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Immunology and Infection

リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/56373
, , , , ,
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine,University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology,University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency,Lethbridge Laboratories

Summary

ここでは、単純な高速かつ効率的なプリオンの増幅技術、リアルタイムで揺れる誘起変換 (RT QuIC) メソッドを記述するプロトコルを提案する.

Abstract

RT QuIC 法は、機密性の高い体外無細胞プリオン増幅試金シードの折りたたみと変換のためテンプレートとしてプリオン種子を用いた組換えプリオン蛋白質 (PrP) 基板の集計は主に基づいています。RT QuIC はリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) に類似しているスループットの高い手法です。アミロイド線維の成長の検出は、Thioflavin T は、ᵦ シート豊富なタンパク質との特異的相互作用時に蛍光を発する色素に基づいています。したがって、アミロイド線維形成をリアルタイムで検出することができます。糞便抽出物の慢性消耗病 (CWD) プリオンを検出するための信頼性の高い非侵襲的なスクリーニング テストの開発を試みた。ここでは、我々 は具体的には PrPSc CWD の糞便内活動を播種感染シカ科を明らかにする RT QuIC 法を適応しています。当初、我々 は準備糞便抽出物の播種活動だった糞便材料の潜在的なアッセイの阻害によって RT-QuIC で比較的低かった。糞便抽出物の播種活動を改善し、潜在的なアッセイの阻害剤を削除は、洗剤とプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーに糞便を均質化。また、ナトリウム リンタングステン酸と遠心力を使用して蛋白質の沈殿物に基づいて PrPScを集中する方法をサンプルを提出しました。最後に、糞便抽出物は、最適化された RT-QuIC 基板交換を検出の感度を改善するためにプロトコルに含まれてによって調べた。したがって、我々 は RT QuIC、CWD の非侵襲的診断のための実用的なツールをすることができますでの前臨床・臨床のシカ科の糞便内活動を播種 CWD プリオンの高感度検出のためのプロトコルを確立しました。

Introduction

プリオン病または伝染性海綿状脳症 (TSE) は、牛海綿状脳症 (BSE) 牛、スクレイピー羊とヤギ、無駄に慢性的な人間のクロイツ フェルト ・ ヤコブ病 (CJD) を含む神経変性疾患シカ科1,2病 (CWD)。Tse は、特徴的な海綿状外観と脳のニューロンの損失によって特徴付けられます。「タンパク質のみ」の仮説によれば、プリオンは主に PrPSc (スクレイピーの ‘ Sc’) 3、PrPCホストでエンコードされたプリオン蛋白変性アイソ フォーム成る。PrPScは PrPCのバインドし、他の PrPC分子に変換するシードとして機能できる ᵦ シート4,5,6の濃縮形態への変換に起因します。新しく生成された PrPSc分子は小さいオリゴマー、感染核の高い数値で結果に分解成長ポリマー 7、8に組み込まれます。PrPSc集計しやすいプロテアーゼ9,10に部分的に耐性があります。

CWD に影響を与える野生と養殖のエルク (Cervus canadensis)、ミュールジカ (ジューテリウム ドルノゴビ)、オジロジカ (WTD;ジューテリウムで子鹿) (Alces alces) ムースやトナカイ (となかい座 tarandus tarandus) 11,12,13。それはシカの相互作用と感染14,15の環境の永続性によって支持される水平伝播と最も伝染のプリオン病と見なされます。その他プリオン PrPSc蓄積と感染が脳に限られているとは異なり CWD にこれらにも、末梢組織や体液など唾液、尿、糞便16,17,18。

免疫組織化学は、CWD PrPSc分布と海綿状病変19,20を検出する診断のゴールド スタンダードと見なされます。ELISA よりまれに、西部のしみ CWD 診断に使われまた。したがって、現在のプリオン病の診断は主に事後組織でプリオンを検出に基づいています。CWD の殺診断は、扁桃腺や直腸肛門粘膜関連リンパ組織 (RAMALT) バイオプシー;ただし、このプロシージャは侵襲性があり、動物の捕獲が必要です。したがって、尿や糞便などの簡単にアクセスできる検体の使用は、CWD プリオン検出のための実用的な方法でしょう。しかし、これら糞尿港プリオン現在診断法の検出限界値以下の濃度が比較的低い。その結果より高感度・高スループットの診断ツールが必要です。変換システムの in vitroタンパク質フォールディング繰返し増幅など分析 (PMCA) 21、アミロイド播種法とリアルタイムで揺れる誘起変換 (RT QuIC) 試金22,23,24はプリオン変換プロセス体外を模倣する PrPScの自己増殖する能力を悪用し、それによりごく微量検出レベル25 に PrPScの存在を増幅する非常に強力なツール ,26。RT QuIC 法はただし、変換製品の β シートの二次構造の濃縮が thioflavin T (Th T) をバインドできる具体的事実を活用します。したがって、組み換え PrP (rPrP) シードの変換時に、バインド Th T と、検出できるリアルタイムで Th T 時間をかけて相対的な蛍光ユニット (RFU) として表現の蛍光を測定することによってアミロイド線維に生えています。監視、RFU は相対的な播種活動と遅れ位相など定量的パラメーターを評価する使用できます。遅れ位相は、どの rPrP Th T 蛍光の検出限界値以下は反応の早い段階で変換のしきい値に到達するために必要な時間 (h) を表します。明らかラグの段階では、十分なアミロイド核 (核/伸び) の形成に付随の終わりは、Th T 蛍光閾値レベルを超えているし、ポジティブになるときに発生します。アミロイド線維は実際の時間と初期の PrPScやサンプルに含まれているシードの活動で検出できるの成長はより多くの種を生成するセグメンテーションによって増幅されます。これらの種は順番、アミロイド線維の成長の急速な指数段階を誘発します。

この試金は低 1 として検出することができるので PrPSc 24fg、感度の高い資格様々 な末梢組織、排泄物や他の PrPScを検出することにより、事前事後分析や非侵襲的診断を達成するためにこのテクニック感染性の低レベルをかくまっている標本の種類。RT QuIC 再現性、実用性、速さ (50 h 未満)、生物検定と比較して低コストで他のアッセイの利点を間違いなく提供します。PMCA; で使用される超音波処理など技術的な複雑さを回避します。また、各ウェルのエアロゾル汚染の危険性を最小にするテープ ・ シールのマイクロ プレートでそれを行います。複数井戸のフォーマット実験では同じ最大 96 サンプルの解析が可能。 にします。偽陽性の問題を再発と生体外の試金の変換 rPrP の自発的な転換に対抗するには、RT QuIC でしきい値 (カットオフ) の実装に便利です。確かに、ネガティブ コントロール (否定的なサンプル +5 SD 27の平均 RFU) の結果に基づき、基準を設定するから正と負のサンプル間の差別を行うことができます。各サンプルの 4 つの複製の使用はこうして複製の少なくとも 50%、肯定的な信号を示すとき肯定的なサンプルの定義に助けることができる、すなわちカットオフ28を渡ります。例えば以前の研究ではハムスター rPrP 発見されたヒトの PrPvCJDの相同の基板と比較してより敏感な基板にシードし、羊スクレイピー シード反応、RT-QuIC でシードと基板との間の相同性は必要ありません。29. ハムスター羊キメラ rPrP も人間 rPrP 30人間バリアント CJD プリオンを検出するよりもより適して基板に示唆されました。したがって、rPrP 基板上の異なる種からの使用は、この試金で非常に一般的です。この試金は散発的な CJD 31,32,33, gen などのいくつかのプリオン病に正常に適用されています。エティックのプリオン疾患34BSE 35,36,37、スクレイピー 23,36,40,4139,CWD 38、、、 42。用いた研究処理髄液、全血、唾液、尿 RT QuIC で種子が40,4139,PrPSc 38、、、を検出するすべての成功したも42アミロイド線維形成阻害剤を含む血漿などのサンプルで検出能力を育成する Orrú et al.。(2011)Scの PrP の免疫沈降 (IP) ステップと RT quic 社によるアミロイド線維形成阻害剤を削除するための戦略を開発、「quic 社強化」の試金 (eQuIC) の名前。さらに、基板交換の手順は、感度を向上させるために反応時間 〜 24 時間後採用されました。最終的には、として低 1 として PrPScの ag eQuIC 30によって検知されました。

糞便抽出物を浄化し、糞便中に可能なアッセイの阻害剤を削除、するために糞便経口感染実験にエルクから前臨床、臨床段階で収集された洗剤とプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーで均質化されました。糞便抽出物は、ナトリウム リンタングステン酸アルゼンチンタンゴダンスプロフェッショナル降水による蛋白質の沈殿物を利用したサンプルの PrPScを集中する異なる方法論をさらに堤出されました。最初 Safarらによって記述された NaPTA 沈殿法43, を使用して、テスト サンプルに PrPScを集中します。PrPCよりもむしろ PrPScの優遇の沈殿物のサンプルの結果と NaPTA のインキュベーション。ただし、分子メカニズムはまだ明らかではありません。このステップはまたを含む、いくつかのケースで観察される rPrP の自発的な変換を防ぐことを助けた。最後に、糞便抽出物は、最適化された RT-QuIC 基板としてマウス rPrP (aa 23-231) を使用して、プロトコルに基板交換を含む検出の感度を改善するために、テストされました。

ここでの結果は、この改良法 CWD プリオンの非常に低い集中を検出することができますなり、検出と糞便 NaPTA 降水量と基板交換せずプロトコルと比較して特異性の感度を示します。このメソッドは、可能性のある他の組織や体液に適用することができます、野生と飼育下のシカ科の CWD 監視のための偉大な使用することができます。

Protocol

1 です RT QuIC 糞便材料を用いた 糞便 10 mL に 1 g の糞便材料を追加することによって 作る エキス シカの糞準備 の糞便磨砕液抽出バッファー (20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.1 では、130 mM の NaCl、。0.05 %1 x 1 mM PMSF、トゥイーン 20 完了プロテアーゼ阻害剤、EDTA 無料) 最終濃度 10% (w/v) を与える。均質化のバッファーを利用する前に準備して-20 で格納できます ° C Ho…

Representative Results

検出の感度は低い27まだ CWD 糞便抽出液 10% (w/v) を用意していた RT QuIC 反応を播くことできます。具体的な取得することを許可鹿 rPrP 結果27のではなく、糞便の均質化の特定のバッファーを使用していたマウス rPrP 基板の使用する併用 RT QuIC 反応の高いバック グラウンド蛍光を避けるために重要なステップ。NaPTA 沈殿物の添加は、増?…

Discussion

RT QuIC 以前尿と糞便経口感染したミュールジカとオジロジカ38エキス CWD のプリオンを検出するため採用されました。この原稿に示すシステムは、RT QuIC アッセイの適応方法です。追加の手順は、検出と CWD プリオン感染した動物の糞便材料のためのアッセイの感度を改善するために「古典的な」RT QuIC 法に取り込まれました。

糞便抽出における検出感度?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

トレーニングとシカの PrP 細菌発現プラスミドを提供する博士バイロン コーイー (NIH ロッキー山研究所) に感謝しております。SG は、カナダの研究の椅子プログラムによってサポートされます。我々 はアルバータ州プリオン研究所ゲノム カナダとアルバータ州農業・林業ゲノム アルバータ州、カルガリー大学この作業を支援するから SG にこの研究のための資金を認めます。我々 は、動物研究のマーガレット ・ ガン財団から研究助成を認めます。

Materials

Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software
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References

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CWD PrionsFecal MaterialReal-time Quaking-induced Conversion AssayCervidChronic Wasting DiseaseSensitive DetectionHigh ThroughputSodium Phosphotungstic Acid PrecipitationRT-QuIC AssayThioflavin T

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Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).
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