또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)의 위험 평가 정제 하 고 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 재발 예측에 대 한 중요 한 예 후 바이오 마커 이다. 이러한 포괄적인 지침과 일관 되 고 정확한 식별 및 MRD의 검출을 위한 모범 사례 권장 사항을 효과적인 AML 치료 결정에 도움이 수 있습니다.
환자는 완전 한 죄 사 함 (CR) 달성 여부를 확인 하기 위해 활용 하는 형태 론 적 검사와 급성 골수성 백혈병 (AML)에 응답 기준을 다시 설정 하 고, 최근 되었습니다 수 있습니다. 약 한 CR 성인 환자의 절반 골에 있는 잔여 AML 셀의 파생물 인 12 개월 이내 재발 됩니다. 남아 있는 백혈병 세포, 또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)로 알려진이 정량이이 relapses의 예측에 대 한 강력한 바이오 마커를 될 수 있습니다. 또한, 여러 연구의 회 고 분석 AML 환자의 골 수에서 MRD의 존재와 가난한 생존 상관을 보이고 있다. 뿐만 아니라 총 leukemic 인구, 반영 세포 면역-표현 형 (LAIP), 임상 결과와 관련 된 관련 된는 백혈병을 품고 있지만 그래서 백혈병 줄기 세포 (LSC), 둘 다 수의 미 숙 저주파 부분 모집단 cytometry MRD 또는 MRD와 같은 접근 방식을 통해 모니터링. 질병 또는 질병 관련 기능 (비정상적인 분자 마커 또는 탈 선 immunophenotypes) 기준으로 잔여 백혈병 (stem) 세포의 탐지를 가능 하 게 하는 중요 한 분석의 여부는 대폭 향상 된 MRD 평가 급성 골수성 백혈병. 그러나, 고유의 고 질병으로 AML의 복잡성을 감안할 때, 골 수를 샘플링 및 MRD 및 LSC 분석 방법 해야 될 조화를 이루고 가능 하면. 이 원고는 적절 한 골 수 aspirate 샘플링에 대 한 상세한 방법론 설명, 수송, 최적의 멀티 컬러 흐름 cytometry 평가 대 한 처리 및 게이팅 MRD LSC 치료 결정에 도움이 평가 전략 대 한 AML 환자.
급성 골수성 백혈병 (AML)은 골 수의 악성 특징 결함 비정상적인 증식 및 골수성 조상 세포의 축적으로 성숙 프로그램에 의해 정상 조, 그리고 궁극적으로 골 수 실패의 저해 . 질병은 매우 이질적인 형태, immunophenotype, 세포 유전학, 분자 착오 및 유전자 식 서명, 뿐만 아니라 치료 반응과 치료 결과1,2. 완전 한 죄 사 함 (CR), 분자, cytogenetic의 결과 의해 크게 유도 후 죄 사 함 치료 뒤 달성을 목표로 유도 화학요법을 포함 하는 현재 관리 및 immunophenotypic 연구의 구성 추가적인 화학요법 또는 헌 (수용자) 줄기 세포 이식3의 여러 코스. 높은 면제 율에도 불구 하 고 후 최대 90%, 성인 5 년 생존의 집중적인 화학요법만 약 30%-40%, 주로의 개발 때문입니다 일반적으로 화학 요법에 저항 하 고 그로 인하여 매우 취급 하기 어려운 relapses. 아이 들에 있는 결과가 낫다, 약 1/3도 재발 하는 비록. 따라서, 절박 한 재발의 조기 발견 unmet 의학 필요를 채울 것입니다 고 후 사 함 치료4가이드 수 있습니다.
잔여 질병 치료의 모든 진단 및 사후 진단 저항 메커니즘/요인; 합계를 반영 수 있습니다 후 따라서 측정 예 후 및 치료 지침에 대 한 수단이 있을 수 있습니다. Defining 잔여 질병 (최소 잔여 질병 및 지금 추천된으로 측정을 잔여 질병 또는 MRD 이전의 함) 5% 폭발 세포의 형태학 기준 보다 훨씬 가능성 위험 classification의 풍경이 변하고 있다. 현재 주로 MRD를 감지 하는 데 사용 하는 두 가지 방법 교류 cytometry-및 분자 기반, 후자는 역전사 PCR (RT-정량)5 에 의해 평가 되 고 또는, 다음 세대에 의해 조기 단계에 있지만 (NGS)를 시퀀싱. 성인 뿐만 아니라 아이 들에서 많은 연구는 이미 다양 한 MRD 접근 AML 모두 후 유도 및 통합 치료6,7, 그리고 질병 부담 (새로운 정의에 강한 전조 정보 제공 증명 우수한 형태 CR) 지금 나오고 있다8. MRD 흐름에 의해 평가 및 분자 기술 되어야, 그리고 사실 이미 되고있다, AML에 모든 임상 시험에서 표준 제안 합니다.
이 원고에서는 골 수 샘플, 골 샘플링을 포함 하 여 및 처리 절차 cytometry 앞에 MRD의 정확 하 고 재현 immunophenotypic 특성을 얻기 위해 상세한 흐름 cytometry 절차를 설명 합니다. 진단 및 속 행에서 좋은 품질의 골 샘플의 가용성은 임상 사이트 및 임상 시험이이 측정의 성공에 결정적 이다. 사실, 이러한 사전 분석 고려 사항은 중요 한 분자 (PCR 및 NGS) MRD 접근의 있습니다. MRD의 immunophenotypic 특성, aberrantly 표현된 마커 보통 골수성 및 조상 마커, 백혈병 관련 된 immunophenotype (LAIP)9를 식별 하기 위해 결합 됩니다. MRD는 치료, 내장 또는 취득 백혈병 약물 저항, pharmacodynamics 등 치료, 면역 감시 및 규정 준수의 활동에 대 한 응답에 영향을 미치는 많은 요인의 결과 측정 합니다. 따라서, MRD는 매우 강한 후 진단 전조 매개 변수 수신기 작동 특성 (ROC) 분석에 의해 결정 된 커트 오프 수준에 dichotomized 때 임상 결과와 관련 된입니다. HOVON 42a의 우리의 성인 AML 일대에 대 한 연구, 인하 수준 LAIP 긍정적인 세포/총 백혈구의 0.1%에서 설정 됩니다. 부정적인 대 긍정적인 MRD 상태를 결정 하기 위한이 기준을 사용 하 여, 환자의 그룹 식별할 수 있습니다 크게 악화 재발 발생률, 재발 및 전반적인 생존6을. 또한, 우리는 환자 결과10의 강력한 예측을 제공 하는 줄기 세포와 같은 기능 (CD34 + CD38-백혈병 줄기 세포, 또는 LSC), 미 숙, 약물 내성 백혈병 세포의 측정을 설명 합니다. 함께 LAIP 및 LSC 양식 흐름 cytometric MRD 접근 접근 한다. LAIP 접근 LSC 접근 약 80%의 환자에 적용할 수 있는 하는 동안, 환자의 약 90% 위해 적당 하다. 매개 변수 하나 또는 둘 다 함께 이상 환자의 95%를 평가할 수 있다.
마지막으로,이 게시 cytometry MRD 평가를 상세한 작업 설명이 제공 됩니다. 이것은 포함 한다: 1) 조화 및 골 샘플링 절차의 표준화, 샘플 2) 교통 지도 3) 상세한 설명 leukemic 세포 검출의 FACS 단일 셀 튜브 접근을 포함 한 여러 가지 항 체 패널을 사용 하 여 함께 LSC, 4 하)는 FACS의 표준화 된 측정, 5 기계) MRD 측정 및 6에 대 한 분석 프로그램) LSC 탐지에 대 한 분석 프로그램.
우리는 거의 그것은 최종 결과의 품질에 대 한 중요 한 문제 논의 이후 샘플 준비를 포함 하 여 프로시저의 모든 측면을 표시 하고자 합니다. 골 수 포부와 생 검 임상 절차 골 수 내 조 혈 모 세포를 평가 하는 데 사용 되는. 이러한 완전 한 혈액 검사 (CBC) 및 혈액 얼룩 수행 됩니다. 골 수 포부에 대 한 최적의 방법 정확한 진단과 후속 MRD 측정에 대 한 결정적 이다. 또한, 성공적인 골 수 aspirate LAIP 및 LSC 흐름 분석 (10 백만 이상 실행 가능한 세포)을 수행할 충분 한 세포를 포함 해야 합니다. 여기, 우리 골 수 포부를 수행 하기 위한 방법을 설명 해야 적절 한 셀 샘플링 (및 결과 제한 hemodilution에 대 한 잠재력) 필요한 정확한 진단 및 추가 연구에 대 한 지침을 제공 하 고. 이러한 사전 분석 고려 사항은 중요 한 분자 (PCR 및 NGS) MRD 접근의 있습니다. 모든 표본 immunophenotyping에 대 한 컬렉션의 24 시간 이내에 우선적으로 처리 한다. 비록 하지 추천, 골 수 및 말 초 혈액 샘플 수 여전히 처리 되며 분석 72 h 최대 주위 온도에 유지 될 때. 또한, 재료와 함께 모든 보정 나중 연구/품질 평가 등을 위한 무 균 세포의 cryopreservation 수 있도록 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.
충분 한 데이터는 사용할 수 있는 MRD 양성 가난한 생존와 관련 된 것에 대 한 증거를 보여 및 따라서 MRD 평가는 임상 결정을 만들 수 있습니다 추가 전조 정보를 제공 하 여 환자의 결과 향상 될 수 있습니다. 그러므로, MRD의 면역 phenotypic 평가 대 한 일관 되 고 통일 된 방법 궁극적으로 환자 치료를 개선 하기 위해 필수적입니다. 이것은 또한 중요 한 여러 임상 사이트에서 임상 연구를 비교할 때 고 있습니다 궁극적으로 임상에 도움이 결정 하 고 전반적인 생존을 위한 대리 임상 끝점으로 제공. 단단한 지침 서는 정확 하 고 일관 된 MRD 측정에 대 한 보증 개념 디자인의 지침을 유럽 백혈병 네트워크 (ELN)의 공동된 작업을 주도하 고 있다. 이 포괄적인 문서 출판된 늦은-2017, 되며 많은 연구 그룹 및 앞으로 이동 하는 실험실에 대 한 도구가 될 것 이다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계
MRD 분석의 중요 한, 그리고 종종 간과 측면 MRD의 정확한 결심에 샘플 품질의 영향 이다. 이 때 더 명백한 물자는 주어진이 설정에서 고려 되어야 하는 데 필요한 추가 작업 고려 글로벌 임상 실험에서 다른 기관에 이송 됩니다. 환자를 혼합의 위험을 줄이기 위해 정보 및 샘플 적절 한 관리의 적시 납품은 중요 합니다. 다시, 전송의이 단계에서 올바른 양식 또는 가져오기 요청된 분석의 명확한 지정 전자 병원 시스템에는 필요 합니다. MRD 샘플링의 치료에서 무대를 지적 또한 중요 한 임상 의사 결정 (예 후 치료의 두번째 과정)와 관련이 있을 수 있습니다 때문 이며 따라서 명확 하 게 정의 해야 합니다. 모의 데이터 (예를 들어 1 월 1 일 출생의 년 당) 사용 환자 또는 분석을 혼합의 위험을 증가 시킵니다. 법에 의해 필요한 경우 익명된 식별 방법은 사용 되어야 한다.
모든 표본 immunophenotyping에 대 한 컬렉션의 24 시간 이내에 우선적으로 처리 한다. 비록 하지 추천, 골 수 및 말 초 혈액 샘플 수 여전히 처리 되며 분석 72 h 최대 주위 온도에 유지 될 때. 또한, 재료와 함께 모든 보정 수행할 수 있는 가장 메 마른 조건 하에서 (로컬) 바이오 뱅크에 셀의 추가 cryopreservation 남아 관련: 많은 임상 연구는 더 이상 백혈병 세포를 조사 하는 추가 분석 이후 단계에서 수행을 분자, 면역 phenotypic 및 기능 기능을 존중 합니다. 그러나 biobanking의 내용은이 원고의 범위 내에서 않습니다.
진단 도구를 사용 하 여 MRD cytometry, 뿐만 아니라 MRD 평가의 품질 관리에 관한 공인된 실험실 필요한 의미 합니다. 이 특정 참조 실험실 또는 (재) 참조 팀 MRD 측정 흐름 파일을 분석 하는 샘플을 배포 해야 합니다.
이 문서는 임상 샘플-효과적인 요구 하는 특정 작업, 책임, 그리고 자주 통신 전문가의 전체 팀에에서 MRD의 결심에 골 aspirate 컬렉션에서 가장 중요 한 작업을 설명 합니다. 특성화 및 분석입니다. 각 작업 절차에 중요 한 이기 때문에, 사운드 물류 각 실험실과 특별히 훈련을 받은 작업에 대 한 충분 한 백업 인재에 프로토콜을 포함 하는 것이 좋습니다. 또한, 몇 가지 상대적으로 주관적인 단계 절차 (특히 LAIP 및 LSC 탈 마커 식별)의 부분에서, 이후 그것은 최종 결과 대 한 토론 팀, 여 고의 팀에 의해 허가 하는 최종 보고서에 필수적 감독자입니다. 현재 노력 (LAIP 및 LSC) MRD 분석 표준화 하는 것을 도울 것 이다 컴퓨터 소프트웨어 개발을 추구 하 고는.
수정 및 문제 해결
각 실험실 MRD 측정 문서 ELN의 지침에 설명 된 대로 비교 결과 대 한 필수적입니다 마커의 표준화 된 백본 데 있지만 다른 부분 모집단을 정의 하는 데 사용할 수 있는 항 체의 그것의 자신의 세트를 가질 수 있습니다. 위의 참조. 고려 될 필요가 및 결과의 분석을 어렵게 만들 수 있는 몇 가지 문제는 선택한 마커의 불문.
기술의 한계
LAIP 및 LSC 탈 마커 식의 식별 처음 진단에서 평가 하 고 (중과 치료 후) 시간이 지남에 MRD의 표현 형의 정확한 특성화에 대 한 모니터링. 이상 환자의 95% LAIP LSC (또는 둘 다)을 통해 평가 될 수 있다, 그러나 아직도 일부 환자 없다 정의 된 LAIPs 또는 아무 CD34 + CD38-LSCs CD34 부정적인 폭발, 제시 또는 누락 된 진단 샘플을가지고. 이러한 경우에, 그것은 여전히 가치가 시도 하 고 사용 가능한 셀 수 있으며 다음 가장 신뢰할 수 있는 (주는 leukemic 세포의 가장 강한 구별)을 선택으로 광범위 한 항 체의 패널 MRD 측정 LAIP. 고려 할 궁극적으로 재발 하는 환자의 비율 완전히 진단 immunophenotype AML 질병의이 성분으로 인해 유사 하지 않습니다 어쨌든 권장 MRD에서 항 체의 광범위 한 패널을 측정. 이러한 immunophenotypic 교대 LSCs 폭발 세포 등 치료16 동안 발생을 표시 하 고 측정 가능 질병이 소위 곧 인구에 기반 할 수 있습니다. 그러나이 시간에, 그것은 되었습니다 결정 되지 여부 모든 immunophenotypic 부분 모집단 질병 재발으로 이어질 것입니다 하 고 따라서 MRD 맞춤형 치료를 보고 하지 관행에 따라 임상 시험에서이 세포. 그것은 중요 인구 변화 때문 LSC를 누락의 위험에 가장 중요 한 aberrancy 정의 마커 있는 하나의 cytometry (PE) 채널141 개의 관 접근에 의해 감소 된다.
기존의 방법에 관하여 의미
이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 하나 이상의 LAIPs, 치료 하는 동안 뒤에 셀의 정의에 의존 합니다. 이 방법의 단점은 최근에 보였다 LAIP 치료 동안 변경 될 수 있습니다. 이런식으로 다른 탈 선 마커 일부 곧 인구를 놓칠 수 있습니다. 이 회피, 진단에만 그 대신 모든 탈 마커 측정 하 기쁠 것 이다. 다음 여러 실험실17에서 사용 되는 “정상에서 다른” 접근 방식에 비슷한 것입니다.
미래의 응용 프로그램
최근, MRD는 새로운 임상 시험 디자인에 대 한 여분의 관심을 받고 있다. 전문된 치료 옵션 및 대상된 약물 치료의 시대에서 결과 조치로 MRD 사용 하 여 궁극적으로의 빠른 소개는 급히 치료 필요 수 있도록 새로운 치료의 임상 효능을 설정 하는 데 필요한 시간이 줄어듭니다. 병원에 옵션입니다. 적절 한 물류의 중요성 및 조화 MRD 평가의 실제적인 실행은 FDA MRD를 사용 하 여 전반적인 생존 대신 대리 끝점으로의 타당성을 조사 하 고 현재로 미래 급성 골수성 백혈병 치료 성공에 중요 한 18를 측정합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 VONK 네덜란드 암 협회 (알프 2013-6371)와 Egbers 기초에 의해 지원 되었습니다. 우리는 네덜란드 AML MRD 작업 그룹 공동 작업에 대 한 및 지속적인 개선 및 AML MRD의 표준화에 대 한 유익한 토론 감사합니다.
BD Biosciences | 120995496,060996589 and 013729 | FACS Canto II | |
BD Biosciences | 555360 | CD7 FITC | |
DAKO | F076701 | CD2 FITC | |
Sanquin | M1613 | CD36 FITC | |
BD Biosciences | 332778 | CD15 FITC | |
BD Biosciences | 335039 | CD45RA FITC | |
BD Biosciences | 345810 | CD56 PE | |
BD Biosciences | 337899 | CD22 PE | |
BD Biosciences | 345785 | CD14 PE | |
Miltenyi Biotec | 130-080-801 | CD133 PE | |
BD Biosciences | 562566 | Clec12a PE | |
BD Biosciences | 565568 | Tim-3 PE | |
BD Biosciences | 332774 | CD7 PE | |
BD Biosciences | 333142 | CD11b PE | |
BD Biosciences | 337899 | CD22 PE | |
BD Biosciences | 345810 | CD56 PE | |
BD Biosciences | 347222 | CD34 PERCP-CY5.5 | |
BD Biosciences | 558714 | CD123 PERCP-CY5.5 | |
Beckman Coulter | B49221 | CD117 PE-CY7 | |
BD Biosciences | 562854 | CD33 BV421 | |
BD Biosciences | 345791 | CD19 APC | |
BD Biosciences | 333143 | CD11b APC | |
BD Biosciences | 345800 | CD33 APC | |
BD Biosciences | 345807 | CD38 APC | |
BD Biosciences | 641411 | HLA-DR APC-H7 | |
BD Biosciences | 560532 | CD44 APC-H7 | |
BD Biosciences | 562596 | CD13 BV421 | |
BD Biosciences | 348811 | CD34 PE-CY7 | |
Beckman Coulter | A96416 | CD45 Krome Orange | |
BD Biosciences | 655873 | CD45 HV500c | |
BD Biosciences | 655051 | CST beads | |
BD Biosciences | 555899 | Pharm lysing solution | |
BD Biosciences | 644204 | Multicolor CompBeads | |
BD Biosciences | 655051 | CST beads | |
BD Biosciences | FACSDiva software | ||
Cytognos | Infinicyt | ||
Spherotech | Euroflow RCP-30-5a | ||
Sigma-Aldrich | Tuerk solution | ||
Spherotech | BCP-100-5 | Blank Calibration Particles Beads | |
HSA | |||
Azide | |||
ddH2O |