मल सामग्री में CWD Prions का पता लगाने के लिए वास्तविक समय तड़पनेवाला-प्रेरित रूपांतरण परख
Summary
यहां, हम एक सरल, तेज और कुशल prion प्रवर्धन तकनीक, वास्तविक समय तड़पनेवाला-प्रेरित रूपांतरण (RT-त्वरि) विधि का वर्णन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
RT-त्वरि तकनीक है एक संवेदनशील इन विट्रो सेल मुक्त prion प्रवर्धन परख पर आधारित मुख्य रूप से बीज का खुलासा और संयोजक prion प्रोटीन के एकत्रीकरण (पीआरपी) सब्सट्रेट रूपांतरण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में prion बीज का उपयोग कर. RT-त्वरि एक उपंयास उच्च प्रवाह तकनीक है जो वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के अनुरूप है । amyloid फाइब्रिल विकास का पता लगाना डाई Thioflavin टी, जो ᵦ-शीट रिच प्रोटीन के साथ विशिष्ट बातचीत पर fluoresces पर आधारित है । इस प्रकार, amyloid गठन वास्तविक समय में पता लगाया जा सकता है । हम एक विश्वसनीय गैर इनवेसिव स्क्रीनिंग परीक्षण का पता लगाने के लिए विकसित करने की कोशिश की जीर्ण बर्बाद कर रोग (CWD) prions मल निकालने में । यहां, हम विशेष रूप से आरटी-त्वरि तकनीक अनुकूलित किया है CWD संक्रमित cervids के मल में पीआरपीअनुसूचित जाति बोने की गतिविधि प्रकट करते हैं । शुरू में, हम तैयार मल निष्कर्षों के बोने की गतिविधि RT-त्वरि में अपेक्षाकृत कम था, संभवत: मल सामग्री में संभावित परख अवरोधकों के कारण. मल निष्कर्षों के बोने की गतिविधि में सुधार और संभावित परख अवरोधकों को हटाने के लिए, हम एक बफर में मल के नमूनों homogenized डिटर्जेंट और चिढ़ाने अवरोधकों युक्त । हम भी विभिंन तरीकों से नमूनों को प्रस्तुत करने सोडियम phosphotungstic एसिड का उपयोग प्रोटीन वर्षण के आधार परअनुसूचित जाति , और केंद्रापसारक बल पर ध्यान केंद्रित । अंत में, मल अर्क अनुकूलित RT-त्वरि द्वारा परीक्षण किया गया था जो प्रोटोकॉल में सब्सट्रेट प्रतिस्थापन शामिल करने के लिए पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार. इस प्रकार, हम पूर्व के मल में CWD prion सीडिंग गतिविधि के प्रति संवेदनशील का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की नैदानिक और आरटी द्वारा नैदानिक cervids-त्वरि, जो गैर इनवेसिव CWD निदान के लिए एक व्यावहारिक उपकरण हो सकता है.
Introduction
Prion रोग या संक्रामक spongiform encephalopathies (त्से तुंग) मनुष्यों में neurodegenerative-Creutzfeldt रोग (Jakob) सहित CJD विकार हैं, गोजातीय spongiform मस्तिष्क (बीएसई) में मवेशी, भेड़ और बकरियों में scrapie, और जीर्ण अपव्यय रोग (CWD) मे cervids 1,2. TSEs विशिष्ट spongiform उपस्थिति और मस्तिष्क में न्यूरॉन्स की हानि की विशेषता है । “केवल प्रोटीन” परिकल्पना के अनुसार, prions मुख्य रूप से पीआरपीअनुसूचित जाति (scrapie के लिए ‘ अनुसूचित जाति ‘) 3, मेजबान इनकोडिंग सेलुलर prion प्रोटीन, पीआरपीसीका एक खुलासा isoform से बना रहे हैं । पीआरपी पीआरपीसी के रूपांतरण सेअनुसूचित जाति के परिणाम में एक अनुरूप ᵦ-शीट्स 4,5,6 जो एक बीज के रूप में कार्य करने के लिए बांध और अंय पीआरपीसी अणुओं में बदल सकते हैं । नव जनित पीआरपीअनुसूचित जाति अणुओं एक बढ़ती बहुलक 7,8 जो छोटे oligomers में टूट जाता है, संक्रामक नाभिक के उच्च संख्या में जिसके परिणामस्वरूप में शामिल कर रहे हैं । पीआरपीअनुसूचित जाति के एकत्रीकरण के लिए प्रवण है और आंशिक रूप से 9,10को छेड़ने के लिए प्रतिरोधी है ।
CWD को प्रभावित करता है जंगली और खेतिहर एल्क (Cervus canadensis), खच्चर हिरण (Odocoileus hemionus), सफेद पूंछ हिरण (WTD; Odocoileus virginianus), मूस (Alces Alces), व हिरन (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. यह क्षैतिज संचरण के साथ सबसे संक्रामक prion रोग माना जाता है cervid बातचीत और infectivity के पर्यावरणीय हठ 14,15द्वारा इष्ट । अंय prion रोगों के विपरीत जहां पीआरपीअनुसूचित जाति संचय और infectivity मस्तिष्क तक ही सीमित हैं, CWD में ये भी परिधीय ऊतकों और शरीर के तरल पदार्थ में पाया जाता है जैसे लार, मूत्र, और मल 16,17, 18.
Immunohistochemistry पीआरपी का पता लगाने के लिए CWD निदान के लिए स्वर्ण मानक माना जाता हैअनुसूचित जाति वितरण और spongiform घावों 19,20. एलिसा और अधिक दुर्लभ मामलों में, पश्चिमी दाग भी CWD निदान के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । इस प्रकार, वर्तमान prion रोग निदान मुख्य रूप से पोस्टमार्टम ऊतकों में prions का पता लगाने पर आधारित है । CWD के लिए पूर्व-मार्टम निदान tonsils या recto-गुदा म्यूकोसा-जुड़े लसीकावत् ऊतक (RAMALT) बायोप्सी लेने के द्वारा उपलब्ध है; हालांकि, इस प्रक्रिया आक्रामक है और जानवरों के कब्जे की आवश्यकता है । इस प्रकार, मूत्र और मल के रूप में आसानी से सुलभ नमूनों का उपयोग, CWD prion का पता लगाने के लिए एक व्यावहारिक तरीका होगा. हालांकि, उन मलमूत्र बंदरगाह अपेक्षाकृत कम prions की सांद्रता वर्तमान निदान विधियों का पता लगाने की सीमा के नीचे । नतीजतन, एक अधिक संवेदनशील और उच्च प्रवाह नैदानिक उपकरण की जरूरत है । इन विट्रो में जैसे प्रोटीन चक्रीय प्रवर्धन परख (PMCA) 21, amyloid सीडिंग परख, और वास्तविक समय तड़पनेवाला-प्रेरित रूपांतरण (RT-त्वरि) परख 22,23, 24 बहुत शक्तिशाली उपकरण को स्वयं का दोहन करने के लिए पीआरपीअनुसूचित जाति के प्रचार की क्षमता इन विट्रो prion रूपांतरण की प्रक्रिया में नकल है और इस तरह पीआरपीअनुसूचित जाति के मिनट की मात्रा की उपस्थिति बढ़ाना 25 ,26. आर टी-त्वरि विधि, तथापि, इस तथ्य का लाभ लेता है कि β-पत्रक द्वितीयक संरचना में समृद्ध रूपांतरण उत्पाद विशेष रूप से thioflavin t (Th-t) बाइंड कर सकते हैं । इसलिए, संयोजक पीआरपी (rPrP) पर वरीयता प्राप्त रूपांतरण amyloid तंतुओं में बढ़ता है जो गु-t बांध और इस तरह गु के प्रतिदीप्ति को मापने के द्वारा वास्तविक समय में पता लगाया जा सकता है-टी समय के सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) के रूप में व्यक्त की । एक बार निगरानी की, RFU इस तरह के अंतराल चरण के रूप में रिश्तेदार बोने की गतिविधियों, और मात्रात्मक मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंतराल चरण (एच) दहलीज तक पहुंचने के लिए आवश्यक समय का प्रतिनिधित्व करता है, जिसके दौरान प्रतिक्रिया के प्रारंभिक चरण में rPrP रूपांतरण गु-T प्रतिदीप्ति की पता लगाने की सीमा के नीचे है । स्पष्ट अंतराल चरण के अंत, एक पर्याप्त amyloid नाभिक (nucleation/बढ़ाव) के गठन के लिए सहवर्ती, तब होता है जब गु टी प्रतिदीप्ति सीमा स्तर से अधिक है और सकारात्मक हो जाता है । amyloid तंतुओं के विकास के वास्तविक समय में पता लगाया जा सकता है और प्रारंभिक पीआरपीअनुसूचित जाति या बोने की क्रिया नमूना में निहित है जो अधिक बीज उत्पंन द्वारा परिलक्षित है । बारी में इन बीजों amyloid फाइबर विकास की एक तेजी से घातीय चरण प्रेरित ।
क्योंकि इस परख के रूप में कम के रूप में पता लगाने में सक्षम है 1 पीआरपीअनुसूचित जाति के 24fg, उच्च संवेदनशीलता इस तकनीक के लिए विभिंन परिधीय ऊतकों, मलमूत्र या अंय में पीआरपीअनुसूचित जाति का पता लगाने से पूर्व मार्टम या गैर इनवेसिव निदान प्राप्त करने के लिए उत्तीर्ण infectivity के निम्न स्तर बंदरगाह नमूना के प्रकार. RT-त्वरि निश्चित रूप से अपने reproducibility, व्यावहारिकता, तेजी (कम से ५० ज) और कम लागत के लिए परख की तुलना में अंय परख पर लाभ प्रदान करता है । यह PMCA में इस्तेमाल किया sonication जैसे तकनीकी जटिलताओं से बचा जाता है; इसके अलावा, यह एक टेप में किया जाता है-सील microplate जो एक अच्छी तरह से एयरोसोल संदूषण के जोखिम को कम करता है । बहु-कुआं स्वरूप एक ही प्रयोग में ९६ नमूनों तक के विश्लेषण को सक्षम बनाता है । में झूठी सकारात्मक और rPrP के सहज रूपांतरण की आवर्तक समस्या का मुकाबला करने में इन विट्रो रूपांतरण परख एक दहलीज के कार्यांवयन में (कट-ऑफ) RT-त्वरि बहुत उपयोगी है । दरअसल, नकारात्मक नियंत्रण (नकारात्मक नमूनों की औसत RFU + 5 एसडी 27) के परिणामों के आधार पर, एक आधार रेखा से सेट अप किया जाता है जिसमें सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों के बीच भेदभाव हो सकता है. प्रत्येक नमूने के लिए चार की प्रतिकृति का उपयोग इस प्रकार के रूप में एक नमूना परिभाषित करने में मदद कर सकते है सकारात्मक जब कम से ५०% की प्रतिकृतियां एक सकारात्मक संकेत दिखाने के लिए, यानी कट पार 28। बीज और सब्सट्रेट के बीच समरूपता RT-त्वरि में की आवश्यकता नहीं है, उदाहरण के रूप में एक पिछले अध्ययन में, हंसटर rPrP एक अधिक संवेदनशील सब्सट्रेट मानव पीआरपी में मुताबिक़ सब्सट्रेट की तुलना में पाया गया थाvCJD वरीयता प्राप्त और भेड़ scrapie अस्तव्यस्त प्रतिक्रियाओं 29. हंसटर-भेड़ chimeric rPrP भी मानव rPrP की तुलना में एक और अधिक अच्छी तरह से अनुकूल सब्सट्रेट होने का सुझाव दिया गया था CJD prions 30मानव संस्करण का पता लगाने । इस प्रकार, विभिंन प्रजातियों से rPrP सब्सट्रेट का उपयोग इस परख में बहुत आम है । इस परख सफलतापूर्वक कई prion रोगों के लिए लागू किया गया है, जैसे छिटपुट CJD 31,३२,३३, genेटिक prion रोग ३४, बीएसई ३५,३६,३७, scrapie 23,३६, और CWD ३८,३९,४०,४१, ४२. RT-त्वरि में बीज के रूप में प्रसंस्कृत मस्तिष्कमेरु द्रव, पूरे रक्त, लार, और मूत्र का उपयोग कर अध्ययन सभी पीआरपीअनुसूचित जाति ३८का पता लगाने के लिए सफल रहे थे,३९,४०,४१, ४२. ऐसे रक्त प्लाज्मा कि amyloid गठन, Orrú एट अलके अवरोधक शामिल हो सकते है के रूप में नमूनों में पता लगाने की क्षमता को बढ़ावा । (२०११) द्वारा amyloid गठन के संभावित अवरोधकों को दूर करने के लिए एक रणनीति विकसित की मुसलिम पीआरपीअजा immunoprecipitation (आईपी) स्टेप और आरटी-त्वरि, नाम दिया गया “एन्हांस्ड त्वरि” परख (eQuIC). इसके अलावा, एक सब्सट्रेट प्रतिस्थापन चरण के बाद नियोजित किया गया था ~ 24 प्रतिक्रिया समय के एच में आदेश संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए. अंततः, के रूप में के रूप में कम के रूप में 1 पीआरपीअनुसूचित जाति के एजी 30eQuIC द्वारा detectable था ।
आदेश में मल के अर्क को शुद्ध करने के लिए और मल में संभव परख अवरोधकों को हटाने, मल प्रयोगात्मक मौखिक संक्रमण पर एल्क से नैदानिक और नैदानिक चरणों में एकत्र नमूनों डिटर्जेंट और चिढ़ाने अवरोधकों युक्त बफर में homogenized थे । मल निष्कर्षों आगे विभिंन तरीकों को प्रस्तुत किया गया सोडियम phosphotungstic एसिड (NaPTA) वर्षण के माध्यम से प्रोटीन वर्षण का उपयोग नमूनों में पीआरपीअनुसूचित जाति ध्यान केंद्रित । NaPTA वर्षण विधि, पहले सफर एट अल द्वारा वर्णित है । ४३, परीक्षण नमूनों में पीआरपीअनुसूचित जाति ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । पीआरपीसीके बजाय पीआरपीअनुसूचित जाति के तरजीही वर्षण में नमूना परिणामों के साथ NaPTA की मशीन । हालांकि, आणविक तंत्र अभी भी अस्पष्ट है । यह कदम भी शामिल है और rPrP, जो कुछ मामलों में मनाया जाता है के सहज रूपांतरण को रोकने में मदद की । अंत में, मल अर्क अनुकूलित आरटी द्वारा परीक्षण किया गया त्वरि माउस rPrP (एए 23-231) का उपयोग कर एक सब्सट्रेट के रूप में और प्रोटोकॉल में सब्सट्रेट प्रतिस्थापन सहित पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए.
यहाँ परिणाम प्रदर्शित करता है कि इस विधि में सुधार CWD prions के बहुत कम सांद्रता का पता लगा सकते हैं और NaPTA वर्षा और सब्सट्रेट प्रतिस्थापन के बिना एक प्रोटोकॉल की तुलना में मल नमूनों में पता लगाने और विशिष्टता की संवेदनशीलता बढ़ जाती है. इस विधि संभावित अंय ऊतकों और शरीर के तरल पदार्थ के लिए लागू किया जा सकता है और जंगली और कैप्टिव cervids में CWD निगरानी के लिए महान उपयोग की जा सकती है ।
Protocol
1. भ-त्वरि मल सामग्री का उपयोग कर की तैयारी cervid मल का अर्क मल को जोड़कर मल कर homogenate कर के 1 जी की सामग्री के 10 मिलीलीटर में से जोड़ें बफर (20 मिमी सोडियम फॉस्फेट, पीएच ७.१, १३० मिमी NaCl, ०.०५% 20 के बीच, 1 m…
Representative Results
Discussion
RT-त्वरि पहले मूत्र और मौखिक रूप से संक्रमित सफेद पूंछ हिरण और खच्चर हिरण के मल अर्क में CWD prions का पता लगाने के लिए कार्यरत था ३८। इस पांडुलिपि में दिखाया प्रणाली RT-त्वरि परख के एक अनुकूलित विधि है ।…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रशिक्षण और cervid पीआरपी बैक्टीरियल अभिव्यक्ति प्लाज्मिड प्रदान करने के लिए Dr. Caughey (NIH रॉकी पर्वत प्रयोगशालाओं) के लिए आभारी हैं । एसजी कनाडा रिसर्च चेयर प्रोग्राम द्वारा समर्थित है । हम इस अनुसंधान के लिए धन स्वीकार जीनोम कनाडा, अलबर्टा Prion अनुसंधान संस्थान और अलबर्टा कृषि और वानिकी जीनोम अलबर्टा के माध्यम से, और इस काम के समर्थन में कैलगरी विश्वविद्यालय से एसजी । हम पशु अनुसंधान के लिए मार्गरेट साध फाउंडेशन से एक अनुसंधान अनुदान स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Materials | |||
| Acrodisc seringe filters | PALL | 4652 | |
| amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit | Millipore | UCF901024 | |
| BD 10 ml seringe | VWR | CA75846-842 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Corning bottle-top vacuum filters | Sigma-Aldrich | 431118 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| gentleMACS M Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | ThermoFisher Scientific | 12780029 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| N2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 15502048 | |
| N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | ML9150 | |
| Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K | PALL | OD100C34 | |
| Nunc sealing tapes | ThermoFisher Scientific | 232702 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-000 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Calbiochem | 7910-OP | |
| sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) | Sigma-Aldrich | 496626 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516 | |
| Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Triton-100 | Calbiochem | 9410-OP | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial buffers and solutions | |||
| BugBuster Master Mix | Nogagen | 71456-4 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 1018401 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) | Life Technoligies | P5493 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standards and commercial kits | |||
| Express Autoinduction System 1 | Novagen | 71300-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment setup | |||
| AKTA protein purification systems FPLC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Beckman Avanti J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-25.50 | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-10 | Beckman Coulter | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sofware | |||
| MARS Data Analysis | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism6 | GraphPad software |
References
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