JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Sanntid skjelvende-indusert konvertering analysen for påvisning av CWD prioner i Fecal materiale

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/56373
, , , , ,
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine,University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology,University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency,Lethbridge Laboratories

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å beskrive en enkel, rask og effektiv prion forsterkning teknikk, sanntid skjelvende-indusert (RT-QuIC) konverteringsmetoden.

Abstract

RT-QuIC teknikken er en følsom i vitro celle-fri prion forsterkning analysen basert hovedsakelig på seeded misfolding og aggregering av rekombinant prion protein (PrP) substrat bruke prion frø som mal for konvertering. RT-QuIC er en høy gjennomstrømming teknikken som er analoge til sanntids polymerasekjedereaksjons (PCR). Påvisning av amyloid fibril vekst er basert på fargestoff Thioflavin T, som fluoresces på bestemt interaksjon med ᵦ ark rik proteiner. Amyloid formasjon kan dermed oppdages i sanntid. Vi forsøkte å utvikle en pålitelig ikke-invasiv screening test for å oppdage kronisk herjer sykdom (CWD) prioner i fecal ekstrakt. Her har vi spesielt tilpasset RT-QuIC teknikken å avsløre PrPSc seeding aktivitet i avføringen til CWD infisert cervids. I utgangspunktet var seeding aktiviteten av fecal ekstrakter vi forberedt relativt lav i RT-QuIC, muligens på grunn av potensielle analysen hemmere i fecal materiale. Å forbedre seeding aktivitet av avføring ekstrakter og fjerne potensielle analysen hemmere, homogenisert vi fecal prøvene i en buffer som inneholder vaskemidler og proteasehemmere. Sendte vi også prøver å forskjellige metoder å satse PrPSc basert på protein nedbør natrium phosphotungstic syre og sentrifugalkraften. Til slutt, avføring ekstrakter ble testet av optimalisert RT-QuIC som inkluderte substrat erstatning i protokollen å forbedre følsomheten til gjenkjenning. Dermed har vi etablert en protokoll for følsom påvisning av CWD prion seeding aktivitet i avføringen til prekliniske og kliniske cervids av RT-QuIC, som kan være et praktisk verktøy for ikke-invasiv CWD diagnose.

Introduction

Prionsykdommer eller smittsomme kugalskap Anne encephalopathies (TSE) er nevrodegenerative lidelser inkludert Creutzfeldt – Jakobssykdom (CJD) hos mennesker, kugalskap (BSE) i storfe, Skrapesyke sauer og geiter og kronisk sløse sykdom (CWD) i cervids 1,2. TSEs kjennetegnes av særegne kugalskap Anne utseende og tap av nerveceller i hjernen. Ifølge hypotesen “bare protein” består prioner hovedsakelig av PrPSc (“Sc” for Skrapesyke) 3, en misfolded isoformen av vert-kodet mobilnettet prion protein, PrPC. PrPSc resultat av konvertering av PrPC i en konformasjon beriket i ᵦ-ark 4,5,6 som kan fungere som et frø å binde og konvertere andre PrPC molekyler. Nyopprettede PrPSc molekylene er innlemmet i et voksende polymer 7,8 som bryter inn i mindre oligomers, noe som resulterer i høyere antall smittsomme kjerner. PrPSc er utsatt for aggregering og delvis motstandsdyktige mot proteaser 9,10.

CWD påvirker ville og Oppdrettede elg (Cervus canadensis), muldyr hjort (Odocoileus hemionus), Hvithalehjort (WTD; Odocoileus virginianus), elg (av av) og reinsdyr (gode tarandus tarandus) 11,12,13. Det anses mest smittsom prion sykdommen med vannrette overføring foretrekkes av cervid vekselsvirkningene og miljømessige utholdenhet infectivity 14,15. I motsetning til andre prionsykdommer der PrPSc akkumulering og infectivity er begrenset til hjernen, i CWD finnes disse også i perifere vev og kroppsvæsker f.eks spytt, urin og avføring 16,17, 18.

Immunohistochemistry regnes gullstandarden for CWD diagnose å oppdage PrPSc distribusjon og kugalskap Anne lesjoner 19,20. ELISA og i mer sjeldne tilfeller western blot brukes også for CWD diagnostikk. Dermed er gjeldende prion sykdom diagnose hovedsakelig basert på oppdage prioner obduksjon vev. Ante-mortem diagnose for CWD er tilgjengelig ved å ta mandlene eller recto-anal mucosa-assosiert lymfoid vev (RAMALT) biopsier; men denne prosedyren er invasiv og krever erobringen av dyrene. Dermed ville bruk av lett tilgjengelig prøver, som urin og avføring, være en praktisk måte for CWD prion gjenkjenning. Men disse ekskrementer harbor relativt lave konsentrasjoner av prioner under gjenkjenning grensen på gjeldende diagnostiske metoder. Derfor er et mer følsom og høy gjennomstrømning diagnostisk verktøy nødvendig. In vitro konvertering systemer, for eksempel protein misfolding syklisk forsterkning analysen (PMCA) 21, amyloid seeding analysen, og sanntids skjelvende-indusert konvertering (RT-QuIC) analysen 22,23, 24 er svært kraftige verktøy å utnytte PrPSc selv-forplanter evnen til å etterligne i vitro prion konverteringen, og dermed forsterke tilstedeværelsen av minutt mengder PrPSc til Detektbart nivåer 25 ,26. Metoden RT-QuIC imidlertid tar nytte av det faktum at konvertering produktet beriket β arks sekundære struktur kan spesielt binde thioflavin T (Th-T). Derfor vokser rekombinant PrP (rPrP) på frø konvertering til amyloid fibrils som binder Th-T og dermed kan oppdages i sanntid ved å måle fluorescens av Th-T uttrykt som relative fluorescens enheter (RFU) over tid. Når overvåket, kan RFU brukes til å evaluere relativ seeding aktiviteter og kvantitative parametere som lag fasen. Lag fasen representerer klokkeslettet (h) kreves for å nå terskelen, under hvilke rPrP konvertering på et tidlig stadium av reaksjonen er under gjenkjenning grensen på Th-T fluorescens. Slutten av den tilsynelatende lag fasen, samtidig til dannelsen av en tilstrekkelig amyloid kjerne (nucleation/forlengelse), oppstår når Th-T fluorescens overskrider terskelen nivået og positivt. Veksten av amyloid fibrils kan oppdages i sanntid og første PrPSc eller seeding aktivitet i prøven forsterkes av segmentering som genererer flere frø. Disse frø indusere igjen en rask eksponentiell vekstfase amyloid fiber.

Fordi denne analysen er kjøpedyktig merker så lavt som 1 fg PrPSc 24, høy følsomhet kvalifiserer denne teknikken å oppnå ante mortem eller ikke-invasiv diagnose av oppdager PrPSc i ulike perifere vev, ekskrementer eller andre typer prøven skjuler lave nivåer av infectivity. RT-QuIC absolutt gir fordeler over andre analyser for reproduserbarhet, praktiske, hurtighet (mindre enn 50 h) og lave kostnader i forhold til bioassay. Det unngår tekniske kompleksiteten som sonication brukt i PMCA; også er det utført i en tape-forseglet microplate som reduserer risikoen for Aerosolforurensning i hver brønn. Flere godt formatet gjør det mulig for analyse av opptil 96 prøvene i samme eksperiment. For å motvirke tilbakevendende problemet med falske positiver og spontan konvertering av rPrP i i vitro konvertering analyser er gjennomføringen av en terskel (cut-off) i RT-QuIC svært nyttig. Faktisk defineres basert på resultatene av kontrollen negative (gjennomsnittlig RFU negative prøver 5 SD 27), en grunnlinje som diskriminering mellom positive og negative eksempler kan gjøres. Bruk av fire gjentak for hvert utvalg kan dermed bidra til å definere et utvalg som positive når minst 50% av replikat viser et positivt signal, kors dvs cut-off 28. Homologi mellom frø og underlaget er ikke nødvendig i RT-QuIC, som f.eks i en tidligere studie, hamster rPrP ble funnet å være en mer sensitivt underlag sammenlignet med homologe underlaget i menneskelig PrPvCJD seeded og sauer Skrapesyke seeded reaksjoner 29. hamster-sauer chimeric rPrP ble også foreslått for å være et mer egnet medium enn menneskelig rPrP å oppdage menneskelige varianten CJD prioner 30. Dermed er bruk av rPrP underlag fra ulike arter svært vanlig i denne analysen. Denne analysen har blitt aktivert for flere prionsykdommer, som sporadisk CJD 31,32,33, genetikk prion sykdommer 34, BSE 35,36,37, Skrapesyke 23,36og CWD 38,39,40,41, 42. Studier med behandlet Cerebrospinalvæske, hele blod, spytt og urin som frø i RT-QuIC klarte alle å oppdage PrPSc 38,39,40,41, 42. å fremme oppdagelsen evnen i prøver som blodplasma som kan inneholde hemmere av amyloid formasjon, Orrú et al. (2011) utviklet en strategi for å fjerne potensielle hemmere av amyloid dannelsen av gre PrPSc immunoprecipitation (IP) trinn og RT-QuIC, kalt “forbedret QuIC” analysen (eQuIC). I tillegg ble et substrat erstatning skritt ansatt etter ~ 24 h reaksjon for å forbedre følsomheten. Til slutt, som lavt som 1 ag i PrPSc var detectable av eQuIC 30.

For å rense avføring ekstrakter og fjerne mulig analysen hemmere i avføring, ble fecal prøver innsamlet på prekliniske og kliniske stadier fra elg på eksperimentell oral smitte homogenisert buffer inneholder vaskemidler og proteasehemmere. Avføring ekstrakter ble ytterligere sendt til ulike metoder til å konsentrere PrPSc i eksemplene bruker protein nedbør via natrium phosphotungstic syre (NaPTA) nedbør. Metoden NaPTA nedbør, først beskrevet av Safar et al. 43, brukes til å konsentrere PrPSc i test prøver. Inkubasjonstiden for NaPTA prøven resultatene i fortrinnsrett nedbør PrPSc i stedet for PrPC. Molekylær mekanismen er imidlertid uklart. Dette trinnet hjalp også inneholder og hindre spontan konvertering av rPrP, som er observert i noen tilfeller. Til slutt, avføring ekstrakter ble testet av optimalisert RT-QuIC bruker musen rPrP (aa 23-231) som et substrat og inkludert substrat erstatning i protokollen å forbedre følsomheten til gjenkjenning.

Resultater her viser at denne forbedret metoden finner svært lave konsentrasjoner av CWD prioner og øker følsomheten til gjenkjenning og spesifisitet i fecal prøver i forhold til en protokoll uten NaPTA nedbør og underlaget erstatning. Denne metoden potensielt kan brukes til andre vev og kroppsvæsker og kan være av stor bruk for CWD overvåking i vill og fange cervids.

Protocol

1. RT-QuIC bruker Fecal materiale utarbeidelse av cervid avføring ekstrakter gjør fecal homogenate ved å legge 1 g av fecal materiale til 10 mL av avføring ekstra buffer (20 mM natrium fosfat, pH 7.1, 130 mM NaCl, 0,05% mellom 20, 1 mM PMSF og 1 x komplett proteasehemmere, EDTA-fri) å gi en endelig konsentrasjon på 10% (w/v). Homogenisering bufferen kan være forberedt før utnyttelse og lagret på -20 ° C. Homogenize fecal pellets (1 g) og buffer (10 mL) i rør (f.ek…

Representative Results

CWD fecal ekstrakter forberedt på 10% (w/v) kunne frø RT-QuIC reaksjon, men følsomheten til gjenkjenning var lav 27. Bruke en bestemt buffer for fecal homogenisering var et kritisk steg til unngå høye fluorescens i RT-QuIC reaksjoner samtidig bruk av mus rPrP underlaget i stedet for hjort rPrP som kan få mer spesifikke resultater 27. Tillegg av NaPTA nedbør redusert spontan konvertering av rPrP i RT-QuIC (figur 1<…

Discussion

RT-QuIC var tidligere ansatt å oppdage CWD prioner i urin og avføring ekstrakter av muntlig infiserte Hvithalehjort og muldyr hjort 38. Systemet vist i dette manuskriptet er en tilpasset RT-QuIC analysen. Forholdsregler ble innlemmet i “klassiske” RT-QuIC analysen å forbedre gjenkjenning og følsomhet til analysen for CWD prioner i fecal materiale av infiserte dyr.

Lav følsomheten til gjenkjenning i avføring ekstrakter ledet oss til forbedring av RT-QuIC protokolle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er takknemlige for Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) for å gi opplæring og cervid PrP bakteriell uttrykk plasmider. SG støttes av programmet Canada forskning stol. Vi erkjenner finansiering for denne forskningen til SG fra Genome Canada, Alberta Prion Research Institute og Alberta jordbruk og skogbruk genomet Alberta og University of Calgary for å støtte dette arbeidet. Vi erkjenner et forskningsstipend fra Margaret Gunn Foundation for dyr forskning.

Materials

Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
  2. Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
  3. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
  5. Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
  6. Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
  7. Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
  8. Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
  9. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
  10. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  11. Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
  12. Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
  13. Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
  14. Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
  15. Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
  16. Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
  17. Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
  18. Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
  19. Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
  20. Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
  21. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
  22. Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
  23. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
  26. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  27. Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
  28. Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
  29. Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  30. Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
  31. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
  32. Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
  33. Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
  34. Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
  35. Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
  36. Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
  37. Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
  38. John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
  39. Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
  40. Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
  41. Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
  42. Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
  43. Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
  44. Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  45. Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
  46. Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
  47. Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
  48. Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
  49. Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
  50. Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
  51. Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  52. McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
  53. Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).

Tags

CWD PrionsFecal MaterialReal-time Quaking-induced Conversion AssayCervidChronic Wasting DiseaseSensitive DetectionHigh ThroughputSodium Phosphotungstic Acid PrecipitationRT-QuIC AssayThioflavin T

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image