Summary
Ett protokoll presenteras för syntesen av core-shell lanthanide-dopade uppkonvertering nanokristaller (UCNs) och deras cellulära applikationer för protein kanaliseraregleringen vid nära infrarött (NIR) ljus belysning.
Abstract
Lanthanide-dopade uppkonvertering nanokristaller (UCNs) har rönt stor uppmärksamhet under senare år baserat på deras lovande och kontrollerbar optiska egenskaper, som möjliggör absorptionen av infrarött (NIR) ljus och kan därefter omvandla den till Multiplexed utsläpp som spänner över ett brett spektrum av regioner från UV till den synliga till Niren. Denna artikel presenterar detaljerade experimentella procedurer för hög temperatur samfällning syntes av core-shell UCNs att införliva olika lanthanide joner i nanokristaller för att effektivt omvandla deep-vävnad genomträngliga NIR excitation (808 nm) in i en stark blå utsläpp på 480 nm. Genom att kontrollera ytmodifiering med biokompatibel polymer (polyakryl syra, PAA), förvärvar de som förberedda UCNs bra löslighet i fungera som buffertlösningar. De hydrofila nanokristaller är ytterligare functionalized med specifika ligander (dibensyl cyclooctyne, DBCO) för lokalisering på cellmembranet. Vid NIR ljus (808 nm) bestrålning, matas ut blå utsläpp kan effektivt aktivera proteinet ljus-gated kanal på cellmembranet och särskilt reglera ering (t.ex., Ca2 +) tillströmningen i cytoplasman. Detta protokoll ger en genomförbar metod för syntesen av core-shell lanthanide-dopade UCNs och efterföljande biokompatibla ytmodifiering för ytterligare cellulära applikationer.
Introduction
Under de senaste åren har lanthanide-dopade uppkonvertering nanokristaller (UCNs) använts som ett alternativ till konventionella organiska färgämnen och kvantprickar i biomedicinska tillämpningar, som huvudsakligen bygger på deras utestående kemiska och optiska egenskaper, inklusive stor biokompatibilitet, hög motståndskraft mot fotoblekning och smala bandbredd utsläpp1,2,3. Viktigare, kan de fungera som en lovande nanotransducer med utmärkt vävnad penetration djup i vivo konvertera nära infrarött (NIR) excitation i ett brett spektrum av utsläpp från UV, synligt, och NIR regionerna genom en flera foton uppkonvertering process4,5. Dessa unika egenskaper gör lanthanide-dopade UCNs fungera som en särskilt lovande vektor för biologiska avkänning, biomedicinsk imaging och sjukdomar theranostics6,7,8.
De allmänna delarna av UCNs baserade huvudsakligen på de dopade lanthanide jonerna i isolerande värd matrisen som innehåller en sensitizer (t.ex., Yb3 +, Nd3 +) och en aktivator (t.ex., Tm3 +, Er3 +, Ho 3 +) inom kristallen homogeneously9. Olika optiska utsläpp från nanokristaller tillskrivs lokaliserade elektronisk övergång inom de 4f -orbitalsna de lanthanide dopants på grund av sin stege-liknande ordnad energi nivå10. Därför är det kritiskt att exakt kontrollera storlek och morfologi av syntetiserade UCNs med flerkomponents lanthanide dopants. Av rätt, har några lovande metoder varit väl etablerade för beredning av lanthanide-dopade UCNs, inklusive hög temperatur samfällning, sol-gel bearbetning, hydrotermiska syntes, termisk nedbrytning, etc.11 , 12 , 13 bland dessa synsätt, hög temperatur samfällning metoden är en av de mest populära och praktiska strategier för UCNs syntes, som kan kontrolleras strängt för att förbereda önskad högkvalitativa nanokristaller med enhetlig form och storleksfördelning i en relativt kort reaktionstid och låg kostnad14. De flesta nanostrukturer syntetiseras av denna metod är dock främst utjämnade med hydrofoba ligander såsom oljesyra och oleylamine, som i allmänhet hindrar deras ytterligare bioapplication på grund av begränsat av hydrofoba ligand löslighet i vattenlösning 15. därför, är det nödvändigt att utföra lämplig ytmodifiering tekniker för att förbereda biokompatibelt UCNs i biologiska applikationer in vitro och in-vivo.
Häri, presenterar vi detaljerade experimentella förfarandet för syntesen av core-shell UCNs nanostrukturer genom metoden hög temperatur samfällning och en möjlig ändring teknik till functionalize biokompatibel polymer på UCNs yta för Mer ytterligare cellulära applikationer. Denna UCNs nanoplatform innehåller tre lanthanide joner (Yb3 +, Nd3 +och Tm3 +) i den nanokristaller att förvärva starka blå utsläpp (~ 480 nm) vid NIR ljus magnetiseringen på 808 nm, vilket har större genomträngningsdjupet i levande vävnad. Det är väl känt att Nd3 +-dopade UCNs Visa minimerade vatten absorption och överhettning effekter vid denna spektrala fönster (808 nm) jämfört med konventionella UCNs på 980 nm bestrålning16,17, 18. Dessutom för att utnyttja UCNs i biologiska system, bort de hydrofoba liganderna (oljesyra) på ytan av UCNs för det första av ultraljudsbehandling i Syralösningen19. Sedan modifieras de ligand-fri UCNs ytterligare med en biokompatibel polymer (polyakryl syra, PAA) att förvärva bra löslighet i vattenlösningar20. Dessutom som ett proof-of-concept i cellulära applikationer, de hydrophilic UCNs är ytterligare functionalized med molekylär ligander (dibensyl cyclooctyne, DBCO) för specifik lokalisering på N3-taggade cellmembranet. Vid NIR ljus (808 nm) bestrålning, matas ut blå utsläpp på 480 nm kan effektivt aktivera ett ljus-gated kanal protein, channelrhodopsins-2 (ChR2), på cell ytan och därmed underlätta ering (t.ex., Ca2 + ion) tillströmning över membranet i levande celler.
Detta video protokoll ger en genomförbar metod för lanthanide-dopade UCNs syntes, biokompatibla ytmodifiering och UCNs bioapplication i levande celler. Eventuella skillnader i de syntes tekniker och kemiska reagenser som används i fysikalisk tillväxt kommer att påverka storlek distribution, morfologi och uppkonvertering luminiscens (UCL) spektra av slutliga UCNs nanostrukturer används i cellen experiment. Detta detaljerad video protokoll är beredd att hjälpa nya forskare i fältet att förbättra reproducerbarheten av UCNs med hög temperatur samfällning metoden och undvika de vanligaste misstagen i UCNs biokompatibla ytmodifiering för ytterligare cellulära applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
försiktighet: Läs alla relevanta säkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Använd alla lämpliga säkerhetsrutiner när du utför syntesen av UCNs vid hög temperatur (~ 290 ° C), inklusive användning av tekniska kontrollåtgärder (spiskåpa) och personlig skyddsutrustning (t.ex. skyddsglasögon, handskar, labbrock, full längd byxor och stängd tå skor).
1. syntes av NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) core-shell nanokristaller
- syntes av NaYF 4: Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%) core nanostruktur
- Förberedelse av RE (CH 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F metanol stamlösning
Obs: den sällsynta jordartsmetaller (RE) lanthanide joner inkluderar Yttrium (Y), Ytterby (Yb), Thulium (Tm) och neodym (Nd).- Lös 500 mg Yttrium(III) acetat återfukta i 5 mL metanol (100 mg/mL), 250 mg Ytterbium (III) acetat hydrat i 5 mL metanol (50 mg/mL), 10 mg tulium (III) acetat hydrat i 1 mL metanol (10 mg/mL), och 10 mg Neodymium (III) acetat hydrat i 1 mL metha NOL (10 mg/mL) i injektionsflaskor av glas med en Ultraljuds rengöring bad för 2 min.
- Kombinera 400 mg NaOH i en 50 mL centrifugrör med 20 mL metanol med Ultraljuds rengöring bad att förbereda NaOH stamlösning (20 mg/mL).
- Kombinera 600 mg NH 4 F i en 50 mL centrifugrör med 30 mL metanol med Ultraljuds rengöring bad att förbereda NH 4 F stamlösning (20 mg/mL).
Obs: Placera stamlösning av lanthanide komplex, NaOH och NH 4 F i injektionsflaskor av glas, försegla med parafilm och förvara dem i kylskåp vid ~ 4 ° C tills den behövs. De beredda metanol stamlösningar byts ut varannan vecka.
- Förberedelse av NaYF 4: Yb/Tm/Nd core nanostruktur
- Pipettera 3 mL oljesyra och 7 mL 1-octadecene till en 50 mL-kolv för tre-neck.
- Kombinera 1.089 mL Y (CH 3 CO 2) 3 stamlösning, 0.608 mL Yb (CH 3 CO 2) 3 stamlösning, 83,6 µL av Tm (CH 3 CO 2) 3 beståndet lösning, och 128,5 µL Nd (CH 3 CO 2) 3 stamlösning i kolven.
- Passar en termometer (0 - 360 ° C intervall) i kolven och låt dess spets touch lösningen. Placera kolven i en glasbehållare med phenylmethyl silikonolja.
- Värm lösningen till 100 ° C med en värmeplatta dunsta av metanol. Anslut kolven till en Schlenk linje med en dubbla vakuum/gas grenrör att ta bort kvarvarande metanol och hålla reaktionsblandningen under vakuum för 2-3 min under omrörning.
- Öka temperaturen till 150 ° C och hålla denna temperatur för 60 min. upprätthålla en omrörningsanordning hastighet av 700 rpm under syntesen.
Obs: Ange en måttlig omrörning fart för att undvika stänk lösningen. - Stoppa värmeplattan och hålla kolven vid rumstemperatur till låt lösningen svalna långsamt.
Obs: Protokollet kan pausas här. - Kombinera 2 mL NaOH-metanol stamlösning och 2.965 mL NH 4 F-metanol stamlösning i en 15 mL centrifugrör. Dra åt röret med sin mössa och blanda lösningen genom kraftfulla vortexa för 5 s.
- Lägg till NaOH-NH 4 F blandningen långsamt in kolven med en glas pipett över 5 min.
- Öka temperaturen på blandningen till 50 ° C och hålla denna temperatur för 30 min.
Obs: Ange temperaturen vid högst 50 ° C eftersom den höga temperaturen kommer att främja crystal kärnbildning och tillväxt. - Öka temperaturen (~ 100 ° C) till dunsta av metanol och anslut kolven till en Schlenk linje med en dubbla vakuum/gas grenrör att ta bort kvarvarande metanol och hålla reaktionsblandningen under vakuum för 2-3 min.
- Växla position Avstängningskranen att fylla kolven med kväve.
- Öka temperaturen till 290 ° C med en värme hastighet på ~ 5 ° C i minst hålla reaktionsblandningen vid 290 ° C i 1,5 h.
- Stoppa värmeplattan och ta ut kolven för att tillåta reaktionsblandningen att svalna långsamt i rumstemperatur under omrörning.
Varning: Var försiktig med den varma plattan med hög temperatur (> 400 ° C) att undvika svåra brännskador vid hudkontakt. - Överför blandningen i kolven i en 50 mL centrifugrör. Skölj kolven med 30 mL etanol och överför lösningen till centrifugröret.
- Centrifugera produkten vid 4000 × g i 8 min i rumstemperatur och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 10 mL hexan till centrifugrör och åter sprida produkten med ultraljudsbehandling (60 kHz, 240 W) för 2 min.
- Tillsätt 30 mL etanol till röret. Snurra ner produkten på 4000 × g i 8 min och sedan avlägsna supernatanten.
- Skingra åter fast produkterna i botten av centrifugrör med 5 mL hexan. Förvara lösningen i kylskåp vid ~ 4 ° C i ett nästa steg.
Obs: Uppkonvertering utsläpp av core-shell UCNs testas genom att bestråla lösningar med en 808 nm laser (2 W).
- Förberedelse av RE (CH 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F metanol stamlösning
- Förberedelse av NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) core-shell nanokristaller
- kombinera 3 mL oljesyra och 7 mL 1-octadecene till en 50 mL-kolv för tre-hals. Lägg till 1.082 mL stamlösning Y (CH 3 CO 2) 3 och 2.87 mL stamlösning Nd (CH 3 CO 2) 3 in kolven.
- Lägg till erhållna core nanostrukturen (80 mg i 5 mL hexan från steg 1.1.2.18) i kolven under omrörning.
- Passar en termometer (0 - 360 ° C intervall) i kolven och låt dess spets Tryck blandningen. Placera kolven i en glasbehållare med phenylmethyl silikonolja.
- Värm blandningen vid 100 ° C på toppen av värmeplatta dunsta av metanol och hexan. Anslut kolven till en Schlenk linje med en dubbla vakuum/gas grenrör att avlägsna de återstående lösningsmedlet och hålla reaktionsblandningen under vakuum för 2-3 min under omrörning.
- Öka temperaturen till 150 ° C och håll den för 60 min. underhåll omrörning hastigheten vid 700 rpm i syntesen.
Obs: Ange en måttlig omrörning fart för att undvika stänk lösningen. - Stoppa värmeplattan och ta ut kolven för att låt lösningen svalna långsamt i rumstemperatur.
Obs: Protokollet kan pausas här. - Pipett 2 mL NaOH-metanol stamlösning och 2.965 mL NH 4 F-metanol stamlösning i en 15 mL centrifugrör. Dra åt röret med sin mössa och blanda lösningen genom kraftfulla vortexa för 5 s.
- Lägg blandningen i kolven av glas pipett långsamt över 5 min.
- Öka temperaturen på blandningen till 50 ° C och håll den vid 50 ° C i 30 min.
Obs: Ställ in temperaturen inte är högre än 50 ° C eftersom den höga temperaturen kommer att främja crystal kärnbildning och tillväxt. - Öka temperaturen (~ 100 ° C) till dunsta av metanol och anslut kolven till en Schlenk linje med en dubbla vakuum/gas grenrör ta bort kvarvarande metanol, hålla reaktionsblandningen under vakuum för 2-3 min.
- Växla position Avstängningskranen att fylla kolven med kväve.
- Öka temperaturen till 290 ° C med en värme hastighet på ~ 5 ° C i minst hålla reaktionsblandningen vid 290 ° C i 1,5 h.
- Stoppa värmeplattan och ta ut kolven för att tillåta reaktionsblandningen att svalna långsamt i rumstemperatur under omrörning.
Varning: Var försiktig med den varma plattan med hög temperatur (> 400 ° C) att undvika svåra brännskador vid hudkontakt. - Överför blandningen i kolven i en 50 mL centrifugrör. Skölj kolven med 30 mL etanol och överför lösningen till centrifugröret.
- Centrifugera produkten vid 4000 × g i 8 min i rumstemperatur och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 10 mL hexan till centrifugrör och åter sprida produkten med ultraljudsbehandling (60 kHz, 240 W) för 2 min.
- Tillsätt 30 mL etanol till röret. Snurra ner produkten på 4000 × g i 8 min och sedan avlägsna supernatanten.
- Skingra åter fast produkterna i botten av centrifugrör med 5 mL hexan. Förvara lösningen i kylskåp vid ~ 4 ° C tills behövs.
Obs: Uppkonvertering utsläpp av core-shell UCNs testas genom att bestråla lösningar med en 808 nm laser (2 W).
2. Syntesen av biokompatibelt UCNs nanostrukturer
- beredning av ligand-fri UCNs nanopartiklar
- kombinera 30 mL etanol med som förberedda oleate-capped UCNs lösningen (steg 1.2.18) i ett 50 mL centrifugrör. Centrifugera blandningen på 4 000 × g i 8 min i rumstemperatur och kasta bort supernatanten.
- Kombinera 10 mL syra vattenlösning (pH = 4) justeras av HCl (0,1 M) med fällningen i 50 mL centrifugrör och lös upp utfällningen av ultraljudsbehandling (60 kHz, 240 W) för 30 min.
- Överför lösningen i ett glas injektionsflaska med kraftig omrörning för 2 h.
- Extrahera en vattenlösning med 30 mL dietyleter att ta bort oljesyrehalt, upprepa tre gånger.
- Tillsätt 10 mL vatten i kombinerade eter lager med varsam skakning.
- Samla den vattenhaltiga fasen tillsammans (20 mL) och tillsätt 20 mL aceton med vortexa för 5 s.
- Snurra ner produkten vid 35.000 × g i 10 min och sedan Kassera supernatanten. Lös upp utfällningen i 2 mL vatten.
- Beredning av polymer modified UCNs (PAA-UCNs)
- kombinera 200 mg av polyakryl syra (PAA, Mw = 1.800) med 20 mL vatten av ultraljudsbehandling (60 kHz, 240 W) för 20 min. Lägg de ovannämnda ligand-fri UCNs i PAA lösningen med kraftig omrörning.
- Justera pH-värdet till 7,4 av NaOH-lösning (1 M) med ultraljudsbehandling (60 kHz, 240 W) för 30 min. Förvara blandningen för 24 h i rumstemperatur under omrörning.
- Samla upp fällningen genom centrifugering vid 35.000 × g för 10 min. återsuspendering produkten i 10 mL vatten av ultraljudsbehandling (60 kHz, 240 W) för 5 min och centrifugera igen vid 35.000 × g i 10 min. Upprepa detta tre gånger.
- Åter sprida produkten i 8 mL vatten av ultraljudsbehandling (60 kHz, 240 W) för 5 min. Förvara lösningen i kylskåp vid ~ 4 ° C tills behövs.
- Beredning av funktionella DBCO-UCNs nanopartiklar
- Spin ner det som förberedda PAA@UCNs (1 mg) genom centrifugering vid 35.000 × g för 10 min. återsuspendering fällningen i 1 mL torrt DMF genom ultraljudsbehandling (60 kHz, 240 W) för 1 min och centrifugera igen på 35.000 × g i 10 min. Upprepa detta två gånger.
- Lös upp utfällningen i 200 µL torr DMF i en injektionsflaska av glas. Lägga till HOBT (12,2 mg), EDC (14 mg), DBCO-NH 2 (5 mg) och DIPEA (16 µL) i injektionsflaskan med magnetisk omrörning för 24 h.
- Samla produkten genom centrifugering vid 35.000 × g för 10 min. avlägsna supernatanten och slamma fällningen i 1 mL DMSO och centrifugera igen vid 35.000 × g i 10 min. Upprepa detta tre gånger.
- Skingra produkten i 0,2 mL DMSO och förvaras i kylskåp vid ~ 4 ° C före användning.
3. BioApplications av DBCO-UCNs i den förordning av membran kanaler i levande celler
- kultur HEK293 cellerna i Dulbecco ' s ändrad Eagle ' s Medium (DMEM) kompletteras med 10% FBS, 100 enheter/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin och upprätthålla en befuktade inkubator med 5% CO 2 vid 37 ° C. frö 1 × 10 5 celler i 1 mL DMEM per brunn i en 12-well platta och hålla den i inkubatorn för 24 h.
- Kombinera plasmiden (pCAGGS-ChR2-Venus, 1 µg) med P3000 transfection reagens (2 µL) i Eagle ' s Minimum väsentliga Media (MEM) (100 µL) i mikrocentrifug rör A och Lägg transfection reagens (1,5 µL) i MEM (100 µL) i röret B.
- Inkubera blandningen av lösningar i rör A och B för 10 min i rumstemperatur.
- Kombinerar lösningen i rör A och B med 400 µL MEM. Tvätta cellerna med 1 mL serumfritt DMEM dubbelt.
- Lägga till 600 µL transfection blandningen i varje brunn 12-well platta och inkubera cellerna vid 37 ° C inkubator för 4 h. ta bort mediet och tvätta två gånger med 1 mL DMEM.
- Tillsätt 1 mL DMEM innehållande 1 µL Ac 4 ManNAz (50 mM i DMSO) i brunnen och hålla den i inkubatorn 2dagar.
- Ta bort mediet och tvätta en gång med 1 mL PBS. Tillsätt 1 mL Trypsin-EDTA (0,25%)-lösning i varje brunn Skyltens 12-väl och inkubera vid 37 ° C tills cellerna har lossnat (~ 2 min). Nytt kultur cellerna i en confocal maträtt på 1 × 10-5 celler per brunn i 1 mL DMEM för övernattning.
- Ta bort mediet och tillsätt 1 mL färsk DMEM med 2 µL DBCO-UCNs (50 mg/mL) i skålen för 2 h vid 37 ° C. För confocal imaging, tvätta cellerna två gånger med DMEM och Lägg till 1 µL Rhod-N 3 (10 mM) för 30 min.
- För intracellulär kalcium analys, inkubera cellerna med blandningen av 1 µL Rhod-3 AM (10 mM), 10 µL Probenecid (250 mM) och 10 µL lastning buffert (Pluronic ytaktivt ämne polyols,0.1% w/v)) i 1 mL DMEM medium för 30 min i mörkret.
- Tvätta cellerna med serumfritt DMEM och bestråla med 808 nm NIR ljus vid doseringen av 0.8 W/cm 2 för 20 min (5 min paus efter 5 min belysning).
- Registrerar imaging resultaten på confocal mikroskopet (laserkälla: 561 nm laser; detektor intervall: 610/75 nm; lins: 100 x 1.4 NA olja, exponeringstid: 100 ms). Tillsätt 1 mL Trypsin-EDTA (0,25%)-lösning i varje brunn och inkubera vid 37 ° C tills cellerna har lossnat (~ 2 min). Slamma upp cellerna i 1 mL PBS för flödescytometri (FCM) Flödesanalys (Ex: 561 nm, Em: 582/15 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schematiska syntesprocessen för core-shell lanthanide-dopade UCNs visas i figur 1 och figur 2. De Överföringselektronmicroscopy (TEM) och högupplösta överföring elektronmikroskopi (HRTEM) bilder av core och core-shell UCNs nanostrukturer samlades respektive (figur 1). De ligand-fri UCNs bereds genom att ta bort det hydrofoba oljesyrehalt på ytan av UCNs i sur lösning, och modifierad med hydrofil polymer (PAA). Sedan de COOH-capped PAA-UCNs är functionalized med DBCO-NH2 av en amid Kondensationsreaktion. TEM bilder av ligand-fri UCNs, PAA-UCNs och DBCO-UCNs visas i figur 2. Den dynamiska ljusspridning (DLS), zeta potentiella resultat och uppkonvertering luminiscens (UCL) spektra av DBCO-UCNs samlas respektive (figur 3). Den fourier transform infraröd (FTIR) spektroskopin av DBCO-NH2, PAA-UCNs och DBCO-UCNs presenteras i figur 4.
I cell experiment bekräftas framgångsrika uttryck för ChR2 på cellmembranet av den uppenbara gröna fluorescerande protein (GFP) markör (Venus) använder konfokalmikroskopi (figur 5A). De DBCO-UCNs är speciellt lokaliserade på ytan av ChR2-uttryckande HEK293 celler genom klicka reaktion (figur 5A). Den intracellulära kalcium analysen vid NIR ljus stimulering bekräftas även av confocal imaging och flöde flödescytometri (FCM) baserat på en standard fluorescerande Ca2 + indikator, Rhod-3 AM (figur 5B, C).
Figur 1. Syntesen av core-shell lanthanide-dopade UCNs. (A) Schematisk illustration av syntesprocessen för UCNs. (B, C) TEM för core (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0,5/1 %)) och core-shell (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) UCNs nanostrukturer. Skalstapeln: 50 nm. Infällt: HRTEM bilder av core och core-shell UCNs nanostrukturer. Skalstapeln: 5 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Syntesen av funktionella UCNs nanostrukturer. (A) Schematisk illustration av syntesprocessen ligand-fri UCNs, PAA-UCNs och DBCO-UCNs, respektive. (B, C, D) TEM bilder av ligand-fri UCNs, PAA-UCNs och DBCO-UCNs. Skalstapeln: 100 nm i panelen B och 50 nm i panelen C/D. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. FTIR spektroskopi av DBCO-NH2, PAA-UCNs och DBCO-UCNs, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Karakterisering av DBCO-UCNs i buffertlösning. (A) DLS resultaten av DBCO-UCNs. (B) Zeta potentiella resultat PAA-UCNs och DBCO-UCNs (genomsnitt ± SD). (C) UCL spektra av core och core-shell UCNs i hexan (1 mg/mL), PAA-UCNs och DBCO-UCNs i vatten (1 mg/mL) separat (Ex: 808 nm). Infällt: luminiscens fotografi av UCNs med 808 nm bestrålning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Cellulära applikationer av DBCO-UCNs vid NIR ljus belysning. (A) Confocal avbildning av ChR2-uttryckande N3-märkta HEK293 cellerna inkuberas med DBCO-UCNs (överst) och PAA-UCNs (nederst) för 2 h vid 100 µg/mL. Grön: ChR2-Venus (Ex: 488 nm, Em: 530/50 nm), blå: UCNs (Ex: 543 nm, Em: 580/50 nm). Skalstapeln: 20 µm. (B) cellulär Ca2 + bildbehandling med Rhod-3 före och efter NIR-ljus strålning (0.8 W/cm2 för 20 min). Ex: 561 nm, Em: 610/75 nm. Skalstapeln: 10 µm. (C) kvantitativa FCM analys av normaliserade fluorescensintensiteten hos cellulära Ca2 + med olika ljus doseringar belysning (medelvärde ± SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel har presenterat en metod för syntesen av core-shell lanthanide-dopade uppkonvertering nanokristaller (UCNs) och deras ytmodifiering med funktionella beståndsdelarna för cellulära applikationer. Denna roman nanomaterial äger enastående optiska egenskaper, som kan avge UV och synligt ljus på NIR ljus magnetisering genom en multi photon uppkonvertering process. I detta protokoll, core-shell UCNs nanostrukturerna (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) förbereds av en hög temperatur samfällning metod i en blandning av oljesyra och 1-octadecene. TEM bilder Visa morfologi av dessa core och core-shell nanokristaller är sfäriska form med en diameter på 20 nm och 30 nm respektive innebärande en shell tjocklek ca 5 nm (figur 1). Core-shell arkitekturen avslöjas också av hög upplösning TEM bilder i infällt i figur 1, som visar liknande väven fransar med kärnan UCNs nanostrukturer. Dessutom en typisk d-avstånd runt 0,52 nm stämmer väl överens med avståndet mellan (100) planet av β-NaYF4, som anger att alla core och core-shell UCNs nanostrukturerna är mycket kristalliserad och behålla samma kristallstrukturen. Uppkonvertering luminiscens spektra visar dessutom att core-shell nanokristaller avger stark blå utsläpp med en mycket högre intensitet på 480 nm än core partiklarna vid excitation med en diodlaser för att uppnå en kontinuerlig våg på 808 nm ( Figur 4 c). Förbättrad utsläpp av core-shell UCNs tillskrivs undertryckta ytan dämpar effekten av Yb3 +, Nd3 +och Tm3 + joner som är inbäddade i det inredda lagret av core-shell nanokristaller21. Dessa resultat bekräftar starkt framgångsrika utarbetandet av lanthanide-dopade core-shell UCNs nanomaterial i detta förslag.
Det finns flera kritiska steg i hög temperatur samfällning syntesen av dessa nanokristaller. Första volymen tillsatt av lanthanide ion stamlösning i syntesprocessen för de core och core-shell UCNs bör kontrolleras noggrant (steg 1.1.2.2). Hög nivå dopning joner kommer att resultera i en koncentration-relaterade cross-avkoppling eller släcka effekt på grund av Jon-Jon interaktion i nanokristaller21. För det andra, temperaturen bör hållas på mindre än 50 ° C att säkerställa fullständig kärnbildning efter NaOH och NH4F läggs in i kolven (steg 1.1.2.9 och 1.2.9), vilket är avgörande för att säkerställa en enhetlig morfologi genom att främja crystal tillväxt baserat på Ostwald mognande effekter22. För det tredje, storlek och optiska egenskaper av core-shell nanopartiklar kan styras huvudsakligen genom att justera mängden lanthanide joner i prekursorer av shell (Y3 + och Nd3 +) och som förberedda core partiklar (steg 1.2.1). Det är också viktigt att morfologi av core-shell nanokristaller bygger på anisotropisk shell tillväxten av olika typer av core partiklar, vilket är användbart för modulerande olika optiska utsläppen av UCNs vid NIR ljus belysning23.
Dessutom, är det också en stor utmaning att effektivt konvertera hydrofoba UCNs till hydrophilic UCNs nanopartiklar för ytterligare biologiska applikationer. Även om vissa metoder har rapporterats att förbättra biokompatibiliteten av UCNs i buffertlösning, inklusive ligand utbyte, silica beläggning, oleat-capping ligand oxidation, etc., lider de oväntade aggregering, tidskrävande, och komplexa förfaranden24,25,26. Häri, vi utvecklar en enkel metod för att få vatten-spridbar ligand-fri UCNs nanostrukturer genom att ta bort oljesyrehalt på ytan av oleate-capped UCNs i en vatten-lösning (pH = 4). PH-värdet justeras av HCl är kritiska att styra utgivningen av oleate ligand och påverka luminiscens av UCNs. Viktigare, en biokompatibel polymer (polyakryl syra, PAA) med ett stort antal carboxyl grupper kan länka med lanthanide jonerna på ytan av UCNs genom samordning interaktion, vilket kommer att ge mer funktionella grupper för ytterligare kemiska ändring. Därför, vi functionalize de DBCO-NH2 beståndsdelarna på ytan av UCNs för ytterligare specifika N3-taggade cellmembranet lokalisering. TEM bilder av ligand-gratis UCNs, PAA-UCNs och DBCO-UCNs i figur 2 visar stor systemdispertionen och löslighet av dessa nanostrukturer i buffertlösning efter ytmodifiering. Dessutom utfördes fourier transform infraröd (FTIR) spektroskopi för att karakterisera ytmodifiering av DBCO grupper på UCNs nanoplatform. Som visas i figur 3, starka bandet runt 3 430 cm-1 beror på H-O stretching vibrationer carboxyl grupper och de två banden centrerad på 1550 cm-1 och 1458 cm-1 är associerade med den asymmetriska och symmetrisk stretching vibrationslägen av bildas anjoner, som anger den framgångsrika beläggningen av COOH grupp-innehållande polymerer (PAA) på UCNP yta. Efter reaktion med DBCO-NH2 beståndsdelarna är ett uppenbart band på 1635 cm-1 närvarande baserat på C = C stretching vibrationer på aromatiska ring of DBCO grupper, vilket är förenligt med FTIR spectrumen av DBCO-NH2 beståndsdelarna på samma Vågtal. Dessutom dynamiska ljusspridning (DLS) resultatet indikerar ökad hydrodynamiska diametern på DBCO-UCNs i vattenlösning (96.4±10.4 nm) (figur 4A). Zeta potentiella resultaten indikerar också negativa ytan av PAA-UCNs (-26.1±4.4 mV) och DBCO-UCNs (-11.9±5.6 mV) respektive (figur 4B), visar den stora löslighet och stabilitet av dessa nanostrukturer i buffertlösning. Dessutom UCL spektra av PAA-UCNs och DBCO-UCNs visar att de kan avge liknande matas ut utsläpp på 480 nm på 808 nm ljus irradiation (figur 4 c), som kan utnyttjas för ytterligare NIR ljus-medierad ljusaktivering i biologiskt system.
Dessutom som ett proof-of-concept, för att demonstrera bioapplication av functionalized UCNs i levande celler, är en ljus-gated kanal protein (ChR2) konstruerad på cellytan att reglera de cellulära funktionerna av medla tillströmningen av ering joner (t.ex., Ca2 +) i cytoplasman27,28,29. Det framgångsrika uttrycket för ChR2 på membranet i raden HEK293 cell bekräftas av närvaron av grönt fluorescerande protein (GFP) markören (Venus) använder konfokalmikroskopi (figur 5A). Dessutom localizationen av UCNs på N3-märkta cellmembranet är uppenbarligen visualiseras på cellytan (blå) efter 2 h inkubation, som kan tillskrivas till faktumet de resterande DBCO grupperna på ytan av UCNs nanostrukturer färgas med en som innehåller natriumazid fluorescerande färgämne (5-carboxytetramethylrhodamine-natriumazid, Rhod-N3) genom den koppar-fri bioorthogonal Klicka på reaktion. Dessutom NIR ljus (808 nm) används för att bestråla den lokaliserade UCNs nanotransducer på cellytan, som kan aktiveraden ljus-gated ChR2 kanal proteiner och underlätta Ca2 + ion inflödet över membranet. Som visas i figur 5B, en betydande ökning av röd fluorescens i cytosolen följs av en fluorescerande Ca2 + standardindikator, Rhod-3 AM, medan ingen uppenbar fluorescens increment registreras i avsaknad av ljus belysning. Den kvantitativa Flödesanalys flödescytometri (FCM) i figur 5 c visar också att sådana NIR-ljus-lyhörd fluorescens förbättring är ljus-dosberoende, tyder klart på att de biokompatibla DBCO-UCNs effektivt kan reglera den kanal proteiner på cellmembranet på NIR-ljus bestrålning.
Sammanfattningsvis, baserat på ovan nämnda resultaten, vi räknar med att detta protokoll inte bara ger detaljerade experimentella rutiner för hög temperatur samfällning syntes av core-shell UCNs nanostrukturer, men utvecklar också en enkel teknik för biokompatibla ytmodifiering av UCNs för ytterligare NIR ljus-medierad ljusaktivering i biologiska applikationer. Viktigare, baserat på logiken bakom denna metod, UCNs optiska egenskaper kan ytterligare justeras av dopning olika sorters lanthanide joner (t.ex., Erbium (III), Holmium (III), etc.) i kristallerna att avge UV, grön, röd, och NIR ljus på 808 nm ljus bestrålning30. Dessutom kan UCNs ytan också ändras med olika funktionella grupper (t.ex., peptid, protein, lipider, inriktning ligand, etc.) för ytterligare biomedicinska tillämpningar31,32. Dessa fördelar gör biokompatibelt UCNs nanomaterial en lämplig kandidat för studiet av fysiologiska processer in vitro och in-vivo, och kan därmed fungera som personlig nanomedicin för kliniska theranostics i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete var delvis stöds av NTU-AIT-MUV NAM/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13) och (RG 35/15) tilldelas i Nanyang Technological University, Singapore och National Natural Science Foundation av Kina (NSFC) (nr 51628201).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octadecene | Sigma Aldrich | O806 | Technical grade |
| oleic acid | Sigma Aldrich | 364525 | Technical grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | Technical grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | A405 | Technical grade |
| Acetone | Fisher Scientific | A18 | Technical grade |
| Hexane | Sigma Aldrich | H292 | Technical grade |
| Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 367702 | 99.9% trace metals basis |
| Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 325805 | 99.9% trace metals basis |
| Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326011 | 99.9% trace metals basis |
| Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326046 | 99.9% trace metals basis |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | reagent grade |
| Ammonium fluoride (NH4F) | Sigma Aldrich | 338869 | ACS reagent |
| Hydrogen chloride (HCl) | Fisher Scientific | A144 | reagent grade |
| polyacrylic acid (PAA) | Sigma Aldrich | 323667 | average Mw 1800 |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma Aldrich | 54802 | ACS reagent |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E7750 | commercial grade |
| Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2) | Sigma Aldrich | 761540 | ACS reagent |
| N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma Aldrich | D125806 | ACS reagent |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231 | Technical grade |
| HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | human embryonic kidney |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | ACS reagent |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
| plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus) | Addgene | 15753 | Plasmid sent as bacteria in agar stab |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11965092 | High glucose |
| opti-Modified Eagle Medium (MEM) | Thermo Fisher | 51985034 | Reduced Serum Media |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000015 | Lipid-Based Transfection |
| N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz) | Sigma Aldrich | A7605 | ACS reagent |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | 25200056 | Phenol red |
| Rhod-3 AM Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | R10145 | Fluorescence dye |
| 5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3) | Sigma Aldrich | 760757 | Azide-fluor 545 |
| Confical dish | ibidi GmbH | 81158 | Glass Bottom, 35 mm |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | Polypropylene |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Polypropylene |
| 1.5 ml conical microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | Polypropylene |
| Phenylmethyl silicone oil | Clearco Products | 63148-52-7 | Less than 320 degrees Celsius |
| Glass thermometer | GH Zeal | L0111/10 | From -10 to 360 degrees Celsius |
| 12-well plate | Sigma Aldrich | Z707775 | Polystyrene |
References
- Wang, F., et al. Tuning upconversion through energy migration in core-shell nanoparticles. Nat Mater. 10 (12), 968-973 (2011).
- Liu, Y., et al. Amplified stimulated emission in upconversion nanoparticles for super-resolution nanoscopy. Nature. 543 (7644), 229-233 (2017).
- Fan, W., Bu, W., Shi, J. On The Latest Three-Stage Development of Nanomedicines based on Upconversion Nanoparticles. Adv Mater. 28 (24), 3987-4011 (2016).
- Zhu, X., et al. Temperature-feedback upconversion nanocomposite for accurate photothermal therapy at facile temperature. Nat Commun. 7, 10437-10446 (2016).
- Li, W., Wang, J., Ren, J., Qu, X. Near-infrared upconversion controls photocaged cell adhesion. J Am Chem Soc. 136 (6), 2248-2251 (2014).
- Min, Y., Li, J., Liu, F., Yeow, E. K., Xing, B. Near-infrared light-mediated photoactivation of a platinum antitumor prodrug and simultaneous cellular apoptosis imaging by upconversion-luminescent nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, D., Ma, P., Hou, Z., Cheng, Z., Li, C., Lin, J. Current advances in lanthanide ion (Ln(3+))-based upconversion nanomaterials for drug delivery. Chem Soc Rev. 44 (6), 1416-1448 (2015).
- Wang, C., Cheng, L., Liu, Z. Upconversion nanoparticles for photodynamic therapy and other cancer therapeutics. Theranostics. 3 (5), 317-330 (2013).
- Li, L. L., et al. Biomimetic surface engineering of lanthanide-doped upconversion nanoparticles as versatile bioprobes. Angew Chem Int Ed. 51 (25), 6121-6125 (2012).
- Wang, J., Ming, T., Jin, Z., Wang, J., Sun, L. D., Yan, C. H. Photon energy upconversion through thermal radiation with the power efficiency reaching 16%. Nat Commun. 5, 5669-5678 (2014).
- Zou, W., Visser, C., Maduro, J. A., Pshenichnikov, M. S., Hummelen, J. C. Broadband dye-sensitized upconversion of near-infrared light. Nat Photonics. 6 (8), 560-564 (2012).
- Liu, Y., Tu, D., Zhu, H., Li, R., Luo, W., Chen, X. A strategy to achieve efficient dual-mode luminescence of Eu(3+) in lanthanides doped multifunctional NaGdF(4) nanocrystals. Adv Mater. 22 (30), 3266-3271 (2010).
- Min, Y., Li, J., Liu, F., Padmanabhan, P., Yeow, E. K., Xing, B. Recent Advance of Biological Molecular Imaging Based on Lanthanide-Doped Upconversion-Luminescent Nanomaterials. Nanomaterials. 4 (1), 129-154 (2014).
- Li, X., Zhang, F., Zhao, D. Lab on upconversion nanoparticles: optical properties and applications engineering via designed nanostructure. Chem Soc Rev. 44 (6), 1346-1378 (2015).
- Gu, Z., Yan, L., Tian, G., Li, S., Chai, Z., Zhao, Y. Recent advances in design and fabrication of upconversion nanoparticles and their safe theranostic applications. Adv Mater. 25 (28), 3758-3779 (2013).
- Dong, H., Sun, L. D., Yan, C. H. Energy transfer in lanthanide upconversion studies for extended optical applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1608-1634 (2015).
- Ai, X., et al. In vivo covalent cross-linking of photon-converted rare-earth nanostructures for tumour localization and theranostics. Nat Commun. 7, 10432-10440 (2016).
- Lu, S., et al. Multifunctional Nano-Bioprobes Based on Rattle-Structured Upconverting Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 54 (27), 7915-7919 (2015).
- Bogdan, N., Vetrone, F., Ozin, G. A., Capobianco, J. A. Synthesis of ligand-free colloidally stable water dispersible brightly luminescent lanthanide-doped upconverting nanoparticles. Nano Lett. 11 (2), 835-840 (2011).
- Zheng, W., Huang, P., Tu, D., Ma, E., Zhu, H., Chen, X. Lanthanide-doped upconversion nano-bioprobes: electronic structures, optical properties, and biodetection. Chem Soc Rev. 44 (6), 1379-1415 (2015).
- Chen, X., Peng, D., Ju, Q., Wang, F.
- Wang, F., Deng, R., Liu, X. Preparation of core-shell NaGdF4 nanoparticles doped with luminescent lanthanide ions to be used as upconversion-based probes. Nat Protoc. 9 (7), 1634-1644 (2014).
- Chen, G., Agren, H., Ohulchanskyy, T. Y., Prasad, P. N. Light upconverting core-shell nanostructures: nanophotonic control for emerging applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1680-1713 (2015).
- Yang, Y., et al. In vitro and in vivo uncaging and bioluminescence imaging by using photocaged upconversion nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 51 (13), 3125-3129 (2012).
- Sedlmeier, A., Gorris, H. H. Surface modification and characterization of photon-upconverting nanoparticles for bioanalytical applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1526-1560 (2015).
- Hu, M., et al. Near infrared light-mediated photoactivation of cytotoxic Re(I) complexes by using lanthanide-doped upconversion nanoparticles. Dalton Trans. 45 (36), 14101-14108 (2016).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Ai, X., et al. Remote Regulation of Membrane Channel Activity by Site-Specific Localization of Lanthanide-Doped Upconversion Nanocrystals. Angew Chem Int Ed. 56 (11), 3031-3035 (2017).
- Xie, R., et al. In vivo metabolic labeling of sialoglycans in the mouse brain by using a liposome-assisted bioorthogonal reporter strategy. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5173-5178 (2016).
- Bansal, A., Zhang, Y. Photocontrolled nanoparticle delivery systems for biomedical applications. Acc Chem Res. 47 (10), 3052-3060 (2014).
- Yang, Y., Aw, J., Xing, B. Nanostructures for NIR light-controlled therapies. Nanoscale. 9 (11), 3698-3718 (2017).
- Ai, X., Mu, J., Xing, B.
