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Medicine

Microfractured autologue et purifiée du tissu adipeux pour gestion arthroscopique des lésions cartilagineuses de l’astragale

doi: 10.3791/56395 Published: January 23, 2018

Summary

Le but de cette étude est de déclarer un protocole pour le traitement arthroscopique des lésions cartilagineuses de l’astragale en utilisant microfractured et purifiées cellules souches dérivées d’adipeux.

Abstract

Ces dernières années, des techniques de régénération ont été plus en plus étudiés et utilisés pour traiter les lésions cartilagineuses de l’astragale. En particulier, plusieurs études ont porté leur attention sur les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux. Cellules souches dérivées d’adipeux (ADSCs) présentent des caractéristiques morphologiques et des propriétés similaires aux autres cellules mésenchymateuses et sont capables de se différencier en plusieurs lignées cellulaires. En outre, ces cellules sont également largement disponibles dans le tissu sous-cutané, ce qui représente de 10 à 30 % du poids corporel normal, avec une concentration de 5 000 cellules par gramme de tissu.

Dans la technique présentée, la première étape consiste à récolter des ADSCs de l’abdomen et un processus de microfractures et purification ; Ensuite, l’intervention chirurgicale est effectuée entièrement arthroscopie, avec moins dissection des tissus mous, la meilleure visualisation conjointe et une récupération plus rapide par rapport aux standards. Arthroscopie se caractérise par une première phase où la lésion est identifiée, isolée et préparée avec microperforations ; la deuxième étape, réalisée sèche, consiste en l’injection de tissu adipeux au niveau de la lésion.

De janvier 2016 à septembre 2016, quatre patients ont subi un traitement arthroscopique des lésions cartilagineuses de l’astragale avec microfractured et purifiée du tissu adipeux. Tous les patients ont rapporté une amélioration clinique, six mois après la chirurgie, avec aucune complication signalée. Les scores fonctionnels au dernier suivi sont encourageants et confirment que la technique offre fiable de douleur et améliorations chez les patients atteints de lésions cartilagineuses de l’astragale.

Introduction

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Arthroscopie est l’étalon-or pour le traitement des lésions cartilagineuses de l’astragale (liens) dans le but de soulager la douleur, rétablir la fonctionnalité et améliorer la qualité de vie, particulièrement chez les patients jeunes et actifs.

Actuellement, les techniques arthroscopiques peuvent être classés en trois façons. La technique réparatrice stimule les cellules de la moelle osseuse à travers un débridement et microperforations au niveau de la lésion. La technique reconstructive remplace la lésion à l’aide d’un greffon autologue ou hétérologue ostechondral. La technique régénérative exploite la capacité des cellules multipotentes à différencier et à reproduire pour reconstruire le tissu endommagé1,2,3,4,5,6 .

Ces dernières années, les techniques de régénération ont fait l’objet de nombreuses études in vitro et in vivo pour le traitement des liens et des cellules souches mésenchymateuses en particulier dérivées du tissu adipeux (ADSCs)7,8 , 9. ces cellules souches mésenchymateuses présentent des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles similaires à d’autres cellules multipotentes, isolés des autres tissus ; ils ont également la capacité à se différencier en plusieurs et cellulaires différentes lignes fois in vitro et in vivo10,11,12,13. L’accent mis sur la recherche au sujet de ces cellules est principalement en raison de leur localisation, en fait elles représentent entre 10 % et 30 % du poids corporel normal avec une concentration de 5 000 cellules par gramme de tissu13,14. En revanche, un facteur qui limite l’utilisation de ces cellules est lié à leur manipulation au cours de procédures de laboratoire. Le lipoaspirate contenant des agrégats des adipocytes, les fibres de collagène et composants vasculaires normales est enzymatiquement transformé avec le collagène de type I A et soumis à l’hémolyse avant la culture. Le but ici est de décrire le protocole pour le traitement des lésions cartilagineuses de l’astragale en utilisant microfractured et purifiée du tissu adipeux.

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Protocol

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Toutes les interventions effectuées dans les études impliquant des participants humains ont été conformément aux normes éthiques de la Commission de recherche institutionnels et/ou national et avec la déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs ou éthiques comparables normes.

1. anamnèse

  1. Commencer l’examen clinique avec une anamnèse détaillée.
    Remarque : Un BTA doit toujours être suspectée en cas d’instabilité de la cheville avec des entorses répétées associées d’enflure, la raideur, douleur et blocage mixte. En outre, dans de nombreux cas OLT peut être associée à des antécédents de maladie systémique, comme une maladie inflammatoire ou vasculaire, neuropathie ou une maladie neurologique et le diabète. L’usage de drogues ou des problèmes médicaux qui peuvent influencer la guérison doit être évalué et pris en compte.

2. clinique examen

  1. Évaluer le patient en position orthostatique pour mettre en évidence la cheville ou la difformité du pied arrière. Évaluer divers musculaires et tendineuses de fonction et de la cheville du mouvement (ROM). Une tendresse diffuse est souvent présente, surtout pendant l’extension et de flexion maximale, et ce n’est pas rare de rencontrer une zone sensible au toucher au niveau de l’articulation articulaire.
  2. Effectuer un essai de tiroir antérieur et postérieur pour identifier une instabilité de la cheville latérale concomitante.
  3. Au cours de la consultation préopératoire, enregistrer les scores cliniques et fonctionnels suivants : American orthopédique pied & cheville Society (AOFAS) cheville et le pied arrière scores15, échelle analogique visuelle (VAS) douleur score16et 12 items forme abrégée Health Survey (SF-12)17.

3. radiological Assessment

  1. Effectuer un poids bilatéraux portant la radiographie du pied et la cheville. Il s’agit de classiques portantes antéro-postérieure (AP) mortaise et vue latérale sur le poids du corps de la cheville. Acquitteront mortaise AP en position neutre et 15 degrés de rotation interne pour une meilleure visualisation de l’astragale.
    NOTE : Seulement 50 % de l’OLT peut être diagnostiquée avec radiographie ; en cas de grosses lésions, une zone d’os détaché entouré de radioclarté peut être noté18.
  2. Aucune détection conventionnelle calculée tomographie-(CT-scan) de la cheville. Un CT-scan permet une localisation précise et la taille de la lésion, identifier également des fragments d’os en cas de détachement. Le point faible de la CT est la possibilité d’afficher l’état du cartilage. Une étude antérieure a montré une sensibilité et une spécificité de 0,81 et 0,99, respectivement, pour la détection des liens sur CT19,20.
  3. Effectuer l’imagerie de résonance magnétique (IRM) de la cheville. L’IRM est fondamentale dans l’évaluation os sous-chondral et de cartilage. En outre, l’IRM n’implique pas de rayonnements ionisants et permet une meilleure visualisation des tissus mous. La littérature rapporte une sensibilité et une spécificité de 96 % dans la détection des liens21,22.

4. surgical Technique

  1. Récolte et la transformation du tissu adipeux
    1. Préparer la solution de Klein : 1 L de solution saline 9 g/L, 50 mL de lidocaïne à 1 %, 1 mL d’adrénaline 1 : 1000, 10 mL de bicarbonate de sodium de 8,4 % et 0,1 mL de 10 mg/mL de triamcinolone acétonide.
    2. Créer deux para-ombilical incisions d’environ 0,5 cm avec une lame de bistouri. Injecter environ 300 mL de solution de Klein dans le tissu graisseux sous-cutané de l’abdomen à travers les incisions à l’aide de seringues de 60 mL avec une aiguille 18G (Figure 1).
    3. Récolter 40-45 mL de ADSCs à l’aide d’une canule émoussée 13G attaché à une seringue de 20 mL et introduit dans le kit de transformation (Figure 2). En règle générale, effectuer la récolte dans la zone peri-ombilical.
    4. Insérer 100-130 mL de lipoaspirate dans le système fermé. Pousser le lipoaspirate dans l’appareil à travers un filtre grand d’obtenir une première réduction de cluster ; dans le même temps, une quantité correspondante d’une solution saline s’arrête vers le sac de gaspiller. Un rôle central est joué par billes inox pour obtenir une émulsion temporaire entre l’huile, du sang et une solution saline. Enlever les résidus d’hydrocarbures et le sang contaminé par un contre-courant de gravité d’une solution saline.
    5. Après cette étape de lavage (la solution courante apparaît clair et le jaune de lipoaspirate), arrêter le flux de salin et d’inverser le dispositif (cap Gris vers le haut), menant à la deuxième réduction de cluster adipeuse. Obtenir la réduction en poussant les amas adipeux flottants à travers le filtre hexagonal deuxième coupe, poussant le liquide par en dessous avec une seringue de 10 mL. Recueillir le produit final dans une seringue de 10 mL reliée à l’ouverture supérieure de l’appareil.
      Remarque : Le kit de traitement pour les tissus adipeux améliore la technique de lipofilling standard : en fait, le système se compose d’un système cylindrique fermé, immersion totale, basse pression, afin d’obtenir un produit fluid et homogène contenant un grand nombre des péricytes. Cette procédure permet le traitement des cellules adipeuses exclusivement par l’intermédiaire de forces mécaniques douces et préserver l’intégrité de la niche stroma vasculaire. Le processus est la moins traumatisante possible et rend le produit final disponible en peu de temps (15-20 min), sans traitements enzymatiques ou d’expansion. Bon état vasculostromal niches aident le processus de guérison.
    6. Une fois que les ADSCs ont été récoltés, appliquer un bandage de compression sur l’abdomen.
  2. Intervention chirurgicale et l’Injection de tissu adipeux
    1. Placer le patient en position couchée sous anesthésie spinale avec un garrot, sous une pression de 250 mmHg, au niveau de la cuisse pour diminuer le saignement et permettre une meilleure arthroscopique visualisation1.
    2. Marquer les repères anatomiques sur la peau avec un crayon dermographique. Points de repère sont indispensables pour éviter les lésions iatrogènes.
      Marquer ce qui suit (Figure 3) :
      les deux malléoles (latérale (LM) et médiale (MM))
      la ligne commune antérieure (JL), identifiée avec dorsi - et -flexion plantaire de la cheville
      le tibialis anterior tendon (TAT) et le tendon d’Achille
      la grande saphène externe de la veine, qui se déroule juste devant la malléole interne
      le nerf péronier superficiel (SPN)
    3. Tout d’abord, effectuez le portail antéro médial juste au tibialis anterior tendon, coïncidant avec une tache molle. Ce portail représente le portail de l’approche. Dans la plupart des cas, une dépression avec la cheville en flexion dorsale est visible et palpable.
      1. Couper seulement la peau avec une lame et ensuite perforer la capsule par dissection non tranchante. Prendre soin d’éviter le nerf saphène interne et la veine grande saphène. La veine saphène est situé 9 mm latéralement sur le portail, tandis que le nerf est environ 7,4 mm latéral sur le portail. Cela constitue l’un des deux portails Regarde un primaire.
    4. Vérifier la ligne commune, placer le portail anterolateral, médial à la malléole et latérales au tendon extenseur des orteils.
      Remarque : Lorsque vous effectuez le portail anterolateral, empêche toute blessure au nerf cutané dorsal intermédiaire (la branche latérale du nerf péronier superficiel) ; pour cette raison, après la découpe, la peau doit être suivie par dissection par clivage.
    5. Inspecter le cartilage articulaire afin d’évaluer la taille et la position. Évaluer l’État et la qualité du cartilage avec le palpator. Les lésions cartilagineuses de l’astragale sont généralement situées soit posteromedially soit cristallinienne.
      1. Effectuer un traitement sous arthroscopie à l’aide d’arthroscopes de 2,7 mm grand angle avec un angle de 30°, mais certains chirurgiens utilisera un arthroscope 4 mm plus grande et conserver l’instrument dans la cavité antérieure de l’articulation. Techniques de distraction conjointe non invasifs et hyper flexion plantaire peuvent servir à accéder à la plupart de la coupole talar.
      2. Dans le cas d’une lésion postérieure par voie percutanée placer un épandeur Hintermann pour distraire l’articulation et de permettre l’exposition de la lésion. L’épandeur Hintermann a un levier d’ouverture bras appliqué sur les deux K-fils précédemment placés dans le tibia et les os talar médial ou latéral, selon le côté de la lésion. Dans le cas d’une lésion latérale, prendre soin d’insérer le fil K proximal dans l’OS tibial, évitant le péroné, pour atteindre la meilleure distraction de l’articulation.
    6. Préparer la lésion avec une curette, supprimant le cartilage endommagé et instable, la couche calcifié et l’OS nécrotique et sclérosé afin de créer une forme régulière contenaient lésion avec épaules frontières. Pour cette étape, utilisez une curette arthroscopique standard (Figure 4).
    7. Stimuler les cellules souches de la moelle osseuse de l’os sous-chondral effectuant des microperforations sans ambages de l’extérieur vers l’intérieur de la lésion.
      1. Accomplissent les perforations avec des intervalles d’environ 3 mm entre eux. Induire des microfractures utilisant un médiator chondrales sur l’os sous-chondral sains sous le défaut (Figure 5).
        Remarque : Une hémorragie entraîne la formation d’un caillot de fibrine. Produits, via l’activation de la cascade inflammatoire, la coagulation du sang libèrent des médiateurs vasoactifs, facteurs de croissance et cytokines. Ces facteurs ont le pouvoir de stimuler l’invasion vasculaire et la migration des cellules souches mésenchymateuses dans la portion chondrales de la lésion. Ces cellules pluripotentes sont stimulés à se différencier en fibroblastes, chondrocytes et les ostéoblastes et jouent un rôle important dans la stimulation de la réparation de la lésion. Facteurs de croissance paracrine dans l’environnement articulaire favorisent la formation de la matrice extracellulaire et la production de fibrocartilage. Dans le même temps, les cellules de la partie osseuse de la lésion produisent un tissu d’os immature qui est progressivement remplacé par un os mature.
    8. Enlevez l’eau intra-articular utilisation du rasoir à l’aspiration et le liquide restant à l’aide d’une éponge de coton jusqu'à ce que le joint soit complètement sec.
  3. Injection d’adipeux dérivées de cellules souches
    1. Injecter 5-7 mL de cellules souches issues d’adipeux, préalablement préparé à l’étape 4.1.3, dans l’articulation de la cheville à l’aide d’un des deux portails (antéro ou antérolatérale).
    2. Relâcher le garrot.

5. postopératoire soins

  1. Éviter les mouvements de la cheville pendant 15 jours, avec la branche exploitée libératoire.
  2. 15 jours après la chirurgie, permettent des mouvements actifs et passifs de la cheville, jusqu'à la guérison complète et amplitude de mouvement est atteint.
  3. Permet la charge 30 jours après la chirurgie.

6. clinique et radiographique suivi

  1. Évaluer les patients cliniquement et radiologiquement à six et douze mois et, par la suite, chaque année. Le protocole de suivi se compose de cheville AOFAS et pied arrière partitions, score de douleur Eva et SF-12 à chaque virage15,16,17. L’examen radiographique comprend un IRM et scanner de la cheville exploitée.

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Representative Results

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De janvier 2016 à septembre 2016, quatre patients ont subi un traitement arthroscopique des lésions cartilagineuses de l’astragale avec microfractured et purifiée du tissu adipeux. Tous les patients ont rapporté une amélioration clinique six mois après la chirurgie. Les résultats cliniques préliminaires sont présentés au tableau 1. Pas de complications ont été signalées.

Ces dernières années, l’utilisation de ADSCs pour le traitement des pathologies du pied et la cheville a augmenté. En 2013, Kim et al. 23 traités 65 patients âgés, plus de 50 ans pour partager la BTA symptomatique pour le type de traitement :
-isolé de stimulation de la moelle
-stimulation de la moelle en liaison avec ADSCs

Au suivi final, patients avec un traitement combiné a montré une amélioration clinique significative par rapport au traitement de stimulation isolée de moelle osseuse. Une autre étude, menée par le même groupe24, pour le traitement de l’OLT, confirmé comment le traitement combiné de la stimulation de SVF et moelle osseuse était supérieur à microfracture isolé.

En 2016, Kim et al. 25 a évalué les résultats chez 49 patients traités par stimulation de la moelle et latérale coulissante ostéotomie du calcanéum. Vingt-six patients subissent aussi injection de MSC. Un an après la chirurgie, patients traités par MSC présenté un score plus élevé des ICRS et résultats cliniques. Récemment, Kim et al. 26 a noté que les patients traités par injection de MSC après que stimulation ostéotomie et moelle de supramalleolar a rapporté des résultats cliniques et radiologiques plus élevés, comparées aux patients traités sans MSC.

Figure 1
Figure 1 : une solution Saline contenant l’adrénaline et la lidocaïne est injectée au niveau de l’abdomen à l’aide d’une canule de 20 g. Pour la liposuccion, utiliser une canule de 13 g reliée à une seringue. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : le kit de traitement pour les tissus adipeux se compose d’un kit à usage unique pour la lipoaspiration et la purification du tissu adipeux. Toutes les procédures sont effectuées avec les ADSCs immergés dans une solution saline, évitant tout trauma et maintenir intactes les niches vasculostromal contenant des cellules souches mésenchymateuses et péricytes. L’unité se compose d’un cylindre en plastique transparent, de filtres et de perles pour la microfissuration du tissu adipeux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : en dehors des vues de la cheville au cours de la planification chirurgicale. Avec le patient en décubitus dorsal, il est utile d’identifier tous les points de repère sur l’articulation nécessaire pour l’intervention chirurgicale.
AM = antéro portail
AL = antérolatérale portal
MM = malléole
LM = malléole externe
TAT = tibalis tendon antérieur
JL = ligne mixte
SPN = nerf péronier superficiel s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : vue arthroscopique. La lésion est préparée à l’aide d’une curette en enlevant le cartilage endommagé et l’OS nécrotique et sclérosé s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : vue arthroscopique. Microfractures, effectués au niveau de la lésion ostéo, stimuler les saignement et la fuite des cellules souches mésenchymateuses de l’os sous-chondral. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Patients Préopératoire 6 mois après la chirurgie
AOFAS SAV SF-12 AOFAS SAV
PCS MCS
1 44 8 31.1 32,4 88 3
2 32 7 27,5 42,1 78 2
3 52 9 40,1 28.7 87 2
4 59 8 36,6 41 82 2
Moyenne 46,75 8 33,83 36.05 83.75 2.25

Tableau 1 : résultats cliniques à 6 mois de suivi. AOFAS : L’américain orthopédique pied et cheville société Score ; VAS : Échelle visuelle analogique de la douleur ; SF-12 : 12-point forme courte enquête ; MCS : Composante mentale Score ; PC : Physique du composant Score.

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Discussion

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Ces dernières années, les essais cliniques et précliniques ont concentré leurs efforts sur l’effet de ADSCs pour traiter différentes pathologies musculo-squelettiques. Le but de cet article est de décrire le protocole pour le traitement des lésions cartilagineuses de l’astragale à l’aide de microfractured et le tissu adipeux purifié en liaison avec microperforations sous arthroscopiques. Le protocole implique plusieurs étapes critiques à hauts risques de complications. Pendant la récolte de matière grasse, les complications se divisent en complications locales ou systémiques.

La complication post-opératoire la plus fréquente est des irrégularités de contour, avec une incidence de 2,7 %. Cela peut être évité à l’aide de petites canules, pas effectuer la liposuccion superficielle et éteindre l’aspiration lorsque vous quittez les incisions. Rarement, les affections cutanées comme l’hyperpigmentation, nécrose et érythème chez les patients atteints de maladies du tissu conjonctif sous-jacent peuvent être vu27,28. Séromes sont souvent le résultat de la liposuccion agressif à cause de la collection de liquide séreux dans une zone traitée conduisant à la formation d’une cavité unique ; Ceci est plus fréquent chez les patients avec l’IMC élevé29. L’infection est une complication très rare (< 1 %) et c’est peut-être à cause d’une combinaison de technique stérile, de petites incisions et les effets antibactériens de lidocaïne30.

La littérature rapporte des complications mortelles ultérieures après la liposuccion, comme l’embolie pulmonaire, embolie gras, septicémie, fasciite nécrosante et la perforation des organes abdominaux. La cause la plus fréquente de décès est de thrombo-embolie pulmonaire. Ces complications sont dues au manque de stérilité, mauvaise observance et permissive décharge postopératoire30.

Également au cours de l’arthroscopie, il y a des étapes cruciales qui peuvent entraîner des complications : dans ce protocole, tous arthroscopiques sont effectuées au moyen d’un portail antéro et antérolatérale31. La complication la plus fréquente de cette approche est un déficit du nerf péronier superficiel, rapporté à 1,04 % des patients, malgré un marquage préopératoire du nerf et de ses branches32,33. En outre, le risque augmente si l'on considère les variations de ce nerf : études anatomiques ont montré que 50 % de la population présentent deux branches, et elles peuvent atteindre jusqu'à 5 branches avec une largeur très variable (1 à 13 mm).

La technique décrite dans le protocole combine l’effet de la microfracture en liaison avec des cellules souches mésenchymateuses récoltées du tissu adipeux. Microperforations stimuler le développement d’un tissu réparatrice : forage de l’os sous-chondral produit des saignements et des fuites de cellules mésenchymateuses, pour produire le fibrocartilage. Le succès de microfractures est strictement lié à la taille de la lésion. Si les lésions sont moins de 1,5 cm2, le tissu de fibrocartilage neo-formé, bien que qualitativement différent de cartilage hyalin et avec des propriétés mécaniques inférieures, peuvent fournir une réparation adéquate, avec résolution des symptômes dans un anticyclone pourcentage de cas34,35. ADSCs peut se former neo-tissu avec un phénotype de cartilage hyalin, si cultivés en liaison avec les différents facteurs de croissance (TGFb, GH et FGF-2) et placées dans un échafaudage de colle de fibrine36.

La technique décrite préserve l’identité de le pericyte, en laissant intacte la niche vasculaire stromale, promotion cartilagineuses de guérison de cette façon. En outre, ADSCs produisent une variété de molécules bioactives paracrine et peut activer le processus physiologique de guérison. Le produit final est disponible en moins de 20 min, grâce à la méthode mécanique douce. Enfin, conformément à la US Food and Drug Administration, ADSCs sont très peu manipulés.

L’utilisation de MSCs cesse d’augmenter, et les recherches futures devraient se concentrer sur l’utilisation de ADSCs allogéniques tel que décrit par Lee37. Les avantages d’une allogreffe seraient nombreuses. Tout d’abord, manipulation et la normalisation du produit serait plus faciles. Lipoaspiration et le traitement des mesures pourraient être éliminées, et un donneur sain pourrait être présélectionné, selon son profil d’expression marqueur cytokine et cellule, améliorer l’effet de MSCs,38.

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Disclosures

Federico Giuseppe Usuelli, MD, rapports de droits personnels par Integra et Geistlich et de subventions et les personnels de Zimmer, en dehors de la proposition.

Acknowledgments

Les procédures sont effectuées en utilisant le système de Lipogems.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PROCESS KIT - PROCESSING KIT FOR FAT TISSUE LIPOGEMS LG PK 60 Lipogems Kit to obtain microfractured and purified ADSCs
HINTERMANN SPREADER INTEGRA 119654 The spreader allow to access most of the talar dome, in particular in case of posterior lesion
CUP CURETTE ARTHREX AR-8655-02 To remove the damaged cartilage and necrotic and sclerotic bone
CHONDRAL PICK 30° TIP / 60° TIP ARTHREX AR-8655-05
AR-8655-06
To perfrom microperforation at the level of the lesion, stimulating bleeding from the subchondral bone
SHAVER ARTHREX AR-7300SR To clean the joint and aspirate water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Microfractured autologue et purifiée du tissu adipeux pour gestion arthroscopique des lésions cartilagineuses de l’astragale
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D'Ambrosi, R., Indino, C., Maccario, C., Manzi, L., Usuelli, F. G. Autologous Microfractured and Purified Adipose Tissue for Arthroscopic Management of Osteochondral Lesions of the Talus. J. Vis. Exp. (131), e56395, doi:10.3791/56395 (2018).More

D'Ambrosi, R., Indino, C., Maccario, C., Manzi, L., Usuelli, F. G. Autologous Microfractured and Purified Adipose Tissue for Arthroscopic Management of Osteochondral Lesions of the Talus. J. Vis. Exp. (131), e56395, doi:10.3791/56395 (2018).

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