JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil CWD Prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/56373
, , , , ,
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine,University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology,University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency,Lethbridge Laboratories

Summary

Burada, bir basit, hızlı ve verimli prion amplifikasyon tekniği, gerçek zamanlı dönüştürme (RT zlı) gökyüzünden kaynaklı yöntemi açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Esas numaralı seribaşı misfolding ve rekombinant prion protein (PrP) substrat prion tohum dönüştürme için bir şablon olarak kullanarak toplama göre hassas vitro boş hücre deli dana amplifikasyon tahlil RT zlı tekniğidir. RT zlı gerçek zamanlı Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) benzer bir roman yüksek üretilen iş tekniği kullanıyor. Amiloid Fibriller büyüme tespiti üzerine ᵦ sayfalık zengin proteinler ile spesifik etkileşime fluoresces Thioflavin T boya temel alır. Böylece, Amiloid Dil oluşumu gerçek zamanlı olarak tespit edilebilir. Kronik israf hastalığı (CWD) Prionlar dışkı hulâsa içinde algılamak için bir güvenilir non-invaziv tarama testi geliştirmek çalıştı. Burada, özellikle CWD dışkısı etkinliğinde tohum PrPSc cervids enfekte ortaya çıkarmak için RT zlı tekniği adapte olması. Başlangıçta, hazırladığımız dışkı özleri tohumlama etkinliği RT içinde zlı, nispeten düşük potansiyel tahlil inhibitörleri fekal malzeme nedeniyle oldu. Dışkı özleri tohumlama etkinliğini artırmak ve olası tahlil inhibitörleri kaldırmak için deterjanlar ve proteaz inhibitörleri içeren bir arabellek dışkı örneklerinde homojenize. Biz de örnekleri PrPSc sodyum phosphotungstic asit ve merkezkaç kuvveti kullanan protein yağış temelinde konsantre için farklı yöntemler için gönderilmektedir. Son olarak, dışkı özler tarafından en iyi duruma getirilmiş RT-yüzey yedek algılama hassasiyeti artırmak için iletişim kuralında dahil zlı test edildi. Böylece, bir protokol CWD deli dana önceden klinik ve klinik cervids tarafından RT-non-invaziv CWD tanı için kullanışlı bir araç olabilir zlı, dışkısı etkinliğinde tohum hassas algılanması için kurduk.

Introduction

Prion hastalıkları veya bulaşıcı spongiform Encephalopathy (TSE) insanlarda, bovine spongiform encephalopathy (BSE) içinde sığır, koyun ve keçi ve kronik boşa büyük nörodejeneratif hastalıklar Creutzfeldt – Jakob hastalığı (CJD) dahil olmak üzere çoğu hastalığı (CWD) cervids 1,2. TSE’ler ayırt edici spongiform görünüm ve beyindeki nöronların kaybı ile karakterizedir. “Sadece protein” hipotezi göre Prionlar esas olarak PrPSc (büyük için ‘ Sc’) 3/, ev sahibi olarak kodlanmış hücresel prion protein, PrPCmisfolded izoformu oluşmaktadır. PrPSc PrPC dönüştürme bağlamak ve diğer PrPC molekülleri dönüştürmek için bir çekirdek hareket edebilir ᵦ-yaprak 4,5,6 zenginleştirilmiş bir uyum içine kaynaklanır. Yeni oluşturulan PrPSc moleküllerin daha küçük reaksiyonlar, bulaşıcı çekirdekleri daha yüksek sayıda sonuçlanan bölen bir büyüyen polimer 7,8 içine dahil edilmiştir. PrPSc toplamak için eğilimli ve proteaz 9,10‘ a kısmen dayanıklıdır.

CWD etkiler vahşi ve çiftlik geyik (Cervus canadensis), katır geyiği (Odocoileus hemionus), Ak kuyruklu geyik (WTD; Odocoileus virginianus), geyik (Alces alces) ve Ren geyiği (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Bu yatay şanzıman cervid etkileşimleri ve çevre sebat infektivite 14,15ile en bulaşıcı deli dana hastalığı kabul edilir. Nerede PrPSc birikimi ve infektivite beyne sınırlı olan diğer prion hastalıkları CWD içinde bunlar da periferik doku ve vücut sıvıları örneğin tükürük, idrar ve dışkı 16,17, bulunur 18.

İmmünhistokimya PrPSc dağıtım ve süngerimsi lezyonlar 19,20algılamak CWD tanısı için altın standart olarak kabul edilir. ELISA ve daha nadir olarak, Batı leke de CWD teşhis için kullanılır. Böylece, geçerli deli dana hastalığı tanı çoğunlukla Prionlar içinde post-mortem doku tespit üzerinde temel alır. Ante-mortem tanı için CWD bademcikler veya recto anal mukoza ilişkili lenfoid doku (RAMALT) biyopsi alarak mevcuttur; Bununla birlikte, bu yordamı invaziv ve hayvanların yakalanması gerekir. Böylece, idrar ve dışkı, gibi kolayca erişilebilir örneklerin kullanımı CWD prion algılama için pratik bir yol olacaktır. Ancak, bu salgılarının liman nispeten Prionlar geçerli tanı yöntemleri algılama sınırın altındaki konsantrasyonları düşük. Sonuç olarak, daha hassas ve yüksek üretilen iş tanı aracı gereklidir. Döngüsel amplifikasyon misfolding protein gibi vitro Dönüşüm Sistemleri (PMCA) 21, tahlil ve gerçek zamanlı dönüşüm (RT zlı) gökyüzünden kaynaklı tahlil 22,23, tohum amiloid tahlil 24 deli dana dönüştürme işleminin vitro taklit etmek için PrPSc kendi kendine yayılıyor yeteneği yararlanmak ve böylece dakika PrP algılanamaz düzeyleri 25Sc miktarda varlığı yükseltmek için çok güçlü araçlar vardır ,26. RT zlı yöntemi, ancak, β-yapraklık ikincil yapısında zenginleştirilmiş dönüşüm ürün özellikle thioflavin T (Th-T) bağlayabilirsiniz aslında yararlanır. Bu nedenle, rekombinant PrP (rPrP) numaralı seribaşı dönüşüm üzerine Th-T bağlamak ve böylece gerçek zamanlı olarak Th-T (RFU) göreli Floresans birimler zaman içinde ifade Floresans ölçerek tespit edilebilir amiloid liflerinde içine büyür. Bir kez izlenen, RFU göreli tohumlama faaliyetleri ve gecikme faz gibi nicel parametreleri değerlendirmek için kullanılabilir. Gecikme faz sırasında hangi rPrP erken aşamada tepki Th-T Floresans algılama sınırın altına dönüştürmedir eşik ulaşmak için gereken süreyi (h) temsil eder. Eşlik eden yeterli amiloid çekirdeği (çekirdekleşme/uzama) oluşumuna belirgin gecikme faz sonu Th-T Floresans eşik düzeyini aşıyor ve olumlu olur oluşur. Amiloid liflerinde gerçek zamanlı ve ilk PrPSc veya aşağıdaki örnekte yer alan tohumlama aktivite tespit edilebilir büyüme daha fazla tohum üreten bölümleme tarafından güçlendirilmiş. Bu tohumlar sırayla hızlı üssel faz amiloid fiber büyüme teşvik.

Çünkü bu tahlil 1 düşük tespit edebilmektedir fg PrPSc 24yüksek hassasiyet nitelendirir ante öldükten sonra ya da non-invaziv tanı çeşitli periferik dokulara, salgılarının veya diğer PrPSc tespit ederek elde etmek için bu tekniği numune infektivite seviyesinin düşük yataklık tür. RT zlı kesinlikle avantajları diğer deneyleri tekrarlanabilirlik, pratiklik, hız (az 50 h) ve BİYOANALİZLER için karşılaştırıldığında düşük maliyetleri sağlar. O PMCA içinde kullanılan sonication gibi teknik karmaşıklığı önler; Ayrıca, hangi her şey aerosol bulaşma riskini en aza indirgemek bir bant mühürlü Mikroplaka içinde gerçekleştirilir. Çok iyi biçimi aynı deneyi 96 örnekleri çözümleme sağlar. Tekrarlayan sorunun yanlış pozitif ve rPrP vitro dönüşüm deneyleri içinde spontan dönüşüm karşı bir eşik (cut-off) RT zlı uygulanması çok yararlıdır. Nitekim, negatif kontrol (ortalama RFU negatif örnekler + 5 SD 27) sonuçlarına göre bir temel hangi-ebilmek kılınmak ayrımcılık pozitif ve negatif örnekleri arasında ayarlanır. Dört çoğaltır kullanım örnekleri için böylece çoğaltır en az % 50 olumlu bir sinyal gösterdiğinizde bir örnek pozitif tanımlamak için yardımcı olabilir, Yani çapraz kesme 28. Örneğin bir önceki çalışmada, hamster rPrP insan PrPvCJD homolog substrat kıyasla daha duyarlı bir substrat olmak tohumlari ve koyun büyük tepkiler numaralı seribaşı tespit edildi gibi homoloji arasında tohum ve substrat RT içinde zlı, gerekli değildir 29. hamster-koyun chimeric rPrP da insan varyant CJD Prionlar 30algılamak için insan rPrP daha daha iyi uygun bir substrat olmasını önerdi. Böylece, farklı türlerden rPrP yüzeylerde kullanımı bu tahlil çok yaygındır. Bu tahlil sporadik CJD 31,32,33, gen gibi birkaç prion hastalıkları için başarıyla uygulandıETIC prion hastalıkları 34, BSE 35,36,37, büyük 23,36ve CWD 38,39,40,41, 42. RT zlı içinde tohum PrPSc 38,39,40,41, tespit etmek için tüm başarılı olduğu gibi çalışmalar kullanarak beyin omurilik sıvısı, tam kan, tükürük ve idrar işlenen 42. örneklerinde inhibitörleri Amiloid Dil oluşumu içerebilir kan plazması gibi algılama yeteneği teşvik etmek için Orrú ve ark. (2011) Amiloid Dil oluşumu potansiyel inhibitörleri PrPSc immunoprecipitation (IP) adım ve RT-QuIC tarama ile kaldırmak için bir strateji geliştirdi, tahlil (eQuIC) “QuIC gelişmiş” adında. Buna ek olarak, bir yüzey yedek adım duyarlılığını artırmak için reaksiyon süresi ~ 24 h sonra istihdam edildi. Sonuçta, olarak düşük 1 ag PrPSc eQuIC 30tarafından algılanabilir.

Dışkı özleri arındırmak ve olası tahlil inhibitörleri dışkı çıkarmak için dışkı örnekleri preklinik ve klinik aşamalarında elk deneysel oral enfeksiyon üzerine toplanan deterjanlar ve proteaz inhibitörleri içeren arabellekte homojenize. Dışkı özleri daha fazla protein yağış ile sodyum phosphotungstic asit (NaPTA) yağış kullanan örnekler PrPSc konsantre için farklı yöntemler için sunuldu. Önce Safar vd tarafından açıklanan NaPTA yağış yöntemi 43, PrPSc test örneklerinde konsantre için kullanılır. NaPTA kuluçka PrPCyerine PrPSc tercihli yağış örnek sonuçlarını içeren. Ancak, moleküler mekanizma hala belli değildir. Bu adımı da içeren ve bazı durumlarda görülmektedir rPrP spontan dönüşüm önleme yardım etti. Son olarak, dışkı özleri en iyi duruma getirilmiş RT-fare rPrP (aa 23-231) bir substrat kullanarak ve yüzey yedek iletişim kuralında dahil algılama hassasiyeti artırmak için zlı tarafından test edildi.

Sonuçlar burada geliştirilmiş bu yöntem çok düşük konsantrasyonlarda CWD Prionlar algılayabilir ve algılama ve özgüllük dışkı örneklerinde NaPTA yağmur damlaları ve yüzey yedek olmadan bir iletişim kuralına göre hassasiyeti artar gösterilmektedir. Bu yöntem potansiyel olarak diğer doku ve vücut sıvıları uygulanabilir ve vahşi ve esir cervids CWD gözetimi için büyük kullanım olabilir.

Protocol

1. kullanarak RT zlı fekal madde yapmak cervid dışkı hazırlanması ayıklar fekal homogenate 10 mL olarak dışkı fekal madde 1 g ekleyerek ayıklamak arabellek (20 mM sodyum fosfat, pH 7.1, 130 mM NaCl, % 0.05 ara 20, 1 mM PMSF ve 1 x tamamlamak proteaz inhibitörleri, EDTA içermeyen) bir son konsantrasyonu % 10 (w/v) vermek. Homojenizasyon tampon kullanımı öncesinde hazırlanan ve depolanan -20 ° c Homogenize dışkı granül (1 g) ve proteinler için oda sıcak…

Representative Results

(w/v) hazırlanan CWD dışkı özleri RT zlı tepki tohum başardık, henüz algılama hassasiyeti düşük 27oldu. Dışkı homojenizasyon için belirli bir arabellek kullanarak yüksek arka plan Floresans reaksiyonlarda RT zlı eşlik eden kullanmak için fare rPrP substrat, önlemek için önemli bir adımdı yerine daha özel almak için izin geyik rPrP 27sonuç. NaPTA yağış ilavesi rPrP RT-zlı (şekil 1</st…

Discussion

RT zlı daha önce idrar ve dışkı özleri sözlü olarak enfekte Ak kuyruklu geyik ve katır geyiği 38CWD Prionlar algılamak için istihdam edildi. Bu el yazması gösterilen sistem RT zlı tahlil adapte bir yöntemdir. Ek adımlar algılama ve tahlil CWD Prionlar enfekte hayvanların dışkı malzeme için duyarlılığını artırmak için “klasik” RT zlı tahlil içine dahil edilmiştir.

Algılama dışkı özleri ile düşük duyarlılık bizi RT zlı protokol …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Eğitim ve cervid PrP bakteriyel ifade plazmid sağlamak için Dr Byron Caughey (NIH kayalık dağ laboratuvarları) için minnettarız. SG Kanada araştırma sandalye program tarafından desteklenir. Genom Kanada, Alberta Prion Araştırma Enstitüsü ve Alberta tarım ve Ormancılık genom Alberta ve University of Calgary Bu eser destek için SG bu araştırma için fon kabul. Bir araştırma hibe hayvan araştırma için Margaret Gunn temelden anıyoruz.

Materials

Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
  2. Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
  3. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
  5. Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
  6. Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
  7. Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
  8. Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
  9. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
  10. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  11. Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
  12. Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
  13. Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
  14. Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
  15. Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
  16. Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
  17. Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
  18. Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
  19. Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
  20. Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
  21. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
  22. Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
  23. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
  26. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  27. Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
  28. Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
  29. Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  30. Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
  31. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
  32. Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
  33. Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
  34. Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
  35. Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
  36. Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
  37. Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
  38. John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
  39. Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
  40. Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
  41. Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
  42. Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
  43. Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
  44. Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  45. Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
  46. Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
  47. Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
  48. Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
  49. Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
  50. Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
  51. Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  52. McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
  53. Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).

Tags

CWD PrionsFecal MaterialReal-time Quaking-induced Conversion AssayCervidChronic Wasting DiseaseSensitive DetectionHigh ThroughputSodium Phosphotungstic Acid PrecipitationRT-QuIC AssayThioflavin T

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image