vergewissern Sie sich, um Luftblasen zu minimieren.
- Legen die Spalte auf der FPLC und einen linearen Farbverlauf aus 100 % Denaturierung Puffer A und 0 % der Umfaltung Puffer B (100 mM Natriumphosphat, 10 mM Tris, pH 8,0) zunächst auf 0 % Puffer Denaturierung und 100 % Umfaltung Puffer bis zum Ende laufen. Dieser allmähliche Verlagerung ist bei einer Durchflussrate von 0,75 mL/min 240 min laufen und ist notwendig für die korrekte Faltung von PrP.
Hinweis: Während der chromatographischen Reinigungsprozess ist denaturierte PrP zuerst langsam auf das Harz refolded durch die Anwendung eines linearen Farbverlaufs Umfaltung Puffer, den denaturierenden Puffer zu ersetzen. Dieser Schritt entfernt auch die chaotropen Guanidin-HCl. - Stellen Sie sicher, dass 100 % Umfaltung Puffer weiterhin fließen durch die Spalte für eine zusätzliche 30 min bei 0,75 mL/min.
- Spülen Linie A mit anschließender Elution Buffer (100 mM Natriumphosphat, 10 mM Tris, 500 mM Imidazol, pH-Wert 5,8) Wasser unter Umgehung der Spalte. Dies wird sauber aus der denaturierenden Puffer, der jetzt von der Elution Buffer im AKTA System ersetzt wurde.
- Elute Protein mit 2 mL/min mit einem linearen Farbverlauf für 40 min vom 100 % Umfaltung Puffer B und 0 % Elution Buffer A zunächst auf 0 % Umfaltung Puffer und 100 % Elution Buffer.
Hinweis: Die hohe Konzentration von Imidazol in Elution Puffer konkurrieren PrP ' s-Bindung an die Nickel(II)-oxid. Die primäre Protein Peak sollte anfangen zu ca. 1/3 des Weges durch den Farbverlauf eluieren.- Watch Chromatogramm für OD 280 nm erhöhen.
- Sammeln nur die Rohre, enthält das Protein in der Mitte des großen Berges.
Hinweis: Der eluierten Bruchteile von 2 mL werden in 15 mL Röhrchen gesammelt. - In den Rohren sofort mit ca. 1/3 Volumen (1 mL) enthaltene Protein von Dialyse-Puffer (10 mM Natriumphosphat, pH 5.8) verdünnen.
- Legen Sie sofort die Rohre auf Eis.
- Pool eluierten Proteins in den Rohren enthalten.
- Armen das Protein in Dialyse-Kassetten (Molekulargewicht Cut-off 10 kDa).
- Setzen die Kassetten in vorgekühlt Dialyse-Puffer (3,6 L) für 2 h bei 4 ° C, dann übertragen die Kassetten in einen frischen Dialyse-Puffer (3,6 L) für eine Nacht. Machen Sie sicher, dass die Dialyse-Puffer in ständiger Bewegung befindet.
- Protein nach der Dialyse durch einen 0,2 µm Acrodisc Spritze Filter mit einer Spritze zu filtern.
- Messen die Konzentration des Proteins mit einem BCA Protein Assay Kit.
- Konzentrat oder verdünnen, wenn nötig, passen die Proteinkonzentration bis 0,3 mg/mL.
Hinweis: Bestätigen Sie Reinheit durch SDS-PAGE und Coomassie blaue Färbung. - 1 mL Aliquote des Proteins in Mikrozentrifugenröhrchen und sofort bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung zu speichern, wie in der RT-QuIC Protokoll beschrieben.
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Representative Results
Die CWD fäkale Extrakte vorbereitet bei 10 % (w/V) konnten RT QuIC Reaktion Samen, doch die Nachweisempfindlichkeit war niedrige 27. Mit einem speziellen Puffer für fäkale Homogenisierung war ein entscheidender Schritt, hohe Hintergrundfluoreszenz in RT QuIC begleitende Reaktionen auf die Verwendung der Maus rPrP Substrat zu vermeiden, anstatt Hirsch rPrP ermöglichte man genauere Ergebnisse 27. Die Zugabe von NaPTA Niederschlag verringert die spontanen Umwandlung von rPrP in RT-QuIC (Abbildung 1) ohne Hemmung der Verstärkung der Sämaschinen Aktivität der Reaktionen (Abbildung 2). Obwohl bessere Verstärkung NaPTA Behandlung beobachtet wurde, waren resultierenden Fluoreszenz Signale CWD-positiven Stuhlproben noch gering (Abbildung 1). Darüber hinaus erreicht die Prion-Verstärkung von einigen Proben ein konstanter Plateau auf geringe Fluoreszenz Ebenen. Dies zeigt die Sättigung der Reaktionen, die sein können, aufgrund der Verschlechterung/Denaturierung der rPrP oder die Bildung von off-Signalweg Aggregate die rPrP Pool 30verbrauchen. Zur weiteren Verbesserung der Verstärkung von Prionen und verbessern die Nachweisempfindlichkeit, wurde ein Substrat Ersatz Schritt in das Protokoll aufgenommen. Die Einführung der Substrat-Ersatz für das RT-QuIC Protokoll (Abbildung 2) erhöht die Empfindlichkeit (77 %; RT QuIC 14 von 18 Proben waren positiv) und Spezifität (100 %, keiner von den Negativkontrollen RT QuIC wandte sich positiv) Nachweisgrenze (siehe Tabelle 1 von Cheng Et al. ( 27). schließlich all diese Schritte (Abbildung 3) führte zur Optimierung eines zuverlässigen und sensiblen Protokolls für RT-QuIC Erkennung von CWD Prionen, mit Probe mit geringen Mengen an Infektiosität.
Substrat-Ersatz führte ihn nach den ersten 25 h RT QuIC Reaktion, durch Auffüllen Reaktion Puffer mit frischem Substrat und frischen Fluoreszenz färben Th-T. Durch die Einführung des Substrat-Ersatz-Schritt in das Protokoll, wurde die RT-QuIC Reaktionszeit von 50 h, 75 h verlängert. Wie mit dem Einbau von Substrat Ersatz in Abbildung 2 dargestellt, wurde eine deutliche Verbesserung der Prion Verstärkung beobachtet.
Abbildung 1: reduzierte spontane Umwandlung der Maus rPrP Substrat in RT-QuIC ausgesät mit gereinigtem CWD-Negative fäkale Homogenat. Fäkale Homogenates von nicht infizierten Elch (C181-006) oder Maultier-Rotwild wurden im Kot Extrakt Puffer, eine Endkonzentration von 10 % (w/V) zu erhalten homogenisiert. Zur Reinigung waren diese fäkale Homogenates verarbeitet und 10 - Mal durch NaPTA Niederschlag konzentriert. Die ungereinigten fäkale Homogenates (ein), NaPTA gereinigt und konzentrierte Formen (b) verdünnt wie angegeben wurden verwendet, um Saatgut vierfacher RT QuIC Reaktionen mit Maus rPrP als Substrat. Die y-Achsen zeigen relative Th-T-Fluoreszenz-Einheiten, die x-Achsen die Reaktionszeit darstellen. Eine Reduzierung der spontanen Umbauten wurde in Stuhlproben mit NaPTA gereinigt (b) gesehen. Von Cheng Et Al. verwendeten Daten 27. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Verbesserte Erkennung von CWD Prionen im Kot mit Substrat Ersatz. Fäkale Homogenates von einzelnen Elk (C051-05, C052-05) mündlich mit CWD Prionen infiziert wurden gereinigt und durch NaPTA Niederschlag konzentriert. NaPTA-behandelten Proben waren zwischen 2 x 10-1 bis 2 x 10-3 verwendet, um Samen vierfacher RT QuIC Reaktionen mit Maus rPrP Substrat verdünnt. Die RT-QuIC-Assay wurde ersatzlos Substrat (ein) in regelmäßigen Abständen von 50 h oder mit dem Einbau von Substrat Ersatz für eine längere Inkubationszeit von 75 h (b) durchgeführt. Für Letzteres Substrat Ersatz führte ihn nach den ersten 25 h RT QuIC Reaktion. Neunzig Prozent der das Reaktionsvolumen wurde entfernt und ersetzt durch frisch zubereitete RT QuIC Reaktionsgemisch mit rPrP Substrat und Th-T. Durch die Einführung des Substrat-Ersatz-Schritt in das Protokoll, war die RT-QuIC Reaktionszeit von 50 h auf 75 h. von Cheng Et Al. verwendeten Daten erweitert. 27. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Flussdiagramm beschreiben PrPSc fäkale Extraktion von CWD-infizierten Hirschartigen und seeding Aktivität und Prion Amplifikation mit RT-QuIC assay. Kotproben von CWD-infizierten Tieren sind im fäkalen Extraktionspuffer homogenisiert, NaPTA Niederschlag Methode vorgelegt und von RT-QuIC Assay getestet. Letzteres wurde durch die Einführung eines Substrates Ersatz Schritt durchgeführt. Die Einbeziehung der NaPTA und Substrat Ersatz Schritte führte zu einer Verringerung der spontanen Umwandlung und deutliche Verbesserung Aussaat Aktivität und Prion Verstärkung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
RT-QuIC war zuvor beschäftigt, CWD Prionen in Urin und fäkale Extrakte von mündlich infizierten weiß - angebundene Rotwild und Maultierhirsche 38zu erkennen. Das System in diesem Manuskript gezeigt ist eine angepasste Methode des RT-QuIC Assays. Weitere Schritte wurden in der "klassischen" RT-QuIC Assay zur Verbesserung der Erkennung und Empfindlichkeit des Assays für CWD Prionen in Fäkalien infizierter Tiere aufgenommen.
Die niedrige Nachweisempfindlichkeit im Kot Extrakte führte uns zur Verbesserung des RT-QuIC-Protokolls. Um empfindliche in-vitro- Nachweis von Prionen im Kot zu erreichen, wurden wichtige Schritte für die Probenvorbereitung hinzugefügt, um Komponenten zu entfernen, die stören Prion Wandel- und/oder Vermehrung und Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit. Einbindung Substrat Ersatz im Protokoll von RT-QuIC und NaPTA/Sarkosyl Behandlung war entscheidend für die Erkennung von Sämaschinen Aktivität in präklinischen und klinischen CWD-infizierten Lyck und zur Verbesserung der Nachweisgrenzen der Prion Umwandlung im Kot Extrakte .
NaPTA Niederschlag ist ein gängiges Verfahren in der Regel begleitet von Sarkosyl Extraktion zu isolieren und PrP-Sc zu einem nachweisbaren Niveau zu konzentrieren. NaPTA bekannt, vorzugsweise auszufällen PrPSc über PrPC 43 , während Sarkosyl ein Waschmittel bekannt ist, Prion Umwandlung in geringen Konzentrationen in einer Zelle freies System 44zu erleichtern. In Übereinstimmung mit diesem kann mit einer Kombination aus NaPTA und Sarkosyl eine höhere Ausbeute an fibrillären Aggregate in Vitro generieren, wie vor 45,46,47gezeigt. Diese Methodik wurde zuvor in RT QuIC-Assay, periphere CWD Prionen erfolgreich in Probe wie gereinigten Speichel 39 und Vollblut 40erkennen integriert. Unsere Studie liefert erste Hinweise darauf, dass unter Einbeziehung NaPTA/Sarkosyl Reinigung im Protokoll der fäkalen Probenvorbereitung CWD Prion Erkennung durch RT-QuIC ermöglicht. Darüber hinaus konnten wir mit dieser Methodik spontanen Umwandlung von rPrP Substrat in CWD-Negative fäkale Homogenates in RT-QuIC Assay zu reduzieren.
Ein möglicher Mechanismus ist vorgeschlagen worden, um die Wirkung von Substrat Ersatz 30zu erklären. In den ersten Runden der Reaktion (vor der Zugabe von frischem Substrat) wird nur eine kleine Menge von Samen RT QuIC Reaktionen hinzugefügt. Während die gesetzten Reaktionen nur ein Teil des rPrP integriert ist, der Rest des Substrates könnte entweder durch die Interaktion mit den Wänden der Reaktion Platte Brunnen, Form-Amyloid Aggregate aufgebraucht werden oder geändert werden, um eine Form, die weniger anfällig für durch Stuhl umgewandelt werden DED RT QuIC Produkte anstatt der ursprünglichen Samen. Infolgedessen die Aufnahme bei rPrP in die Samen ist langsam, und die Fibrille Bildung ist nicht in der Lag-Phase nachweisbar. Die bestreute RT QuIC Produkte gewachsen in der Lag-Phase schließlich länglich sind, um eine "schnelle Montage der Bühne" zu erreichen, läßt sich Prionen verstärkte schnell durch Segmentierung durch Schütteln oder seitlichen Zusatz von kleineren Aggregaten. In diesem Stadium ist das frische Substrat hinzugefügt, um die Reaktion ohne weiteres die bestreute Produkte anstatt bilden unspezifischen Aggregate integriert. Die Eingliederung der Substrat-Ersatz-Schritt in unserem Protokoll war eine Modifikation, die Empfindlichkeit erhöht; Es war nützlich, Prion Samen in Proben mit eine sehr geringe Menge von PrPSc von Tiere im vorklinischen Stadium und/oder enthaltenden hemmende Verbindungen zu erkennen.
Mithilfe von RT-QuIC Assay statt PMCA, das ist das erste in-vitro- Protein misfolding Verstärkung Assay 21beschrieben, hat mehrere Vorteile. Im PMCA sind die Rohre inkubiert und beschallt in einem Wasserbad in der Sonikator enthalten; positioniert an der Peripherie der Sonikator Röhren zeigen weniger Wirksamkeit der Verstärkung im Vergleich zu den Röhren positioniert in der Mitte 48. Das RT-QuIC System Beben scheint leichter zu kontrollieren. Die Verwendung von einer 96-well-Format ist ein echter Vorteil des RT-QuIC, jedoch die mb-PMCA von Moudjo Et Al. entwickelt 49 , 50, zeigten ähnliche Vorteile, aber noch weniger in PMCA verwendet.
Als Substrat verwendet RT-QuIC rekombinante rPrP für die Konvertierung; im Gegensatz dazu verwendet die PMCA in den meisten Fällen normale Gehirn Homogenat. Darüber hinaus ist in RT-QuIC keine Sequenzhomologie zwischen Samen und Substrat 51–53erforderlich.
Das Vorhandensein von Cofaktoren ist notwendig für die Prion-Replikation in PMCA und das resultierende Produkt ist ansteckend. Jedoch in RT-QuIC-Assay ist der verstärkte PrP nicht ansteckend. In in-vitro- Verstärkung-Assays ist das Auftreten von falsch positive Reaktionen wahrscheinlich wegen der spontanen Umwandlung von PrPC ein immer wiederkehrendes Problem. Daher waren Assay und Bedingungen, die in dieser Studie verwendeten zugeschnitten um solche Störungen um den Unterschied zwischen gesetzten rPrP-Konvertierung und spontane Umwandlung zu maximieren zu minimieren.
Zusammenfassend, NaPTA/Sarkosyl Behandlung ermöglicht die Entfernung der Assay-Hemmer im Kot und spontane Umwandlung reduziert. Interessanterweise die Behandlung Sämaschinen Aktivität des PrecipitatedPrPScnicht behindern. Darüber hinaus wurde die Nachweisempfindlichkeit deutlich verbessert, als Substrat Ersatz damit auch angenommen wurde.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) für die Ausbildung und das Cervid PrP bakterielle Expressionsplasmid. SG wird vom Canada Research Chair Programm unterstützt. Wir anerkennen die Fördermittel für diese Forschung zu SG Genome Kanada, Alberta Prion Research Institute und Alberta Land- und Forstwirtschaft durch Genom Alberta und der University of Calgary zur Unterstützung dieser Arbeit. Wir erkennen ein Forschungsstipendium von der Margaret Gunn Foundation for Animal Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Acrodisc seringe filters | PALL | 4652 | |
| amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit | Millipore | UCF901024 | |
| BD 10 ml seringe | VWR | CA75846-842 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Corning bottle-top vacuum filters | Sigma-Aldrich | 431118 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| gentleMACS M Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | ThermoFisher Scientific | 12780029 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| N2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 15502048 | |
| N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | ML9150 | |
| Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K | PALL | OD100C34 | |
| Nunc sealing tapes | ThermoFisher Scientific | 232702 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-000 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Calbiochem | 7910-OP | |
| sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) | Sigma-Aldrich | 496626 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516 | |
| Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Triton-100 | Calbiochem | 9410-OP | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial buffers and solutions | |||
| BugBuster Master Mix | Nogagen | 71456-4 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 1018401 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) | Life Technoligies | P5493 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standards and commercial kits | |||
| Express Autoinduction System 1 | Novagen | 71300-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment setup | |||
| AKTA protein purification systems FPLC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Beckman Avanti J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-25.50 | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-10 | Beckman Coulter | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sofware | |||
| MARS Data Analysis | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism6 | GraphPad software |
References
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