JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Realtid skakande-inducerad konvertering analys för detektion av CWD prioner i fekalt Material

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/56373
, , , , ,
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine,University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology,University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency,Lethbridge Laboratories

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att beskriva en enkel, snabb och effektiv prion amplifiering, konverteringsmetoden realtid skakande-inducerad (RT-SN).

Abstract

RT-QuIC tekniken är en känslig i vitro cellfria prion förstärkning analys baserat främst på seedade Skellefteåsjukan och aggregering av rekombinant prion protein (PrP) substrat med prion frön som en mall för konvertering. RT-QuIC är ny hög genomströmning teknik som är jämförbar med realtid polymeraskedjereaktion (PCR). Påvisande av amyloid fibrill tillväxt bygger på färgämnet Tioflavin T, som fluorescerar vid särskild interaktion med ᵦ ark rika proteiner. Således, amyloid bildas kan upptäckas i realtid. Vi försökte utveckla en tillförlitlig noninvasiv screeningtest för att påvisa kroniskt avmagrade sjukdom (CWD) prioner i fekal extrakt. Här har vi specifikt anpassat RT-QuIC tekniken för att avslöja PrPSc sådd aktivitet i avföring från CWD infekterade hjortdjur. Inledningsvis var aktiviteten sådd av fekal extrakten vi beredda relativt låg i RT-sn, möjligen på grund av potentiella assay inhibitorer av fekalt material. För att förbättra sådd aktivitet av avföring extrakt och ta bort potentiella assay inhibitorer, homogeniserad vi fekal proverna i en buffert som innehåller rengöringsmedel och proteashämmare. Vi lämnade också olika metoder att koncentrera PrPSc på grundval av protein nederbörd med natrium phosphotungstic syra och centrifugalkraften proverna. Slutligen, extrakt av avföring testades av optimerad RT-QuIC som inkluderade substrat ersättare i protokollet till förbättra känsligheten för upptäckt. Således etablerat vi ett protokoll för känslig detektion av CWD prion sådd aktivitet i avföring från prekliniska och kliniska hjortdjur av RT-sn, vilket kan vara ett praktiskt verktyg för icke-invasiv CWD diagnos.

Introduction

Prionsjukdomar eller transmissibel spongiform encefalopati (TSE) är neurodegenerativa sjukdomar inklusive Creutzfeldt – Jakobs sjukdom (CJS) hos människor, bovin spongiform encefalopati (BSE) hos nötkreatur, skrapie hos får och getter, och chronic wasting disease sjukdom (CWD) hos hjortdjur 1,2. TSE är kännetecknas av särskiljande spongiform utseende och förlust av nervceller i hjärnan. Enligt ”endast protein” hypotesen består prioner huvudsakligen av PrPSc (‘Sc’ för skrapie) 3, ett felveckning isoformen av värd-kodade cellulära prionproteinet, PrPC. PrPSc resultat från omvandling av PrPC till en konformation berikad i ᵦ-ark 4,5,6 som kan fungera som ett frö att binda och konvertera andra PrPC molekyler. De nyligen genererade PrPSc -molekylerna införlivas i en växande polymer 7,8 som bryter sig in mindre oligomerer, vilket resulterar i högre nummer av infektiös atomkärnor. PrPSc är benägna att aggregering och är delvis resistenta mot proteaser 9,10.

CWD påverkar vild och odlad älg (Cervus canadensis), mule deer (Odocoileus hemionus), vitsvanshjort (WTD; Odocoileus virginianus), älgen (Alces alces) och renar (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Är det den mest smittsamma prion sjukdomen med horisontell överföring gynnas av hjortdjur interaktioner och miljömässiga persistens av smittsamhet 14,15. Till skillnad från andra prionsjukdomar där PrPSc ackumulering och smittsamhet är begränsade till hjärnan, i CWD finns dessa också i perifera vävnader och kroppsvätskor t.ex. saliv, urin och avföring 16,17, 18.

Immunhistokemi anses vara den gyllene standarden för CWD diagnos att upptäcka PrPSc distribution och spongiform lesioner 19,20. ELISA och i mer sällsynta fall, western blot används också för CWD diagnostik. Således, nuvarande prion sjukdomsdiagnos baseras huvudsakligen på att upptäcka prioner i postmortala vävnader. Ante-mortem-diagnos för CWD är tillgänglig genom att ta tonsiller eller recto-anal slemhinna-associerade lymfoida vävnad (RAMALT) biopsier; men proceduren är invasiv och kräver avskiljning av djuren. Således, användning av lättillgänglig prover, såsom urin och avföring, vore ett praktiskt sätt för CWD prion upptäckt. Dock dessa exkrementer harbor relativt låga koncentrationer av prioner under detektionsgränsen av nuvarande diagnostiska metoder. Följaktligen krävs det en mer känslig och hög genomströmning diagnostiskt verktyg. In vitro konvertering system, såsom protein Skellefteåsjukan cykliska förstärkning assay (PMCA) 21, amyloid sådd assay och realtid skakande-inducerad konvertering (RT-QuIC) assay 22,23, 24 är mycket kraftfulla verktyg att utnyttja PrPSc egenföretagare föröknings förmåga att härma i vitro prion konverteringsprocessen och därmed förstärka närvaron av minuten mängder PrPSc till detekterbara halter 25 ,26. RT-QuIC metoden, men tar fördel av det faktum att produktens omvandlingen berikad i β-ark sekundärt strukturera specifikt kan binda Tioflavin T (Th-T). Därför växer rekombinant PrP (rPrP) vid seedade konvertering till amyloida fibriller som binder Th-T och därmed kan upptäckas i realtid genom att mäta fluorescensen av Th-T uttryckt som relativa fluorescens enheter (RFU) över tid. När övervakas, kan RFUEN användas för att utvärdera relativ sådd aktiviteter och kvantitativa parametrar såsom fasen eftersläpning. Den eftersläpning fasen representerar den tid (h) som krävs för att nå tröskeln, under vilka rPrP konvertering i det tidiga skedet av reaktionen understiger detektionsgränsen för Th-T fluorescens. I slutet av fasen uppenbar eftersläpning, samtidig till bildandet av en tillräcklig amyloid kärna (kärnbildning/töjning), uppstår när Th-T fluorescensen överskrider tröskelvärdet och blir positiva. Tillväxten av amyloida fibriller kan upptäckas i realtid och inledande PrPSc eller sådd aktivitet som ingår i urvalet förstärks genom segmentering som genererar mer frön. Dessa frön inducerar i sin tur en snabb exponentiell fas av amyloid fiber tillväxt.

Eftersom denna analys är köpa duktig upptäcka så lågt som 1 fg PrPSc 24, hög känslighet kvalificerar denna teknik för att uppnå slakt eller icke-invasiv diagnostik genom att upptäcka PrPSc i olika perifera vävnader, exkrementer eller andra typer av preparatet härbärgerat låga nivåer av smittsamhet. RT-QuIC ger definitivt fördelar över andra analyser för dess reproducerbarhet, funktionalitet, snabbhet (mindre än 50 h) och låga kostnader jämfört med bioassays. Man undviker de tekniska komplexitet som ultraljudsbehandling används i PMCA; också, det utförs i en tape-förseglade mikroplattan vilket minimerar risken för aerosol förorening av varje brunn. Flera format möjliggör analys av upp till 96 prover i samma experiment. För att motverka det återkommande problemet med falska positiva och spontan konvertering av rPrP i in vitro- konvertering analyserna är genomförandet av ett tröskelvärde (cut-off) i RT-QuIC mycket användbar. Faktiskt, baserat på resultaten av den negativa kontrollen (genomsnittliga RFU negativa prover + 5 SD 27), en originalplan ställs in som diskriminering mellan positiva och negativa prover kan göras. Användningen av fyra replikat för varje prov kan därmed bidra till att definiera ett prov som positiv när minst 50% av replikerar visar en positiv signal, över dvs cut-off 28. Homologi mellan utsäde och substrat krävs inte i RT-sn, som t.ex. i en tidigare studie, hamster rPrP konstaterades att vara mer känsliga substrat jämfört med homologa substratet i mänskliga PrPvCJD seedade och fåren skrapie seedade reaktioner 29. hamster-får chimära rPrP föreslogs också för att vara ett mer lämpade substrat än mänsklig rPrP att upptäcka mänsklig variant CJD prioner 30. Således, användning av rPrP substrat från olika arter är mycket vanliga i denna analys. Denna analys har framgångsrikt tillämpats flera prionsjukdomar, såsom sporadisk CJD 31,32,33, genEtic prion sjukdomar 34, BSE 35,36,37, skrapie 23,36och CWD 38,39,40,41, 42. Studier med bearbetade cerebrospinalvätska, helblod, saliv och urin som frön i RT-QuIC var alla framgångsrika att upptäcka PrPSc 38,39,40,41, 42. att främja förmågan att detektera i prover såsom blod plasma som kan innehålla hämmare av amyloid bildas, Orrú et al. (2011) utvecklat en strategi för att ta bort potentiella inhibitorer av amyloid bildas genom kamning PrPSc immunoprecipitation (IP) steg och RT-QuIC, heter ”enhanced QuIC” assay (eQuIC). Dessutom anställdes ett substrat ersättning steg efter ~ 24 h av reaktionstid för att förbättra känsligheten. Slutligen, som låg som 1 ag av PrPSc var upptäckas av eQuIC 30.

För att rena avföring extrakt och ta bort eventuella assay-hämmare i avföring, var fecal prov som samlats i prekliniska och kliniska stadier från älg vid experimentell oral infektion homogeniserad i buffert som innehåller rengöringsmedel och proteashämmare. Extrakt av avföring lämnades vidare till olika metoder för att koncentrera PrPSc i de prover som utnyttjar protein nederbörd via natrium phosphotungstic syra (NaPTA) nederbörd. Metoden NaPTA nederbörd, först beskrevs av Safar o.a. 43, används för att koncentrera PrPSc i proverna. Inkubering av NaPTA med provet resulterar i förmånliga utfällning av PrPSc i stället för PrPC. Den molekylära mekanismen är dock fortfarande oklart. Detta steg också hjälpt innehållande och förhindra spontan konvertering av rPrP, som kan observeras i vissa fall. Slutligen, extrakt av avföring testades av optimerad RT-QuIC använder mus rPrP (aa 23-231) som substrat och inklusive substrat ersättare i protokollet att förbättra känsligheten för upptäckt.

Resultatet här Visa att denna förbättrade metod kan upptäcka mycket låga koncentrationer av CWD prioner och ökar känsligheten för upptäckt och specificitet i fecal prov jämfört med ett protokoll utan NaPTA nederbörd och substrat byte. Denna metod potentiellt kan tillämpas på andra vävnader och kroppsvätskor och kan vara till stor nytta för CWD övervakning i vilda och fångenskap hjortdjur.

Protocol

1. RT-QuIC använder fekalt Material beredning av hjortdjur avföring extrakt göra fekal Homogenatet genom att lägga 1 g av fekalt material till 10 mL av avföring extrahera buffert (20 mM natriumfosfat, pH 7.1, 130 mM NaCl, 0,05% Tween-20, 1 mM PMSF och 1 x komplett proteashämmare, EDTA-fria) att ge en slutlig koncentration på 10% (w/v). Den homogenisering buffert kan förberedas före användning och lagras vid -20 ° C. Homogenize fekal pellets (1 g) och buffert (10 m…

Representative Results

Extrakt av CWD-fekal beredd på 10% (w/v) kunde utsäde RT-QuIC reaktion, men känsligheten för upptäckt var låg 27. Använda en viss buffert för fekal homogenisering var ett viktigt steg för att undvika hög bakgrund fluorescens i RT-QuIC reaktioner samtidig användning av mus rPrP substrat snarare än rådjur rPrP som tillät för att få mer specifika resultat 27. Tillägg av NaPTA nederbörd minskad spontan konvertering av rPrP i RT…

Discussion

RT-QuIC var tidigare anställd att upptäcka CWD prioner i urin och fekal extrakt av oralt infekterade vitsvanshjort och mule deer 38. Det system som visas i detta manuskript är en anpassad metod för RT-QuIC analysen. Ytterligare steg inkorporerades i den ”klassiska” RT-QuIC assay att förbättra upptäckten och känsligheten i analysen för CWD prioner i fekalt material av smittade djur.

Den låga känsligheten för upptäckt i avföring extrakt ledde oss till f?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi är tacksamma mot Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) för att tillhandahålla utbildning och hjortdjur PrP bakteriell uttryck Plasmiden. SG stöds av programmet Kanada forskning stol. Vi erkänner att finansiering för denna forskning till SG från genomet Kanada, Alberta Prion Research Institute och Alberta jordbruk och skogsbruk genom genomet Alberta och University of Calgary till stöd för detta arbete. Vi erkänner ett forskningsanslag från Margaret Gunn Foundation för djur forskning.

Materials

Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
  2. Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
  3. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
  5. Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
  6. Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
  7. Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
  8. Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
  9. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
  10. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  11. Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
  12. Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
  13. Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
  14. Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
  15. Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
  16. Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
  17. Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
  18. Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
  19. Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
  20. Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
  21. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
  22. Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
  23. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
  26. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  27. Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
  28. Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
  29. Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  30. Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
  31. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
  32. Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
  33. Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
  34. Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
  35. Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
  36. Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
  37. Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
  38. John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
  39. Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
  40. Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
  41. Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
  42. Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
  43. Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
  44. Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  45. Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
  46. Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
  47. Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
  48. Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
  49. Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
  50. Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
  51. Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  52. McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
  53. Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).

Tags

CWD PrionsFecal MaterialReal-time Quaking-induced Conversion AssayCervidChronic Wasting DiseaseSensitive DetectionHigh ThroughputSodium Phosphotungstic Acid PrecipitationRT-QuIC AssayThioflavin T

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image