Detektering av minimal eller mätbara kvarvarande sjukdom (MRD) är en viktig prognostisk biomarkörer för raffinering riskbedömning och förutsäga återfall i akut myeloisk leukemi (AML). Dessa omfattande riktlinjer och rekommendationer med bästa praxis för konsekventa och korrekta identifiering och detektering av MRD, kan hjälpa att göra effektiva AML behandlingsbeslut.
Kriterier för respons i akut myeloisk leukemi (AML) har nyligen återinförts, med morphologic undersökning används för att avgöra huruvida patienter som uppnått komplett remission (CR). Cirka återfaller hälften av de vuxna patienter som angett CR inom 12 månader på grund av utväxten av kvarvarande AML celler i benmärgen. Kvantitering av dessa återstående leukemiceller, som kallas minimal eller mätbara kvarvarande sjukdom (MRD), kan vara en robust biomarkör för förutsägelse av dessa skov. Retrospektiv analys av flera studier har dessutom visat att förekomsten av MRD i benmärgen av AML patienter korrelerar med dålig överlevnad. Inte bara är leukemiska totalbefolkningen, återspeglas av celler hysa en leukemi associerade immun-fenotyp (LAIP), associerade med kliniska resultat, men så är den omogna lågfrekventa subpopulationen av leukemi stamceller (LSC), vilka båda kan vara övervakas genom flödescytometri MRD eller MRD-liknande metoder. Tillgången till känsliga analyser som möjliggör detektering av kvarvarande leukemiceller (stem) på grundval av sjukdomsspecifika eller sjukdomsassocierade funktioner (onormal molekylära markörer eller avvikande immunophenotypes) har drastiskt förbättrat MRD bedömning i AML. Men bör med tanke på den inneboende heterogenitet och komplexiteten av AML som en sjukdom, metoder för provtagning av benmärg och utföra MRD och LSC analys harmoniseras när det är möjligt. I detta manuskript vi beskriva en detaljerad metod för adekvat benmärgsaspirat provtagning, transport, prova behandling för optimal flerfärgade flöde flödescytometri bedömning och gating strategier för att bedöma MRD och LSC i stöd i terapeutiska beslutsfattandet hos patienter med AML.
Akut myeloisk leukemi (AML) är en malignitet i benmärgen kännetecknas av defekter i programmet mognad, med onormal spridning och ackumulering av myeloida stamceller, hämning av normal blodbildning, och slutligen benmärgssvikt . Sjukdomen är ytterst heterogen avseende morfologi, immunophenotype, cytogenetik, molekylär avvikelser och gen uttryck signaturer samt behandlingssvar och behandling resultatet1,2. Nuvarande hantering omfattar induktionskemoterapi i syfte att uppnå komplett remission (CR), följt av efter eftergift behandling, som till stor del styrs av resultaten av molekylära, cytogenetiska och immunophenotypic studier och består av antingen flera kurser med ytterligare kemoterapi eller (autologa eller allogena) stamceller transplantation3. Trots hög remission priser efter intensiv kemoterapi av upp till 90%, 5-års överlevnad hos vuxna är endast ca 30-40%, huvudsakligen på grund av utvecklingen av skov som är vanligen resistenta mot kemoterapi och därmed mycket svåra att behandla. Resultatet hos barn är bättre, även om ungefär en tredjedel också återfall. Därför tidig upptäckt av nära förestående återfall kommer att fylla ett ouppfyllt medicinskt behov och kan vägleda efter remission therapy4.
Kvarvarande sjukdom efter behandling kan återspegla summan av alla diagnos och efter diagnos motstånd mekanismer/faktorer. därav kan dess mätning vara prognostiska och instrumentellt för att styra behandlingen. Möjligheten att definiera kvarvarande sjukdom (tidigare kallat minimal residual sjukdom och nu avses som mätbara kvarvarande sjukdom eller MRD) långt under 5% blast celler morfologiska kriteriet är föränderliga landskapet av risk classification. För närvarande är de två metoder som oftast används för att upptäcka MRD flöde flödescytometri- och molekylär-baserade, den senare att utvärderas av omvänt transkriptas PCR (RT-qPCR)5 eller, även om i ett tidigt skede av nästa generation sequencing (NGS). Många studier på vuxna såväl som barn visat redan att olika MRD metoder ge stark prognostisk information i AML både efter induktions- och konsolideringsbehandling terapi6,7, och en ny definition av sjukdom börda ( överlägsen till morfologiska CR) framstår nu8. Detta tyder på att MRD bedömas av flödet och/eller molekylära tekniker bör bli, och i själva verket redan blir, standard i varje klinisk prövning i AML.
Detta manuskript diskuterar detaljerad flödesdata flödescytometri förfarandet för att få en exakt och reproducerbar immunophenotypic karakterisering av MRD i benmärgen prover, inklusive benmärg provtagning och bearbetningsmetoder som föregår flödescytometri. Tillgängligheten av bra kvalitet benmärgen prover vid diagnos och uppföljning är avgörande för framgången för denna mätning över kliniska platser och kliniska prövningar. I själva verket är dessa pre analytiska överväganden också av avgörande betydelse för molekylär (PCR- och NGS) MRD metoder. För immunophenotypic karakterisering av MRD kombineras aberrantly uttryckta markörer med normal myeloisk och stamceller markörer, identifiera en leukemi-associerade immunophenotype (LAIP)9. MRD mäter resultanten av många faktorer som påverkar behandlingssvaret, som inneboende eller förvärvade leukemi läkemedelsresistens, farmakodynamik och kinetik av terapi, immun övervakning och efterlevnad. MRD är därför en mycket stark efter diagnos prognostiska parametern är associerad med kliniska utfallet när dichotomized på en cut-off nivå bestäms av mottagaren-drift kännetecken (ROC) analys. För våra vuxna AML kohort av HOVON 42a studie, cut-off nivån ligger på 0,1% av LAIP positiva celler/total vita blodkroppar. Använder detta kriterium för att fastställa negativa vs positiv MRD status, kan en grupp av patienter identifieras som har en betydligt sämre återfall incidens, skovfria och total överlevnad6. Dessutom beskriver vi mätning av omogna, resistenta leukemiceller med stamceller-liknande funktioner (CD34 + CD38-leukemi stamceller eller LSC), som erbjuder en stark prediktor för patientens resultatet10. Tillsammans LAIP och LSC närmar sig form metoden flöde flödescytometrisk MRD. Metoden LAIP är lämplig för ungefär 90% av patienterna, medan de LSC kan tillämpas i cirka 80% av patienterna. Grupp över 95% av patienterna kan utvärderas för antingen en parameter eller båda.
Slutligen, denna publikation beskriver detaljerade operativa för att bedöma MRD av flödescytometri. Detta omfattar: (1) harmonisering och standardisering av förfaranden för provtagning av benmärg, 2) prov transport vägledning 3) detaljerad beskrivning av leukemic cell detektion med FACS använder flera antikropp paneler inklusive enda cell tube strategier att karakterisera Lexmark Utskriftsassistent, 4) uppbyggnaden av FACS maskiner för standardiserade mätningar, 5) analytiska program för MRD mätningar och 6) analytiska program för LSC upptäckt.
Vi strävar efter att visa alla aspekter av förfarandet även provberedningen eftersom det är sällan diskuteras även om det är en viktig fråga för kvaliteten på det slutliga resultatet. Benmärg aspiration och biopsi är kliniska rutiner används för att utvärdera de hematopoetiska cellerna i benmärgen. Dessa utförs tillsammans med en fullständig blodstatus (CBC) och blod smeta. Den optimala metoden för benmärg aspiration är avgörande för korrekt diagnos och uppföljning för MRD mätning. Dessutom bör en framgångsrik benmärgsaspirat innehålla tillräckligt med celler för att utföra den LAIP och LSC Flödesanalys (minst 10 miljoner viabla celler). Här beskriver vi metoden för att utföra en benmärg aspiration och ge riktlinjer som bör leda till adekvat cell provtagning (och begränsa risken för hemodilution) behövs för korrekt diagnostik och ytterligare forskning. Dessa pre analytiska överväganden är även av avgörande betydelse för molekylär (PCR- och NGS) MRD metoder. Alla prover för immunophenotyping bör behandlas företrädesvis inom 24 h av samling. Även om det inte rekommenderas, kan fortfarande benmärg och perifert blodprover bearbetas och analyseras när förvaras upp till 72 h vid omgivande temperatur. Dessutom bör alla hanteringar med materialet utföras under sterila förhållanden och för att möjliggöra Frysförvaring av sterila celler för senare forskning/kvalitetsbedömning etc.
Gott om data är tillgängliga som visar bevis för MRD positivitet att förknippas med dålig överlevnad och därför MRD bedömning kan förbättra patientens resultat genom att tillhandahålla ytterligare prognostisk information som kliniska beslut kan göras. En enhetlig och harmoniserad metod för immuno-fenotypisk bedömning av MRD är därför nödvändigt att i slutändan förbättra patientens behandling. Detta är också viktigt när man jämför kliniska studier på olika kliniska webbplatser, och kan slutligen hjälp i kliniska beslut att göra och tjänstgör som ett surrogat kliniskt effektmått för total överlevnad. Uppfattningen att fasta riktlinjer är garanterade för exakt och konsekvent MRD mätningar har lett till en samordnad åtgärd av Europeiska leukemi nätverk (ELN) design toppmoderna riktlinjer. Detta omfattande dokument blir publicerade sent-2017 och kommer att vara avgörande för många studiecirklar och laboratorier framåt.
Kritiska steg i protokollet
En viktig, och ofta förbisedd aspekt av MRD analys är effekterna av provets kvalitet på noggrann bestämning av MRD. Detta är mer uppenbart när materialet har transporteras till andra institut i globala kliniska prövningar ges ytterligare operativa överväganden som behöver beaktas i denna miljö. För att minska risken för att blanda upp patienten är information och snabb leverans av prover lämpliga administrationen avgörande. Igen, i detta skede av transporten den korrekta former och/eller import till elektroniska sjukhus system med tydliga uppdrag av den önskade analysen krävs. Att notera scenen vid terapi av MRD provtagning är också avgörande, eftersom det kan vara relevant för kliniska beslutsfattandet (till exempel efter fortsättningskurs terapi) och bör därför definieras tydligt. Användning av mock data (såsom till exempel 1 januari per Födelseår) ökar risken för sammanblandning av patienter eller analyser. Om lagen, ska ett alternativt anonymiserat sätt för identifiering användas.
Alla prover för immunophenotyping bör behandlas företrädesvis inom 24 h av samling. Även om det inte rekommenderas, kan fortfarande benmärg och perifert blodprover bearbetas och analyseras när förvaras upp till 72 h vid omgivande temperatur. Dessutom alla hanteringar med materialet kan bäst utföras under sterila förhållanden och så vidare Frysförvaring av celler i (lokala) biobanker förblir relevanta: många kliniska studier har ytterligare analyser att ytterligare utreda leukemiceller med avseende på molekylär, immuno-fenotypisk och funktionella funktioner ska utföras i ett senare skede. Detaljer för biobanker är emellertid inte omfattas av detta manuskript.
Använda MRD som ett diagnostiskt verktyg innebär att den behöver ett ackrediterat laboratorium, inte bara för flödescytometri, men också angående kvalitetskontroll av MRD bedömning. Detta kan kräva distribuerar prover till specifika referenslaboratorier eller (åter) analysera flödet filer med MRD mätningarna av referens lag.
Den här artikeln beskrivs de viktigaste åtgärderna från benmärgen aspirera samling till bestämning av MRD i kliniska prover – som kräver ett helt team av experter med specifika uppgifter, ansvar, och med täta kommunikation för effektiv karakterisering och analys. Eftersom varje aktivitet är avgörande för förfarandet, rekommenderas att ha ljud logistik inklusive protokoll vid varje laboratorium och tillräckligt säkerhetskopiera med personal som har utbildats speciellt för uppgiften. Dessutom, eftersom det finns några relativt subjektiva steg i en del av förfaranden (särskilt LAIP och LSC avvikande markör identifiering), är det viktigt att ha diskussioner om slutresultatet av team, och har slutrapporten godkänts av ett team av handledare. Aktuella insatser bedriver Datorprogramvarautveckling som hjälper dig att standardisera (LAIP och LSC) MRD analys.
Ändring och felsökning
Varje labb kan ha sin egen uppsättning av antikroppar som kan användas för att definiera de olika subpopulationsna även om ha en standardiserad ryggrad av markörer är nödvändigt för jämförbara resultat, som beskrivs i ELN toppmoderna riktlinjerna för MRD mätningar dokument som beskrivs ovan. Oberoende av valda markörer finns det vissa frågor som kan försvåra analysen av resultaten och behöver beaktas.
Begränsningar av tekniken
Identifiering av LAIP och LSC avvikande markör uttryck är först bedömas vid diagnos och övervakas över tiden (under och efter behandling) för korrekt karakterisering av MRD fenotypen. Medan över 95% av patienterna kan utvärderas via LAIP eller LSC (eller båda), fortfarande vissa patienter har inga definierade LAIPs eller ingen CD34 + CD38-LSCs presentera med CD34 negativa Blaster eller ha ett saknas diagnos prov. I dessa fall är det fortfarande värt att prova och mäta MRD med en panel av antikroppar så bred som antalet tillgängliga celler tillåter och välj sedan den mest tillförlitliga (ger den starkaste skillnaden av leukemiska celler) LAIP. Med tanke på att en andel patienter som i slutändan återfall inte helt liknar diagnos immunophenotype, på grund av heterogenitet AML sjukdom, mäta en bred panel av antikroppar på MRD rekommenderas ändå. Dessa immunophenotypic förändringar inkluderar blast celler och LSCs och har visat sig inträffa under terapi16 och mätbara sjukdomen kan baseras på dessa så kallade kommande populationer. Vid denna tid men har det inte fastställts om alla immunophenotypic delpopulationer kommer att leda till återfall, och är därför inte vanligt att rapportera MRD skräddarsydda-terapi baserad på dessa celler i kliniska prövningar. Det är viktigt att notera att risken för saknas LSC på grund av befolkningen skiftar minskas med metoden en tub där de viktigaste aberrancy definiera markörerna är i en flödescytometri (PE) kanal14.
Betydelse med avseende på befintliga metoder
Den metod som beskrivs i detta protokoll är beroende av definitionen av en eller flera LAIPs, vilka celler följs under behandling. En nackdel med denna metod är att det har nyligen visat att LAIP kan förändras under behandlingen. Detta sätt vissa kommande populationer med olika avvikande markörer kan missas. För att kringgå detta, skulle det vara bäst att mäta alla avvikande markörer i stället för endast de som finns vid diagnos. Detta skulle då vara liknande den ”skiljer sig från normal” strategi som används av flera laboratorier17.
Framtida tillämpningar
Nyligen, MRD har fått extra uppmärksamhet för romanen klinisk rättegång design. I en tid präglad av specialiserade behandlingsalternativ och riktade läkemedelsbehandling, användning av MRD som ett resultat kommer att minska den tid som behövs för att fastställa kliniska effekten av nya behandlingar, slutligen möjliggör snabbare införande av brådskande terapeutiska alternativ till kliniken. Betydelsen av lämplig logistik och praktiska utförandet av en harmoniserad MRD bedömning är avgörande för framtida AML behandlingframgång som FDA undersöker för närvarande möjligheten att använda MRD som surrogat effektmått i stället för total överlevnad mäter18.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning har stötts av holländska Cancer Society (ALPE 2013-6371) och Egbers stiftelse för VONK. Vi tackar arbetsgruppen holländska AML-MRD för samarbetet och givande diskussioner för kontinuerlig förbättring och standardiseringen av AML-MRD.
BD Biosciences | 120995496,060996589 and 013729 | FACS Canto II | |
BD Biosciences | 555360 | CD7 FITC | |
DAKO | F076701 | CD2 FITC | |
Sanquin | M1613 | CD36 FITC | |
BD Biosciences | 332778 | CD15 FITC | |
BD Biosciences | 335039 | CD45RA FITC | |
BD Biosciences | 345810 | CD56 PE | |
BD Biosciences | 337899 | CD22 PE | |
BD Biosciences | 345785 | CD14 PE | |
Miltenyi Biotec | 130-080-801 | CD133 PE | |
BD Biosciences | 562566 | Clec12a PE | |
BD Biosciences | 565568 | Tim-3 PE | |
BD Biosciences | 332774 | CD7 PE | |
BD Biosciences | 333142 | CD11b PE | |
BD Biosciences | 337899 | CD22 PE | |
BD Biosciences | 345810 | CD56 PE | |
BD Biosciences | 347222 | CD34 PERCP-CY5.5 | |
BD Biosciences | 558714 | CD123 PERCP-CY5.5 | |
Beckman Coulter | B49221 | CD117 PE-CY7 | |
BD Biosciences | 562854 | CD33 BV421 | |
BD Biosciences | 345791 | CD19 APC | |
BD Biosciences | 333143 | CD11b APC | |
BD Biosciences | 345800 | CD33 APC | |
BD Biosciences | 345807 | CD38 APC | |
BD Biosciences | 641411 | HLA-DR APC-H7 | |
BD Biosciences | 560532 | CD44 APC-H7 | |
BD Biosciences | 562596 | CD13 BV421 | |
BD Biosciences | 348811 | CD34 PE-CY7 | |
Beckman Coulter | A96416 | CD45 Krome Orange | |
BD Biosciences | 655873 | CD45 HV500c | |
BD Biosciences | 655051 | CST beads | |
BD Biosciences | 555899 | Pharm lysing solution | |
BD Biosciences | 644204 | Multicolor CompBeads | |
BD Biosciences | 655051 | CST beads | |
BD Biosciences | FACSDiva software | ||
Cytognos | Infinicyt | ||
Spherotech | Euroflow RCP-30-5a | ||
Sigma-Aldrich | Tuerk solution | ||
Spherotech | BCP-100-5 | Blank Calibration Particles Beads | |
HSA | |||
Azide | |||
ddH2O |