Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/56391
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

Fare embriyonik kök hücre kültürü çalışmalarının iki kimyasal tabanlı protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yeni yöntem Tet-aracılı oksidasyon (vitamin C) teşvik ve DNA hypomethylation ve fare embriyonik kök hücreler pluripotent korumak için 5-metilsitozin (PD0325901 tarafından) de novo sentezi bastırmak sinerjik mekanizmaları kullanır.

Abstract

Embriyonik kök (ES) hücre katmanlardan herhangi birini üç germ (endoderm, mesoderm veya ektoderm) ayırt etmek için potansiyel var ve rejeneratif tıp için birçok soy oluşturabilir. ES hücre kültür vitro uzun yaygın kaygıları konu olmuştur. Klasik, fare ES hücreleri serum ve lösemi inhibitör faktörü (LIF) korunur-orta içeren. Ancak, serum/LIF koşullarda hücreleri heterojen Morfoloji ve pluripotency ilgili genlerin ifade profil göster ve çoğunlukla bir metastable durumdadır. Ayrıca, kültürlü ES hücreleri küresel hipermetilasyon sergi, ama saf ES hücrelerinin iç hücre kütlesi (ICM) ve primordial germ hücreleri (PGCs) bir küresel hypomethylation durumdadır. ICM ve PGCs hypomethylated devlet onların pluripotency ile yakından ilişkilidir. Fare ES hücre kültür yöntemleri geliştirmek için biz son zamanlarda iki küçük molekül bileşikler DNA hypomethylated ve pluripotent durumunu korumak için seçmeli olarak kombine kullanımı dayalı yeni bir yöntem geliştirdi. Burada, biz bu vitamin C (Vc) eş tedavisi mevcut ve PD0325901 5-metilsitozin (5mC) yaklaşık yüzde 90'ını fare ES hücrelerde 5 gün silebilirsiniz. Oluşturulan 5mC içerik PGCs içinde için karşılaştırılabilir olduğunu. Mekanik soruşturma PD0325901 up-Prdm14 ifade Dnmt3b bastırmak için düzenleyen olduğunu gösterir (de novo DNA metiltransferaz) ve Dnmt3l (Dnmt3b kofaktör), de novo 5mC sentezini azaltarak. VC pasif ve aktif DNA demethylations tutulumu gösteren 5-Tet1 ve Tet2, esas katalize arasında bakterilerde görülen (5hmC) 5mC dönüşümünü kolaylaştırır. Ayrıca, Vc/PD0325901 koşullar altında fare ES hücreleri homojen Morfoloji ve pluripotent durumu gösterir. Topluca, biz bir roman ve DNA hypomethylation ve pluripotency fare ES hücrelerdeki bakım ulaşmak için kimyasal-synergy kültür yöntemi öneriyoruz. Küçük molekül kimyasal bağımlı yöntem serum kültür ve daha fazla klinik uygulamaları ve araştırmalar için homojen ES hücreler üretmek için tutar söz önemli eksiklikleri üstesinden gelir.

Introduction

ES hücreler blastosist1ICM kökenli. Hücreler pluripotent durumdadır ve tüm somatik soy ve germline hücreleri2oluşabilir. Kuruluş ES Hücre geliştirme araştırmak için fırsat vitro işler ve hücreler için onların pluripotency3dayalı rejeneratif tıp tıbbi konu ile ilgili-ebilmek oluşturmak sağlar.

İki grup seminally fare ES hücre hatları 1981 yılında kurulan ve ne zaman erken fare embriyo elde edilen hücreleri (FBS) fetal Sığır serum kültürlü-orta fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) ile besleyici katman1,4 içeren . MEFs mitotically inaktive ve yemekleri ES Hücre kültürü çalışmalarının önce önceden yetiştirilmiştir. MEFs fare ES Hücre eki için destek sağlar ve yayma teşvik ve farklılaşma5, FBS temel trofik faktörler ve hormonlar hücre çoğalması için sunarken bastırmak için büyüme faktörleri üretmek. Sonraki çalışmalar besleyici hücreler tarafından üretilen LIF kendini yenileme ve fare ES hücrelerdeki pluripotency için anahtar sitokin yapıldı ve LIF yanı sıra Orta içine için besleyici hücreler6yerine olabilir göstermiştir. Şu anda, fare ES hücrelerde besleyiciler FBS/LIF ortamda sustainment hala pek çok araştırmacı tarafından kabul edilen standart yöntemdir. Ancak, bazı sorunlar ile bu klasik kültür yaklaşım ortaya. İlk olarak, besleyici hücreler aşırı ve kontrolsüz faktör salgılar ve patojen bulaşma7neden olabilir. Yemekleri jelatin ile yüzeyi ve LIF eklenmesi serum içeren kaplama bu girişimi engellemek için orta besleyici katmanlı hücre olmadan fare ES hücreleri korumak için alternatif yöntemler vardır. Ayrıca, fare ES hücreleri serum/LIF koşullar altında yetiştirilen morfolojik heterojenite hücre popülasyonlarının ve hatta pluripotency ile ilgili faktörler8ifade düzeyini sergi. Son yıllarda yapılan çalışmalarda serum/LIF koşullar altında LIF ve WNT sinyal aracılığıyla pluripotency (SOX2, MicroRNAs ve OCT4 dahil) pluripotency ilgili çekirdek transkripsiyon faktörleri ayakta olabilir öneririz; Ancak, özellikle, onlar da farklılaşma8tetiklemek için fibroblast büyüme faktörü (FGF) sinyal etkinleştirin. Çekirdek transkripsiyon faktörleri kararsız çift eylem nedeniyle, fare ES hücre içinde serum kültürlü ICM ve astarlanmalıdır epiblast devlet8benzeyen başka bir benzer bir iki değiştirilebilir nüfus oluşan heterojen, mevcut. Ayrıca, ICM ve PGCs onların pluripotency9,10ile yakından bağlantılı bir küresel hypomethylated durumda ise serum hücrelerde fare ES kez küresel hipermetilasyon9, sergi.

Fare ES Hücre kültürü çalışmalarının için yeni yöntemler geliştirmek için önemli bir talep var. Birkaç gelişmiş protokol 200311 ' den beri kurduk ama orada bazı sınırlamalar ve eksiklikleri7olmaya devam ediyor. 2008, iki küçük molekülü kinaz inhibitörleri, PD0325901 kombine kullanımı (inhibitörü olan mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) / hücre dışı sinyal düzenlenir kinaz (ERK) (MEK)) ve CHIR99021 (inhibitörü olan glikojen sentaz kinaz 3 (GSK3)), N2B27 ' Orta LIF ve serum olmadan kodlamayla fare ES12hücreleri için yeni perspektifler açtı. Bu yeni tanımlanmış orta iki inhibitörleri (2i) kullanımı ile karakterizedir. 2i/LIF ortamda kültürlü fare ES Hücre popülasyonlarının ve pluripotency faktörler ifade daha homojen hücrelerdir. Buna ek olarak, 2i/LIF-kültürlü fare ES hücre DNA hypomethylation genel olarak ICM benzeri hücreler9,13için daha yakın olan sergi. Öyle olsa bile, 2i kültür kendi dezavantajları vardır. PD0325901 ve CHIR99021 suda çözünmez ve genellikle dimetil sülfoksit (DMSO) çözülür-kültür ortamında eklemek için hisse senedi çözüm tabanlı. Çalışmalar bu uzun vadeli gösterdi ve hücre düşük doz maruz DMSO sitotoksisite14' e neden olabilir.

Burada, iki küçük molekül bileşikler kullanılan ve fare ES Hücre yeni bir kültür yöntemi geliştirdi. Roman kültür yöntemi DNA hypomethylation hızla tanıtmak için Vc ve MEK inhibitörü PD0325901 birleştirir ve etkili bir şekilde PGC karşılaştırılabilir düzeyde için Vc/PD0325901 kodlamayla protokolü olarak adlandırılmış. Vc/PD0325901-eklendi serum içeren orta fare ES hücrelerde homojenliği morfoloji içinde sergilemek ve bir yere durumda sürekli. 2i kültür için karşılaştırıldığında, Vc/PD0325901 koşullar altında kültürlü fare ES hücre DNA demethylation daha hızlı kinetik sergi ve hypomethylation düzeyi PGC karşılaştırılabilir ulaşabilirsiniz. Buna ek olarak, tek inhibitörü (PD0325901) kullanımı giriş DMSO ile karşılaştırıldığında 2i içinde kullanılan orta içine azaltır (PD0325901/CHIR99021) ve hücrelere zarar azaltır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlıkları

  1. Bir çözüm (MEK inhibitörü) 1.0 mm PD0325901 ve 3.0 mM CHIR99021 (GSK3 inhibitörü).
    1. PD0325901 2 mg tartmak ve bir kehribar cam şişede DMSO 4,15 mL ekleyin.
    2. CHIR99021 2 mg tartmak ve bir kehribar cam şişede DMSO 1,43 mL ekleyin.
    3. Aşağıdaki sulandırma, aliquots (50 µL/tüpte 200 µL PCR tüpleri)-20 ° C'de depolayın ve ışıktan korunan. Bir tüp dondurucu ve tezcan, oda sıcaklığında kullanmadan önce dondurulmuş stoktan içeren kaldırın.
  2. Vc 0.0176 g bir santrifüj tüpü 1 mL içine tartmak ve 1 mL 100 mM kullanmadan önce son bir konsantrasyon için steril su ile yeniden oluşturma.
  3. FBS devre dışı bırakabilirsiniz: FBS 500 mL 30 dk 56 ° C'de bir su banyosunda kuluçkaya.
  4. 600 mL temel orta fare ES Hücre kültürü çalışmalarının için hazırlayın.
    1. 40 mL kaldırmak ve bir şişe DMEM/yüksek glikoz Orta (500 mL) kullanın.
    2. FBS (120 mL), 1000 U/mL LIF (107 U/mL stok çözüm 60 µL), 0,1 mM non-gerekli amino asitler (NEAA) (6 mL 10 mM stok çözeltisi), 1 mM sodyum pyruvate (6 mL 100 mM stok çözeltisi) ek 460 mL DMEM/yüksek glikoz orta % 20 ile inaktive , 2 mM L-glutamin (6 mL 200 mM stok çözeltisi), 0,1 mM β-mercaptoethanol (100 mM hisse senedi çözüm 600 µL) ve 33 IU/mL penisilin ve 33 µg/mL streptomisin (penisilin-streptomisin çözüm (10.000 IU/mL penisilin ve 10.000 µg/mL streptomisin) karışık 2 mL) . Temel orta serum aracı olarak tanımlayın.
    3. PD0325901 hisse senedi çözüm 50 µL pipet (1.0 mM) ve Vc (100 mM), sırasıyla, 50 mL serum orta içine (son konsantrasyonu: 1.0 µM PD0325901 ve 100 µM Vc) ve orta Vc/PD0325901 aracı olarak tanımlayın.
      Not: Vc/PD0325901 orta boy taze Vc istikrarsızlık nedeniyle kullanımdan önce hazırlayın.
    4. Bir pipet kullanarak transfer PD0325901 hisse senedi çözüm 50 µL (1.0 mM) ve CHIR99021 (3.0 mM), sırasıyla, 50 mL serum orta içine (son konsantrasyonu: PD0325901 1.0 µM ve CHIR99021 3.0 µM) ve orta 2i aracı olarak tanımlayın.
  5. Jelatin kaplı yemekleri hazırlamak.
    1. %0,1 jelatin çözeltisi hazırlamak: 300 mL Cam reaktif şişe bir kap ile Ultrasaf Su içine jelatin 0.3 g dağıtılması ve 121 ° C'de bir Otoklav içinde oda sıcaklığında steril çözüm için 20 dk. mağaza sterilize.
    2. Hücre kültür yemekleri (6 cm çapında) ile 2 mL % 0,1 jelatin çözeltisi 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya ve jelatin Aspire edin. Bulaşıkları hava kuru ve onları içinde 12 h kullanın.
  6. 15 mL santrifüj tüpü ortamda buz gibi fare ES Hücre 10 mL hazırlamak: % 90 FBS (9 mL) ve % 10 DMSO (1 mL). Orta 1 gün içinde kullanın.
  7. Dondurucu bir kapsayıcı hazırlamak: % 100 izopropil alkol dondurma konteyner dolgu satırına ekleyin ve eski izopropil alkol atın. Yeni izopropil alkol doğrudan beşinci her kullanımdan sonra ekleyin.
  8. Enzimatik sindirim arabellek olun: tartmak 1.2114 g Tris tozu 100 mL 100 mM Tris çözüm hazırlamak ve eklemek için Ultrasaf Su içine konsantre HCl çözüm (yaklaşık 12 M) Tris çözüm pH 7,6 (yaklaşık 0.6 mL konsantre HCl çözeltisi) için ayarlamak için.
  9. Radyo immunoprecipitation tahlil arabelleği (RIPA arabellek) 50 mL hazırlamak: 20 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, % 20 gliserol, %0,5 NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. 1 mM ile DTT, proteaz inhibitörü kokteyl X 1 ve 1 mM PMSF kullanmadan önce ek. PMSF eklendikten sonra 30 dk içinde arabellek kullanın.

2. fare ES hücrelerin jelatin kaplı yemekleri büyümesine

  1. Orta, tripsin ve tamponlanmış fosfat çözümde 37 ° C'de bir su banyosu (PBS) önceden sıcak fare ES hücreleri (vahşi türü, 129 SvEv) kültür
  2. Hücreleri geçiş. Ortamından tamamen çanak ve pipet PBS 2 mL hücreleri durulayın yemekleri Aspire edin.
    1. PBS bir pipet ile kaldırmak ve yeniden PBS 2 mL içeren hücreleri yıkayın.
    2. PBS kaldırmak ve tripsin-EDTA (% 0,25) 0.3 mL her yemek için ekleyin.
    3. Hızlı bir şekilde tripsin ile bütün çanak kapağı ve hemen kaldırın.
    4. Çanak çanak hücrelerden ayırmak 1 dk 37 ° C'de bir kuluçka koymak. Kuluçka makinesi yemeklerini çıkar ve sonlandırma tripsin eylemi için önceden ısıtılmış serum Orta 2 mL ekleyin.
    5. Hücre kolonilerinin bir pipet (5 mL pipet ucu) ile 10 kez resuspending tarafından bir tek hücre süspansiyon ayırmak.
  3. Hücre çözümü (bir hemasitometre ile sayma tarafından yaklaşık 190.000 hücreleri) 2 mL 150 µL yeni bir jelatin kaplı kabına aktarın ve taze yapılmış Vc/PD0325901 orta 6 cm kültür çanak başına 3 mL ile ek. 37 ° C kuluçka %5 CO2hücre kültür.
  4. Kuluçka, süre her 24 h eski kültür orta kaldırın ve taze Vc/PD0325901-orta 3 mL Vc. Expect 70-%80 confluency istikrarsızlık nedeniyle kültür çanak içine 2-3 gün sonra ekleyin.
  5. % 70-80 confluency ulaşan sonra hücreleri geçiş ve onları 2.2-2.4 adımlarda açıklandığı gibi kültür devam ediyor.

3. donma ve fare ES hücreleri tezcan

  1. Fare ES hücreleri dondur.
    1. Tripsin bulaşıkta hücrelerden takip adım 2.2 bağlantısını kesin.
    2. Hücreleri bir 15 mL plastik tüp ve 800 g ve oda sıcaklığında x 3 dk santrifüj içine aktarın.
    3. Süpernatant yavaşça bir ölçek dökümü ve hücre Pelet ile 1 mL taze dondurma orta yaptı resuspend. Dondurucu orta 30 dk önce kullanmadan önce oda sıcaklığında olduğundan emin olmak için bu adımı hazırlayın.
    4. 1 mL pipet ile 1,8 mL microcentrifuge tüp ortamına dondurma hücreleri aktarmak ve microcentrifuge tüp dondurucu bir konteyner içine yerleştirin. İzopropil alkol dondurma konteyner dolgu satırına ekleyin ve kullanmadan önce oda sıcaklığında saklayın.
    5. Dondurma kapları gece-80 ° C dondurucuya bırakın.
    6. Microcentrifuge tüpler için 2-3 yıla kadar bir sıvı azot kaba transfer.
      Not: Değil tutmak hücreleri dondurucu orta uzun bir zaman ve hızlı bir şekilde hücreleri-80 ° C dondurucu DMSO toksisite nedeniyle transfer.
  2. Fare ES hücreleri çözülme.
    1. Önceden sıcak 50 mL serum orta 37 ° C su banyosu içinde.
    2. Bir hücreyi içeren flakon sıvı azot konteyner üzerinden çıkar ve 37 ° C su banyosu kepli şişede bırakın. Hızlı bir şekilde çözülmesi su banyosu salla. Hücreleri 1 mL pipet ile 15 mL tüp içine aktarın. Önceden ısıtılmış serum kültür orta 2 mL dondurucu orta sulandırmak ve 800 x g ve oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi için tüp içine ekleyin.
    3. Süpernatant kaldır ve yavaşça hücre topakları ile 3 mL 5 mL pipet kullanarak taze Vc/PD0325901 orta resuspend.
    4. Hücreleri 15 mL tüp sizden bir jelatin kaplı yemek için aktarmak ve 24 h kültür için hücreleri tekrar 2. adımda açıklandığı gibi hücre kültür.

4. Toplam Protein hücrelerden hulâsa

  1. Kendine hakim hücre PBS 1 mL ile durulayın ve 800 x g ve oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.
  2. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet DTT, proteaz inhibitörü kokteyl ve PMSF ile hafifçe pipetting tarafından desteklenen RIPA arabelleği ile iyice resuspend. RIPA arabellek hücrenin cips yaklaşık 5 x birimdir.
    Not: cep resuspension buz yerine getirir.
  3. Hücreleri RIPA arabellek buz ve santrifüj 13.000 x g ve 4 ° C 5 min için 30 dakika tutun.
  4. Yeni bir tüp süpernatant aktarın ve aliquots-80 ° C'de depolayın
  5. Bir Bradford protein tahlil kiti ile protein konsantrasyonu belirlemek.

5. DNA hücre Özet DNA hulâsa--dan ve bir tek nükleozit enzimler kullanarak

  1. Tripsin hücrelerle 3.1.1 ve 3.1.2 adımlarda açıklandığı gibi toplamak.
  2. DNA ekstraksiyon üreticinin yönergelerini izleyerek bir genomik DNA arıtma kiti ile gerçekleştirin.
  3. Ayıklanan DNA 1 mL santrifüj tüplerde saklayın. Santrifüj tüpüne 100 µL ultrasaf su ekleyin ve yaklaşık 15 kez pipetting tarafından DNA geçiyoruz. Konsantrasyonu belirlemek ve DNA kalitesi 260 absorbans ölçümü ile değerlendirmek nm ve 280 nm15. DNA yaklaşık 500 ng/µL bölgedir.
  4. DNA'ın Özeti 5 µg 50 µL çözüm sistemi: 100 mm Tris-HCl bir çözüm, pH 7,6 5 µL ekleyin (son konsantrasyonu: 10 mM), 2 U buzağı bağırsak fosfataz, 1 U DNaz ben 0.005 U yılan zehri fosfodiesteraz ben ve DNA'ın 5 µg (uzaklık göre eklenen hacim hesaplamak Kırmızı DNA toplama, ~ 10 µL) bir santrifüj tüpü ve artış Ultrasaf Su ile 50 µL çözüm hacmi içine. 37 ° C karisimin gecede kuluçkaya. Sindirilir DNA çözüm 1000 g ve oda sıcaklığında çözüm tüpler altına toplamak 1 dk santrifüj kapasitesi.
  5. Sindirilir DNA çözüm santrifüj tüpleri ultra filtrasyon tüpler içine aktarmak (kesme bir molekül ağırlığı: 3 kDa) ve 13.000 g ve 4 ° C için sindirim enzimleri kaldırmak 30 dk santrifüj.
  6. Örnekleri 5mC ve 5hmC analiz için hazırlayın.
    1. 5hmC analiz için: damlalıklı 36 µL filtre çözüm için yeni bir santrifüj tüp (1 mL) ve bir 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine 4 µL ekleyin ([D3]-5hmC) ile 3 son konsantrasyonu nM.
    2. 5mC analiz için: 196 µL Ultrasaf Su içine yeni bir santrifüj tüpü ve damlalıklı 4 µL filtre çözüm tüp (50-fold seyreltme), genomik DNA ' 5mC yüksek yoğunluk nedeniyle ekleyin. Yeni bir santrifüj tüpü seyreltilmiş çözeltinin 36 µL nakletmek ve 4 µL eklemek (5'-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5mC) ile son konsantrasyonu 50 nM. Kullanım [D3]-5hmC ve [D3]-5mC 5hmC ve 5mC, anılan sıraya göre ayarlamak için iç standart olarak.
  7. Örnek çözüm için ölçüm tüpler aktarın ve 4 ° C'de depolayın 5mC ve 5hmC çoklu-tepki (UHPLC-MS/MS (MRM)) bir önceki rapor15' te açıklandığı gibi izleme ile ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi-triple quadrupole kütle spektrometresi ile analiz.

6. analiz 5mC ve 5hmC UHPLC-MS/MS15 kullanarak

  1. 5mC ve 5hmC analiz etmek için çeşitli parametreleri ayarlamak UHPLC-MS yazılım kullanarak.
    1. Yeni bir yöntem oluşturun. Yazılım açın ve "dosya | Yeni | Yöntem". "Geçerli yöntem için değişiklikleri kaydetmek ister" "Yöntemi Düzenleyicisi" ileti kutusu içeriği ile sergi ve "Hayır"'ı tıklatın.
    2. Örnekleyiciyi parametrelerini oluşturun. Tıklatın "örnekleyici | Kurulum | Enjeksiyon". "Standart enjeksiyon" seçin ve "enjeksiyon ses seviyesinde 5 µL" girişi.
    3. UHPLC içinde pompa parametrelerini oluşturun.
      1. Tıklayın "BinPump2 | Pompa parametreleri oluşturmak için kurulum". "Akış" "0.25 mL/dk" ve "işlem", "15 dakika" ayarlayın.
      2. "Solvent B % 5" ayarlayın ve "sınırları"Max 600 barda"basınç".
      3. Tıklayın "BinPump2 | Uçus tarifesi"isocratic 5mC analiz için elüsyon parametreleri oluşturmak için. Bir satır eklemek için "Ekle" seçeneğini tıklatın. Giriş "0.00" "Zaman" ve "5.0" "B %". Bir kez daha yeni bir satır eklemek için "Ekle" seçeneğini tıklatın. Giriş "15.00" "Zaman" ve "5.0" "B %".
      4. Tıklayın "BinPump2 | Uçus tarifesi"5hmC analiz için degrade elüsyon parametreleri oluşturmak için. "Bir satır eklemek için Append. tıklatın 0.00 zaman ve 5.0 "B %" giriş. Bir kez daha yeni bir satır eklemek için "Ekle" seçeneğini tıklatın. Giriş "3.00" "Zaman" ve "5.0" "B %". "Başka bir 6 kere 6 satır eklemek Ekle" seçeneğini tıklatın. "Zaman" ve "5.0" "B %", "3.01" "Zaman" ve "15,0", "B %", "6,00"Zaman"," ve "15,0" "B %", "6,01" "Zaman" ve "100", "B %", "10.00" "Zaman" ve "100,0", "B %", "10,01"Zaman"," ve "5.0" "B %", "15.00" sırada girdi.
        Not: 5mC ve 5hmC ayrı ayrı UHPLC farklı ayırma şartları nedeniyle analizi gerçekleştirin.
    4. UHPLC sütun kompartımanda (TCC) sıcaklığı parametrelerini oluşturun.
      Tıklatın "TCC | Kurulum | sıcaklık (solda) "ve"30 ° C"girdi.
    5. QQQ-MS/MS parametrelerini kurun.
      1. Tıklatın "MS QQQ | Durma zamanı | Hayır limit/olarak pompa"," İyon kaynağı | ESI"," zaman filtreleme | En yüksek Genişlik: 0,07 min ". Kurmak "zaman kesimleri: başlangıç saati: 0"; "Tarama türü: MRM"; "Div değeri: MS"; "Delta EMV (+): 200" ve "Delta EMV (-): 0".
      2. 5mC, D3geçişler izleme parametreleri oluşturmak-5mC, dC, 5hmC ve D3-5hmC
        1. Tıklatın "MS QQQ | Edinme | Kesimleri taramak: durmak: 90"; "Fragmentor: 90"; "Çarpışma enerji: 5"; "Hücre Hızlandırıcı voltajı: 4" ve "polarizasyon: pozitif".
        2. "5mC" "Bileşik ad?", "242" "Öncü iyon", "126" "Ürün iyon" adlı 5mC analiz için giriş. Sağ tuşuna tıklayın ve "satır ekle" seçin Yeni bir satır eklemek için. Giriş "D3-5mC", "Bileşik ad?", "Öncü iyon", D3için "Ürün iyon", "129", "245"-5mC analizi.
        3. Başka bir üç satır aynı modunu kullanarak ek. "DC" "Bileşik ad?", "228" "Öncü iyon", "112", "Ürün iyon" dC analiz için giriş. "5hmC" "Bileşik ad?", "258" "Öncü iyon", "142" "Ürün iyon" adlı 5hmC analiz için giriş. Giriş D3-adı, "261", "Öncü iyon", D3için "Ürün iyon", "145" bileşik, 5hmC-5hmC analizi.
      3. Gaz kaynak parametrelerini oluşturun. Tıklatın "MS QQQ | Kaynak | Kaynak parametreleri: gaz Temp: 300 ° C "; "Gaz akışı: 11 L/min"; "Nebulizatör: 15 psi"; "Pozitif-kılcal: 3500 V".
      4. Önerilen yöntem kaydedin. Tıklatın "MS QQQ | Araç | «««Kaydet"yöntemi olarak. "Dizin" tarafından önerilen yöntem için bir yol seçin ve "Yöntem", içeriğindeki örneğin girerek yöntemi için bir ad verin: 5mC ve 5hmC analizi.
  2. UHPLC ayırma ve mononucleosides MS/MS Analizi
    1. Mobil faz 5mC ve sitozin için hazırlamak (C) Analizi: mobil faz çözüm A ve B. çözüm A: 500 mL Ultrasaf Su 500 µL formik asit ile (son konsantrasyonu: % 0,1) ve % 100 metanol çözüm B: 500 mL. Çözüm A ve B 95:5 (v: v) 5mC ve (6.1.3.3 adımda ayarla) C elute için mobil faz olarak karıştırın. 0.25 mL/dk (6.1.3.1 adımda ayarla) akış hızını ayarlayın.
    2. Çözelti A ve B tarafından mobil faz 5hmC analiz için hazırlayın. Çözelti A olduğunu 2.0 mM NH4HCO3 sulu çözüm (pH 9.0) (500 mL), ve solvent B % 100 metanol (500 mL). En iyi duruma getirilmiş bir degrade elüsyon tarafından ayrı 5hmC: 0-3 dk, %5,0 B ve % 95 A (v: v); 3-6 dk, %15,0 B ve % 85'a; 6-10 min, %100 B; 10-15 dk, %5,0 B ve % 95'a (6.1.3.4 adımda ayarla). 0.25 mL/dk (6.1.3.1 adımda ayarla) akış hızını ayarlayın.
  3. Electrospray MS/MS elüsyon sütun çözümlemek ve (6.1.5.2.1 adımda ayarla) pozitif iyon modu evlat edinmek için MRM modu (adım 6.1.5.1 ayarlandığında) kullanmaktadır.
    1. Geçişleri izlemek: 5mC, m/z 242→126 (çarpışma enerji, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV); dC, m/z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (adım 6.1.5.2.2 kümesinde).
    2. +3,500 V (6.1.5.3 adımda ayarla) kılcal ve parça gerilimleri set verin ve 90 V (içinde 6.1.5.2.1, sırasıyla).
    3. Enjeksiyon 5 µL ayarlamak ve 3 kez (6.1.2 adımda ayarla) her örneğini analiz. 5mC ve 5hmC miktarını değerlendirmek için karşılık gelen standart eğrileri kullanır.
      1. 5mC standart eğri kurmak: 1 – 50 nM transfer (1, 5, 10, 20, 50 nM, son konsantrasyonu) standart çözüm 5mC içine santrifüj tüpleri ve 50 ekleyin nM [D3]-borular için 5mC. Ek için 50 µL. toplam hacim talimatları 5mC örnek (adım 6) için standart 5mC analizini gerçekleştirin.
      2. 5hmC standart eğri oluşturmak: 1 – 20 nM transferi (1, 2, 5, 10, 20 nM, son konsantrasyonu) tüpler santrifüj kapasitesi ve 3 eklemek için 5hmC standart çözüm nM [D3]-tüpler için 5hmC. Ek için 50 µL. toplam hacim talimatları 5hmC örnek (adım 6) için standart 5hmC analizini gerçekleştirin.

7. analiz istatistiksel anlamlılık

  1. İstatistiksel analiz yazılımı kullanarak gerçekleştirin.
    1. Yazılımını açın ve "Sütun" "yeni tablo ve grafik içinde" seçin. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: "örnek veri | Başlangıç bir boş veri tablosu"; "Bir grafik ilk modu seçin"; "Çoğaltır veya hata çubukları grafik | Arsa | «««Demek"SEM ile.
    2. "Sırasıyla"A"ve"B"doğrultusunda Vc/PD0325901-tedavi ve kontrol grubunun üç çoğaltır girişine oluştur" u tıklayın. Altı verileri seçin ve "Analiz" "Analiz"'ı tıklatın.
    3. "T testleri (ve parametrik olmayan testler)" "İçinde sütun analizleri" seçin ve sonraki arayüzü girmek için "Tamam"'ı tıklatın.
    4. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: "Seç testi | Test adı | Unpaired t testi; Seçenekleri | İki kuyruklu"; "Güven aralıkları: % 95"; "Basamak | «««Show"4 basamak. Denetim ve Vc/PD0325901 tedavi arasında p değeri elde etmek için "Tamam" düğmesini tıklatın.
  2. Denetim ve unpaired iki kuyruklu öğrenci tistihdam deneysel grupları arasında istatistiksel anlamlılık değerlendirmek-16test.
    Not: p < 0,05 istatistiksel önemi haiz fark gösterir. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

VC/PD0325901 sinerjik fare ES Hücre küresel silme indüklenen. Serum fare ES hücrelerde DNA hipermetilasyon, süre pluripotent ICM hücreler ve PGCs DNA metilasyon küresel silme göstermek ve hypomethylated devlet onların pluripotency9,10ile yakından ilişkilidir sergi.

Daha önce biz ve diğerleri Vc Tet-aracılı 5mC demethylation15,17artırabilir buldum. Bu arada, 2i da 5mC de novo sentezi inhibe bulundu. Bu bulgular bağlamında, biz daha fazla fare ES hücreleri Vc ve 2i birlikte kullanılması sinerjik manipülasyon evlenme teklif etti. UHPLC-MS/MS analizden sonra bulduk Vc ve serum içeren ortamda takıma 2i önemli ölçüde 5mC içerik 3.2 100 C (~ %90 5mC kaybı) başına 0.33 için gün 11 tarafından fare ES hücreleri (Şekil 1A) azaltabilir. Buna ek olarak, Vc veya 2i-tedavi yalnız sadece % 58 silme % 1,4 5mC veya % 61 azaltma % 1.3 5mC düzeyinde sabit düzeyde ile neden olur.

2i orta MEK inhibitörü PD0325901 ve GSK3β inhibitörü CHIR99021 oluşmaktadır. Ardından, araştırdığımız hangi bileşenin Vc ve 2i eş tedavisi sırasında 5mC küresel kaybına neden olmaktadır. İlginç, Vc/PD0325901 DNA metilasyonu Vc/2i daha düzeyde daha hızlı bir düşüş nedeniyle. VC/2i-gün 11 karşılaştırılabilir bir düzeye ulaştı Vc/PD0325901 5 gün sonra sürekli 5mC düzeyleri (~0.33% 5mC) elde. Buna ek olarak, CHIR99021 ek kısmen Vc tetiklemeli DNA demethylation (Şekil 1A) bastırılır. Bu verileri PD0325901 2i içinde fare ES hücrelerdeki genomik DNA'ın küresel hypomethylation katkıda CHIR99021 2i, kısmen 5mC silinmesini engeller ise açıkça göstermektedir. Bu nedenle, biz Vc/PD0325901 Vc/2i göre tarafından indüklenen daha hızlı DNA demethylation CHIR99021 kısmi inhibisyonu demethylation Tarih atfedilen spekülasyon.

5mC Vc/PD0325901 tarafından indüklenen fare ES hücrelerdeki küresel silinmesini kısmen DNA demethylation geliştirme için uygun olabileceğini biz onaylanmadığına karar. Bu nedenle, biz 5mC genomik oksidasyon ürünleri inceledi. O 5mC-ebilmek var olmak değiştirmek için 5hmC Fe (II) ve 2-oxoglutarate18,19üzerinde bağımlı olan Tet aile dioxygenases katalitik oksidasyon tarafından bildirilmiştir. Genomik 5hmC DNA çoğaltma20ile seyreltilmiş. Ayrıca, 5hmC daha fazla 5-formylcytosine (5 fC) üretmek için Tet dioxygenases tarafından okside ve 5-carboxylcytosine (5caC), hangi etkili bir şekilde timin DNA glycosylase (TDG bazlar sitozin kurtarmak için) tarafından eksize, gösteren aktif bir DNA demethylation21,22.

Önceki iş15doğrultusunda, Vc içeren tedavi (Vc, Vc/2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021) önemli ölçüde 5hmC frekans (5hmC/106 C) sonra 1 gün ve bundan sonra yavaş yavaş reddetti 5hmC düzeyleri (Şekil 1B) nedeniyle artmış 5mC substrat giderek azalma. Özellikle, Vc/PD0325901 ve Vc/2i 5hmC kaybı Vc ve Vc/CHIR99021 göre 5mC daha hızlı azalma sayesinde daha hızlı kinetik gösterdi. Buna ek olarak, biz de gün 1, Vc/CHIR99021 CHIR99021 kısmen 5hmC Vc kaynaklı üretim bastırılır ve DNA demethylation inhibe gösteren karşılaştırıldığında 5hmC nesil daha Vc-tedavi uyarılmış gözlenen. 5hmC kaybı 2i tedavisinde 5mC substrat azaltmak için isnat edilmelidir. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar gösterdi Vc gelişmiş DNA demethylation aktivite kısmen katkıda sinerjik hypomethylation Vc/PD0325901 ve Vc/2i Co tedavisinde.

Her iki Habibi vd. 23 ve von Meyenn vd. 24 de fare ES hücreleri 2i koşullar altında küresel DNA hypomethylation ve saf pluripotency gösterdi bildirdi. 5mC seviyeleri gösterdi yavaş yavaş gerileme ve 12-14 gün sonra serum üzerinden reversion için 2i, kararlı bir duruma (~ %1 5mC) ulaştı. Vc/PD0325901 kültür sistemi içinde ortak tedavi daha hızlı DNA demethylation neden ve takviyesi serum orta Vc/PD0325901 Vc/PD0325901 sinerjik etkisi nedeniyle 5 gün sonra (%0.33 5mC) istikrarlı bir düzeye ulaştı. Ulaştı metillenmiş düzeyi (%0.33 5mC) pronouncedly Habibi vd tarafından bildirilen 2i koşullar altında daha düşük ve 5hmC düzeyleri Vc yükseltilen üretimi nedeniyle daha yüksek iken von Meyenn vd..

PD0325901 Prdm14 ifade Dnmt3b ve Dnmt3l, ama değil Dnmt3a25bastırmak için yüksek. PD0325901 eylem 5mC kaybı inducing araştırmak için protein 5mC ile ilgili ifade bir dizi, bakım (Dnmt1) ve de novo (Dnmt3a ve Dnmt3b) de dahil olmak üzere incelendiğinde DNA methyltransferases ve onların kofaktör (Uhrf1 ve Dnmt3l) ve Yönetmelik protein (Prdm14) 8,9,26. Sonra Western blot analizi, Prdm14 pronouncedly PD0325901 dahil Kültür (Şekil 2) yükseltilmiş. Buna ek olarak, Dnmt3b ve onun kofaktör Dnmt3l önemli ölçüde aşağı-Yönetmeliğin protein ifade PD0325901 dahil tedavi (Şekil 2) gösterdi. CHIR99021 tedavi Prdm14, Dnmt3b ve Dnmt3l üst düzeyde Hayır gösterdi veya hafif etkisi. Dnmt3awas ifade değişmedi ve nedeni belli değil. Ayrıca, bakım DNA metiltransferaz Dnmt1 ve onun hedefleme amil Uhrf1 da hiçbir değişiklik gösterdi ve verileri değil gösterildi.

Son yıllarda yapılan çalışmalarda Prdm14 polycomb baskıcı karmaşık 2 (PRC2) de novo DNA methyltransferases (Dnmt3a ve Dnmt3b) ve (Dnmt3l), onların kofaktör gibi onların ifade bastırmak için bazı gen Organizatör için recruit ve katkıda belirttiler hypomethylation 2i koşulları8,27altında tutma. Bizim veri PD0325901 Prdm14 Dnmt3b ve Dnmt3l inhibe ifade düzeyi yüksek ve de novo genomik 5mC sentezi mekanizması tarafından düşük saptandı.

Vc/PD0325901 koşullar altında fare ES hücreler pluripotent bakımından keşfetmek için mRNA ifade düzeyleri pluripotency bağlantılı birkaç temel faktörlerin incelenmiş ve bu faktörlerin pluripotency28hayati rolleri oynamak için teyit edilmiştir. Gerçek zamanlı PCR analiz Oct4, SOX2, Esrrb ve Sall4 serum Kültür (Şekil 3A) aksine Vc/PD0325901 ile tedavinin 5 gün üniforma ifade seviyelerde gösterdi bulundu. MicroRNAs ve Tcf3 1.3-fold ve 1.6-fold, anılan sıraya göre. Buna karşılık, Klf4% 42 aşağı-Yönetmeliğin gösterdi ve Rex1 sadece yaklaşık % 12 oranında azalmıştır. Bu sonuçlar Vc/PD0325901 ortak tedavi pluripotency faktörlerin ifadesinde çeşitli değişikliklere bağlı öneririz; Ancak, Oct4 ve SOX2, en temel etkenler, neredeyse sürekli düzeylerini ifadenin tuttu.

Ardından, alkalen fosfataz (AP) tahlil ister fare ES hücreleri farklılaşmamış veya farklı bir durumda olduğunu değerlendirmek için gerçekleştirildi. Fotoğraflar (Şekil 3B ve 3 C) hücrelerinin bir objektif lens tarafından 10 kat amplifikasyon ters bir mikroskopla bağlı bir kamera elde edilmiştir. Sonra sürekli ekimi 26 gün Vc/PD0325901-eklendi serum orta fare ES hücreleri homojen morfoloji gösterdi. Ayrıca, hemen hemen tüm hücreleri mor-siyah lekeli ve farklılaşmamış bir devlet gösterilen bir top gibi devlet çıkıntı (Şekil 3 c) olmadan sergiledi. Buna karşılık, serum koşullar altında fare ES hücreleri gün 26 bir bölümünü mor-siyah boyama ve diğerleri açık renk beyaz kesik oval çizgiler (Şekil 3B); tarafından işaretlenmiş outspreading ile sunulan morfoloji, bir top gibi durumda vardı sonra Bu serum kültürlü fare ES hücreleri heterojen Morfoloji ve önceki raporları13ile tutarlı bir pluripotent devlet olduğunu belirtti. Topluca, desteklenen veri Vc ile birlikte PD0325901 mükemmel Morfoloji ve fare ES hücreleri farklılaşmamış bir durumda ayakta olabilir.

Figure 1
Şekil 1: Vc/PD0325901 sinerjik genomik 5mCin fare ES Hücre küresel silme indüklenen. (A)5mC frekans (5mC/C) ve (B) 5hmC frekans (5hmC/C) saat-bağımlı değiştirmek bir sürekli ek Vc, 2i, Vc/2i, Vc/PD0325901 veya Vc/CHIR99021 ile serum içeren bir 26 günlük tedavi sırasında orta. Hata çubuğu standart sapma (SD) UHPLC-MS/Bayan C: sitozin tarafından üç tekrarlanan analizleri gösterir. Bu rakam Li ve ark. değiştirildi 25. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Prdm14 ve DNA methyltransferases (Dnmt3a, Dnmt3b ve Dnmt3l) protein ifade İLETİMLERİNİZE. (Soldan sağa) sunulan bantları ile 5 gün tedavi serum Kültür (kontrol), Vc, PD0325901, CHIR99021, 2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021 ve Vc/2i, sırasıyla elde edilmiştir. İfade Prdm 14 yukarı düzenlenir ve Dnmt3b ve Dnmt3l PD0325901 dahil kültür sonra düşmüştür. Dnmt3a herhangi bir değişiklik sergiledi. Β-tübülin iç referans olarak kuruldu. Con: Kontrolü; PD: PD0325901; CH: CHIR99021. Bu rakam Li ve ark. değiştirildi 25. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Vc/PD0325901-indüklenen değiştirme mRNA ifade pluripotent genlerin ve alkalen fosfataz aktivitesini. (A) mRNA kısmi pluripotent genlerin düzey 5 gün tedavi göre bu Vc/PD0325901 (kontrol) serum koşullarda değişti. Veri ± SD demek gibi temsil edildi İstatistiksel anlamlılık değerlendirildi ve p < 0,05 istatistiksel olarak anlamlıdır. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 ve ns temsil önemli olmayan. PD: PD0325901. Fare ES hücreleri 26 gün (B) için serumda kısmi yapılan harika Morfoloji ve farklılaşmamış bir durum (C) serum orta Vc/PD0325901-eklendi muhafaza ederken beyaz çizgili oval çizgilerle işaretlenmiş sergiledi. Bu görüntüleri parlak alan bir kamera ile bağlı bir ters mikroskobu elde. Bu rakam Li ve ark. değiştirildi 25. ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Çalışma, biz Vc ve PD0325901 fare ES hücreleri de novo DNA bastırmak ve DNA demethylation Vc tarafından teşvik sinerjik bir eylem tarafından elde edildi bir farklılaşmamış ve hypomethylated devlet sürdürebilmek için birleştirme bir roman yöntemi gösterdi metilasyon tarafından PD0325901. Ayrıca, fare ES hücreleri Vc/PD0325901 kültür sistemi altında büyük morfoloji gösterdi.

Daha iyi fare ES hücreleri durumunu Vc/PD0325901 kültür sistemi içinde sürdürmek için bazı önemli adımlar vardır. İlk olarak, FBS toplu işlemleri bulmak ve en iyi toplu stok için önceden filtrelenmiş olmak gerekir; Ayrıca, serum sık değiştirilmesi hücre çoğalması ve pluripotency bakımından zararlıdır. İkinci olarak, üzerinde pipetting hücreleri tek hücre süspansiyon için hücre kolonilerin hücre geçiş aşamasında dissociating sırasında kaçının. Hemen bulaşıkları hücrelerde hücre passaging sırasında kapsayan üçüncü olarak, hücre ekimi sırasında tripsin olumsuz etkisini azaltmak için tripsin uygulamış olmalısınız. Ayrıca, Vc/PD0325901 kültür orta Vc istikrarsızlık nedeniyle her gün değiştirilmesi gerekir.

Klasik serum kültür ile karşılaştırıldığında, fare ES hücreleri Vc/PD0325901 koşullar altında daha homojen bir hücre nüfus (Şekil 3B, C) ve ICM ve PGC benzer bir hypomethylated durumunu gösterir. Ayrıca, son zamanlarda geliştirilen 2i kültürü ile karşılaştırıldığında, bizim Yöntem hypomethylation daha hızlı kinetiği ile gerçekleştirebilir ve tek inhibitörü (PD0325901) kullanımı DMSO, böylece hücrelere zarar azalan giriş miktarını azaltır. Ancak, bizim kültür sistemi içinde FBS ek nedeniyle kararsız çift eylem FBS, hücre farklılaşması uzun vadeli kültür sırasında neden olabilir. Genel olarak, bu roman kültür sistemi içinde fare ES Hücre büyük ölçekli bakım ve genişleme için uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir potansiyel çıkar çatışmaları ifşa.

Acknowledgments

Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (21435008 ve 21327006 H.W. için) ve stratejik öncelik araştırma programı Çin Bilimler Akademisi tarafından desteklenmiştir (H.W. için XDB14030200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).

Tags

Biyokimya sayı: 136 C vitamini PD0325901 fare embriyonik kök hücreleri DNA hypomethylation Prdm14 Nanog
Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, C., Lai, W., Wang, H. An… More

Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter