Summary
Se presenta un protocolo para la síntesis de core-shell dopados con lantánidos upconversion nanocristales (UCNs) y sus aplicaciones celulares para la regulación de la proteína de canal con iluminación de luz de infrarrojo cercano (NIR).
Abstract
Nanocristales de upconversion dopados con lantánidos (UCNs) han atraído mucha atención en los últimos años basados en sus propiedades ópticas controlables y prometedoras, que permiten la absorción de luz de infrarrojo cercano (NIR) y posteriormente se pueden convertir en multiplexado de las emisiones que se extienden sobre una amplia gama de regiones de la UV a la visible a NIR. Este artículo presenta detallados procedimientos experimentales para la síntesis de la coprecipitación de alta temperatura de UCNs core-shell que incorporar iones lantánidos diferentes de nanocristales para convertir eficientemente la excitación de NIR penetrable de tejido profundo (808 nm) en una emisión de azul fuerte a 480 nm. Controlando la modificación superficial con polímero biocompatible (ácido poliacrílico, PAA), el preparado como UCNs adquiere gran solubilidad en soluciones tampón. Los nanocristales hidrofílicas son más funcionalizados con ligandos específicos (cyclooctyne de dibencilo, DBCO) para la localización en la membrana celular. A luz NIR (808 nm) la irradiación, la emisión convertida azul puede activar con eficacia la proteína de canal luz-bloqueado en la membrana celular y regula específicamente la afluencia de cationes (p. ej., Ca2 +) en el citoplasma. Este protocolo proporciona una metodología factible para la síntesis de core-shell dopados con lantánidos UCNs y posterior modificación superficial biocompatible para aplicaciones de celulares más.
Introduction
En los últimos años, Nanocristales de upconversion dopados con lantánidos (UCNs) han sido ampliamente utilizados como una alternativa a los colorantes orgánicos convencionales y puntos cuánticos aplicaciones biomédicas, que se basan principalmente en su excelente química y propiedades ópticas, incluyendo gran biocompatibilidad, alta resistencia al fotoblanqueo y emisiones de banda estrecha1,2,3. Más importante aún, puede servir como un nanotransducer prometedor con tejido excelente penetración profundidad en vivo para convertir excitación de infrarrojo cercano (NIR) en una amplia gama de emisiones de la UV, visible y las regiones NIR a través de un multi-photon proceso de conversión ascendente de4,5. Estas características únicas hacen UCNs dopados con lantánidos servir como un vector especialmente prometedor para la detección biológica, la proyección de imagen biomédica y enfermedades teranosis6,7,8.
Los componentes generales de UCNs se basan principalmente en los iones lantánidos dopado en la matriz de host aislante que contiene un activador (por ejemplo, Yb3 +, Nd3 +) y un activador (por ejemplo, Tm3 +, Er3 +, Ho 3 +) en el cristal homogéneo9. La diferente óptica de emisión de los nanocristales se atribuye a la transición electrónica localizada dentro de los 4 orbitalesf de los dopantes de lantánido debido a su nivel de energía dispuesta como escala10. Por lo tanto, es fundamental para controlar con precisión el tamaño y la morfología de UCNs sintetizados con dopantes lantánido multicomponente. Por la derecha, algunos métodos prometedores han sido bien establecidas para la preparación de UCNs dopados con lantánidos, incluyendo descomposición térmica, alta temperatura Co-precipitación, síntesis hidrotermal, proceso sol-gel, etc.11 , 12 , 13 entre estos enfoques, el método de coprecipitación de alta temperatura es una de las estrategias más populares y convenientes para UCNs síntesis, que pueden ser controlados estrictamente para preparar deseado nanocristales de alta calidad con forma uniforme y distribución de tamaño en un relativamente corto tiempo de reacción y de bajo costo14. Sin embargo, mayoría nanoestructuras sintetizadas por este método están capped principalmente con ligandos hidrofóbicos tales como ácido oleico y oleylamine, que generalmente dificultan su bioapplication más debido a la limitada solubilidad del ligando hidrofóbico en solución acuosa 15. por lo tanto, es necesario realizar técnicas de modificación superficial adecuado para preparar UCNs biocompatibles en usos biológicos in vitro e in vivo.
Adjunto, presentamos el detallado procedimiento experimental para la síntesis de nanoestructuras de UCNs core-shell mediante el método de coprecipitación de alta temperatura y una técnica de modificación factible para funcionalizar polímero biocompatible en la superficie de UCNs para aplicaciones de celulares más. Este nanoplatform UCNs incorpora tres iones lantánidos (Yb3 +y3 +y Tm3 +) de los nanocristales para adquirir fuerte emisión azul (~ 480 nm) sobre excitación luz NIR a 808 nm, que tiene mayor profundidad de penetración en tejido vivo. Es bien sabido que Nd3 +-dopados UCNs mostrar efectos de absorción y calentamiento de agua minimizado en esta ventana espectral (808 nm) en comparación con el convencionales UCNs a 980 nm irradiación16,17, 18. Además, para utilizar el UCNs en sistemas biológicos, en primer lugar se quitan los ligandos hidrofóbicos (ácido oleico) en la superficie de UCNs por sonicación en solución ácida19. El ligando libre UCNs más se modifican con un polímero biocompatible (ácido poliacrílico, PAA) para la adquisición de gran solubilidad en soluciones acuosas20. Además, como una prueba de concepto en aplicaciones celulares, UCNs hidrofílicas son más funcionalizados con ligandos moleculares (cyclooctyne de dibencilo, DBCO) para una localización específica en el N3-etiqueta de la membrana de la célula. A luz NIR (808 nm) la irradiación, la emisión azul convertida a 480 nm puede activar con eficacia una proteína canal luz-bloqueado, channelrhodopsins-2 (ChR2), en la superficie de la célula y facilitar así la afluencia de cationes(por ejemplo, el ión Ca2 + ) a través de la membrana de las células vivas.
Este protocolo de video proporciona una metodología factible para la síntesis de UCNs dopados con lantánidos, modificación superficial biocompatible y bioapplication UCNs en células vivas. Las diferencias en las técnicas de síntesis y los reactivos químicos utilizados en crecimiento nanocrystal influirá el tamaño upconversion, morfología y distribución luminiscencia (UCL) espectros de nanoestructuras de UCNs final utilizado en experimentos de la célula. Este protocolo video detallado está preparado para ayudar a nuevos investigadores en este campo para mejorar la reproducibilidad de UCNs con el método de coprecipitación de alta temperatura y evitar los errores más comunes en UCNs modificación superficial biocompatible para más aplicaciones celulares.
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Protocol
PRECAUCIÓN: consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su uso. Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando se realiza la síntesis de UCNs a temperatura elevada (~ 290 ° C), incluyendo el uso de controles de ingeniería (campana extractora) y equipo de protección personal (p. ej., gafas, guantes, bata de laboratorio, Pantalón largo y zapatos cerrados).
1. síntesis de NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: nanocristales de core-shell de Nd(20%)
- síntesis de NaYF 4: nanoestructuras de base Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%)
- Preparación de los RE (CH 3 CO 2) 3, solución stock de NaOH, NH 4 F metanol
Nota: las tierras raras (RE) los iones lantánidos son itrio (Y), el iterbio (Yb), el Thulium (Tm) y el neodimio (Nd).- Disolver 500 mg Yttrium(III) acetato hidrato en 5 mL de metanol (100 mg/mL), 250 mg hidroxiacetato hidrato de iterbio (III) en 5 mL de metanol (50 mg/mL), hidrato de acetato de Tulio (III) en 1 mL de metanol (10 mg/mL), de 10 mg y 10 mg hidroxiacetato hidrato de neodimio (III) en 1 mL metha Nol (10 mg/mL) en viales de vidrio con un baño de limpieza ultrasónico de 2 minutos
- Combina 400 mg de NaOH en un tubo de centrífuga de 50 mL con 20 mL de metanol con baño ultrasónico de limpieza para preparar la solución madre de NaOH (20 mg/mL).
- Combinar 600 mg NH 4 F en un tubo de centrífuga de 50 mL con 30 mL de metanol con baño de limpieza ultrasonidos para preparar NH 4 F solución (20 mg/mL).
Nota: Coloque la solución de los complejos de lantánidos, NaOH y NH 4 F en viales de vidrio, sellar con parafilm y almacenar en un refrigerador a ~ 4 ° C hasta que se necesite. Las soluciones stock de metanol preparado son reemplazadas una vez cada 2 semanas.
- Preparación de NaYF 4: Yb/Tm/Nd núcleo nanoestructura
- pipetear 3 mL de ácido oleico y 7 mL de 1-Octadeceno en un matraz de tres-cuello 50 mL. Solución de
- combinar 1.089 mL de la Y (CH 3 CO 2) 3 solución madre, 0,608 mL del Yb (CH 3 CO 2) 3 solución madre, 83,6 μl del stock 3 Tm (CH 3 CO 2), y 128,5 μl de la solución madre de Nd (CH 3 CO 2) 3 en el matraz.
- Colocar un termómetro (rango de 0 - de 360 ° C) en el frasco y que su punta toque la solución. Colocar el matraz en un recipiente de vidrio con aceite de silicona phenylmethyl.
- Calentar la solución a 100 ° C con una placa de evaporación de metanol. Conectar el matraz a una línea de Schlenk con un colector de doble vacío/gas para eliminar el metanol residual y mantener la mezcla de reacción bajo vacío durante 2-3 minutos removiendo.
- Aumentar la temperatura a 150 ° C y mantener esta temperatura durante 60 minutos mantener una velocidad de 700 rpm de agitación durante la síntesis.
Nota: Ajustar una moderada velocidad de agitación para evitar salpicaduras de la solución. - Deje la placa y mantener el frasco a temperatura ambiente para permitir la solución enfríe lentamente.
Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí.
Solución - combinar 2 mL de NaOH metanol y 2,965 mL de NH 4 solución metanol F en un tubo de centrífuga de 15 mL. Apriete el tubo con la tapa y mezcle la solución potente mezcla en Vortex durante 5 s.
- Agregar la mezcla de F 4 NH NaOH lentamente en el matraz con una pipeta de vidrio durante 5 min.
- Aumentar la temperatura de la mezcla a 50 ° C y mantener esta temperatura durante 30 minutos
Nota: Ajuste la temperatura a no más de 50 ° C debido a la alta temperatura promoverá cristal nucleación y crecimiento. - Aumentar la temperatura (~ 100 ° C) para evaporar de metanol y conectar el matraz a una línea de Schlenk con un colector de doble vacío/gas para eliminar el metanol residual y mantener la mezcla de reacción bajo vacío para 2-3 min.
- Cambiar la posición de la llave de paso para llenar el matraz con el nitrógeno.
- Aumento de la temperatura hasta 290 ° C con una velocidad de calentamiento de ~ 5 ° C/min que la mezcla de reacción a 290 ° C 1,5 h.
- Deje la placa caliente y retire el matraz para permitir la mezcla de reacción se enfríe lentamente en temperatura agitación.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de la placa caliente con temperatura alta (> 400 ° C) para evitar quemaduras graves en contacto con la piel. - Transferencia de la mezcla en el frasco en un tubo de centrífuga de 50 mL. Enjuagar el matraz con 30 mL de etanol y transferir la solución al tubo de centrífuga.
- Centrifugar el producto a 4.000 x g por 8 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.
- Añadir 10 mL de hexano al tubo de centrífuga y volver a dispersar el producto con la sonicación (60 kHz, 240 W) durante 2 min.
- Añadir 30 mL de etanol al tubo. Desactivación del producto a 4.000 x g por 8 min y entonces descarte el sobrenadante.
- Volver a dispersar los productos sólidos en el fondo del tubo de centrífuga con 5 mL de hexano. Almacene la solución en un refrigerador a ~ 4 ° C para un siguiente paso.
Nota: La emisión de la conversión ascendente de UCNs core-shell es probada por las soluciones de irradiación con un 808 nm láser (2 W).
- Preparación de los RE (CH 3 CO 2) 3, solución stock de NaOH, NH 4 F metanol
- Preparación de NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: nanocristales de core-shell de Nd(20%)
- 3 mL de ácido oleico y 7 mL de 1-Octadeceno se combinan en un matraz de 50 mL tres-cuello. Añadir 1,082 mL de la solución 3 Y (CH 3 CO 2) y 2,87 mL de la solución madre de Nd (CH 3 CO 2) 3 en el matraz.
- Añadir la nanoestructura de núcleo obtenida (80 mg en 5 mL de hexano de paso 1.1.2.18) en el frasco mientras que revuelve.
- Colocar un termómetro (rango de 0 - de 360 ° C) en el frasco y que su punta toque la mezcla. Colocar el matraz en un recipiente de vidrio con aceite de silicona phenylmethyl.
- Calentar la mezcla a 100 ° C en la parte superior de la placa caliente para evaporar el metanol y hexano. Conectar el matraz a una línea de Schlenk con un colector de doble vacío/gas para eliminar el solvente residual y mantener la mezcla de reacción bajo vacío durante 2-3 minutos removiendo.
- Aumentar la temperatura a 150 ° C y mantener durante 60 minutos mantener la velocidad de agitación a 700 rpm en la síntesis de.
Nota: Ajustar una moderada velocidad de agitación para evitar salpicaduras de la solución. - Deje la placa caliente y retire el matraz para permitir que la solución se enfríe lentamente a temperatura ambiente.
Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí.
Solución - pipeta 2 mL de NaOH metanol y 2,965 mL de NH 4 solución metanol F en un tubo de centrífuga de 15 mL. Apriete el tubo con la tapa y mezcle la solución potente mezcla en Vortex durante 5 s.
- Agregar la mezcla en el matraz con una pipeta de vidrio poco a poco más de 5 min.
- Aumentar la temperatura de la mezcla a 50 ° C y mantener a 50 ° C durante 30 minutos
Nota: Ajuste la temperatura no superior a 50 ° C debido a la alta temperatura promoverá cristal nucleación y crecimiento. - Aumentar la temperatura (~ 100 ° C) para evaporar de metanol y conectar el matraz a una línea de Schlenk con un colector de doble vacío/gas para eliminar el metanol residual, manteniendo la mezcla de reacción bajo vacío para 2-3 min.
- Cambiar la posición de la llave de paso para llenar el matraz con el nitrógeno.
- Aumento de la temperatura hasta 290 ° C con una velocidad de calentamiento de ~ 5 ° C/min que la mezcla de reacción a 290 ° C 1,5 h.
- Deje la placa caliente y retire el matraz para permitir la mezcla de reacción se enfríe lentamente a temperatura ambiente mientras que revuelve.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de la placa caliente con temperatura alta (> 400 ° C) para evitar quemaduras graves en contacto con la piel. - Transferencia de la mezcla en el frasco en un tubo de centrífuga de 50 mL. Enjuagar el matraz con 30 mL de etanol y transferir la solución al tubo de centrífuga.
- Centrifugar el producto a 4.000 x g por 8 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.
- Añadir 10 mL de hexano al tubo de centrífuga y volver a dispersar el producto con la sonicación (60 kHz, 240 W) durante 2 min.
- Añadir 30 mL de etanol al tubo. Desactivación del producto a 4.000 x g por 8 min y entonces descarte el sobrenadante.
- Volver a dispersar los productos sólidos en el fondo del tubo de centrífuga con 5 mL de hexano. Almacene la solución en un refrigerador a ~ 4 ° C hasta que sea necesario.
Nota: La emisión de la conversión ascendente de UCNs core-shell es probada por las soluciones de irradiación con un 808 nm láser (2 W).
2. Síntesis de nanoestructuras de UCNs biocompatibles
- preparación de nanopartículas de UCNs ligando libre
- combinar 30 mL de etanol con el preparado como oleato-capped UCNs solución (paso 1.2.18) en un tubo de centrífuga de 50 mL. Centrifugar la mezcla a 4.000 x g por 8 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.
- Combinar 10 mL solución acuosa ácida (pH = 4) ajustada por ácido clorhídrico (0.1m) con el precipitado en el tubo de centrífuga de 50 mL y disolver el precipitado por sonicación (60 kHz, 240 W) durante 30 minutos
- Transferencia del frasco de la solución en un vaso con vigorosa agitación durante 2 h.
- Extracto de la solución acuosa con 30 mL de éter dietílico para quitar el ácido de oleico, repetir tres veces.
- Añadir 10 mL de agua en las capas de éter combinado con suave agitación.
- Recoger la acuosa fase juntos (20 mL) y añadir acetona 20 mL con Vortex durante 5 s.
- Vuelta abajo el producto a 35.000 × g por 10 min y luego descartar el sobrenadante. Disolver el precipitado en 2 mL de agua.
- Preparación de polímero modificado UCNs (PAA-UCNs)
- combinar 200 mg de ácido poliacrílico (PAA, Mw = 1.800) con 20 mL de agua por sonicación (60 kHz, 240 W) durante 20 min agregar el mencionado UCNs ligando libre en la solución PAA con agitación vigorosa.
- Ajustar el pH a 7,4 con solución de NaOH (1 M) con sonicación (60 kHz, 240 W) de 30 minutos que la mezcla por 24 h a temperatura ambiente mientras que revuelve.
- Recoger el precipitado por centrifugación a 35.000 × g por 10 minutos vuelva a suspender el producto en 10 mL de agua por sonicación (60 kHz, 240 W) por 5 min y centrifugar nuevamente a 35.000 × g por 10 min repiten este paso tres veces.
- Volver a dispersar el producto en 8 mL de agua por sonicación (60 kHz, 240 W) para 5 minutos almacene la solución en un refrigerador a ~ 4 ° C hasta que sea necesario.
- Preparación de nanopartículas de UCNs DBCO funcional
- giro de la PAA@UCNs como preparado (1 mg) por centrifugación a 35.000 × g por 10 minutos Resuspender el precipitado en 1 mL seco DMF por sonicación (60 kHz, 240 W) durante 1 min. y centrifugar nuevamente a 35.000 × g durante 10 minutos repetir este paso dos veces. Disolver el precipitado en 200 μL de
- seco DMF en un frasco de vidrio. Añadir TOHB (12,2 mg), EDC (14 mg), DBCO-NH 2 (5 mg) y DIPEA (16 μL) en el frasco con agitación magnética de 24 h.
- Recoger el producto por centrifugación a 35.000 × g por 10 minutos quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de DMSO y centrifugar nuevamente a 35.000 × g por 10 min Repita este paso tres veces.
- De la dispersión del producto en DMSO 0.2 mL y almacenar en un refrigerador a ~ 4 ° C antes de su uso.
3. Bioapplications de la DBCO-UCNs en los canales de regulación de membrana en las células de vida
- cultura la HEK293 células Dulbecco ' s Modified Eagle ' s medio (DMEM) suplementado con 10% FBS, 100 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 100 μg/mL y mantienen en una incubadora humidificada con 5% CO 2 en las células de semillas de C. 1 × 10 5 37 en 1 mL DMEM/pozo de una placa de 12 pozos y mantenerlo en la incubadora durante 24 h.
- Combinan el plásmido (pCAGGS-ChR2-Venus, 1 μg) con el reactivo de transfección de P3000 (2 μL) en Eagle ' s medio esencial mínimo (MEM) (100 μL) tubo de microcentrífuga y añadir Reactivo de transfección (1,5 μl) en MEM (100 μL) en el tubo B.
- Incubar la mezcla de soluciones en los tubos A y B durante 10 min a temperatura ambiente.
- La solución en el tubo A y B se combinan con 400 μL de MEM. Lavar las células con 1 mL de DMEM libre de suero dos veces.
- Añadir la mezcla de transfección de 600 μL en cada pocillo de una placa de 12 pozos e incubar las células en incubadora de 37 ° C por 4 h. quitar el medio y lavar dos veces con 1 mL DMEM.
- Añadir 1 mL de DMEM que contiene 1 μl Ac 4 ManNAz (50 mM en DMSO) en el pozo y mantenerlo en la incubadora por 2 días.
- Quitar el medio y lavar una vez con 1 mL de PBS. Añadir 1 mL de solución de tripsina-EDTA (0.25%) en cada pocillo de la placa de 12 pozos e incubar a 37 ° C hasta que las células han separado (~ 2 minutos). Volver a cultura las células en un plato confocal en el 1 × 10 5 células/pozo en 1 mL DMEM para pasar la noche.
- Quite el medio y añadir 1 mL de DMEM fresco con 2 μl DBCO-UCNs (50 mg/mL) en el plato por 2 h a 37 ° C. Para la proyección de imagen confocal, lavan las células dos veces con DMEM y añadir 1 μl Rhod-N 3 (10 mM) para 30 minutos
- Para el análisis de calcio intracelular, incubar las células con la mezcla de 1 μl de Rhod-3 AM (10 mM), 10 μl probenecida (250 mM) y 10 μl de tampón de carga (Pluronic surfactante polyols,0.1% w/v)) en medio DMEM de 1 mL por 30 min en la oscuridad.
- Lavar las células con DMEM libre de suero e irradiar con luz NIR de 808 nm en la dosis de 0,8 W/cm 2 durante 20 minutos (rotura de 5 min después de 5 min iluminación).
- Registrar los resultados de los proyección de imagen en el microscopio confocal (fuente de laser: 561 nm láser, rango de detector: 610/75 nm; objetivo: 100 x 1.4 NA aceite, tiempo de exposición: 100 ms). Añadir 1 mL de solución de tripsina-EDTA (0.25%) en cada pocillo e incubar a 37 ° C hasta que las células han separado (~ 2 minutos). Resuspenda las células en 1 mL de PBS para el análisis de flujo cytometry (FCM) (Ex: 561 nm, Em: 582/15 nm).
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Representative Results
El proceso de síntesis esquemática de core-shell UCNs dopados con lantánidos se muestran en la figura 1 y figura 2. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) e imágenes de microscopia electrónica (HRTEM) transmisión de alta resolución de nanoestructuras de UCNs core y core-shell obtuvieron respectivamente (figura 1). El ligando libre UCNs preparados quitando el ácido oleico hidrofóbico en la superficie de UCNs en solución ácida y modificados con polímero hidrofílico (PAA). Entonces el COOH-capped PAA-UCNs son funcionalizados con DBCO-NH2 por una reacción de condensación de amida. Las imágenes TEM de ligando libre UCNs, PAA UCNs y UCNs DBCO se muestran en la figura 2. La dispersión ligera dinámica (DLS), resultados de potencial zeta y espectros de luminiscencia (UCL) de conversión ascendente de UCNs DBCO se recogen respectivamente (figura 3). La espectroscopia infrarroja de (FTIR) fourier transforma de la DBCO-NH2, PAA UCNs y UCNs DBCO se presentan en la figura 4.
En experimentos de la célula, la expresión exitosa de ChR2 en la membrana celular es confirmada por el marcador obvio proteína verde fluorescente (GFP) (Venus) usando microscopia confocal (figura 5A). DBCO-UCNs se localizan específicamente en la superficie de las células HEK293 expresar ChR2 por haga clic en la reacción (figura 5A). El análisis de calcio intracelular sobre el estímulo de luz NIR también es confirmado por citometría flujo y proyección de imagen confocal (FCM) basado en un estándar fluorescente Ca2 + indicador, Rhod-3 AM (figura 5B, C).
Figura 1. Síntesis de core-shell lantánido-dopado UCNs. (A) ilustración esquemática de los procesos de síntesis de UCNs. (B, C) TEM del núcleo (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1 %)) y core-shell (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) UCNs nanoestructuras. Barra de escala: 50 nm. Empotrado: Imágenes de nanoestructuras de UCNs core y core-shell HRTEM. Barra de escala: 5 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Síntesis de nanoestructuras funcionales de UCNs. (A) ilustración esquemática de los procesos de síntesis de ligando UCNs PAA UCNs y DBCO-UCNs, respectivamente. (B, C, D) Imágenes TEM de ligando libre UCNs, PAA UCNs y DBCO UCNs. Barra de escala: 100 nm en el panel B y 50 nm en panel C/D. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Espectroscopía FTIR de la DBCO-NH2, PAA UCNs y DBCO-UCNs, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Caracterización de UCNs DBCO en tampón de. (A) resultados DLS de UCNs DBCO. (B) resultados de potencial de Zeta de UCNs PAA y DBCO-UCNs (media ± SD). (C) espectros UCL de UCNs core y core-shell en hexano (1 mg/mL), PAA UCNs y DBCO-UCNs en agua (1 mg/mL) por separado (Ex: 808 nm). Recuadro: fotografía de luminiscencia de UCNs 808 irradiación nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Aplicaciones celulares de DBCO-UCNs sobre NIR luz iluminación. (A) la proyección de imagen Confocal de expresar ChR2 N3-tagged células HEK293 incubadas con DBCO-UCNs (arriba) y PAA-UCNs (abajo) durante 2 h a 100 μg/mL. Verde: ChR2-Venus (Ex: 488 nm, Em: 530/50 nm), azul: UCNs (Ex: 543 nm, Em: 580/50 nm). Barra de escala: 20 μm. (B) celular Ca2 + proyección de imagen con Rhod-3 h antes y después de la irradiación de luz NIR (0.8 W/cm2 por 20 min). Ej.: 561 nm, Em: 610/75 nm. Barra de escala: 10 μm. (C) FCM cuantitativas análisis de la intensidad de fluorescencia normalizado de celular Ca2 + con iluminación de diferentes dosis de luz (media ± SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este artículo presenta un método para la síntesis de core-shell dopados con lantánidos upconversion nanocristales (UCNs) y su modificación superficial con grupos funcionales para aplicaciones de celulares. Este nuevo nanomaterial posee excepcionales propiedades ópticas, que pueden emitir rayos UV y luz visible sobre excitación luz NIR a través de un proceso de conversión ascendente del multi-photon. En el presente Protocolo, las nanoestructuras de UCNs core-shell (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) se preparan por un método de coprecipitación de alta temperatura en una mezcla de ácido oleico y 1-Octadeceno. Imágenes TEM demuestran la morfología de estos core y core-shell nanocristales son esféricos en forma con un diámetro de 20 nm y 30 nm respectivamente, lo que implica un grosor de cáscara de aproximadamente 5 nm (figura 1). La arquitectura de core-shell también es revelada por las imágenes TEM de alta resolución en el recuadro de la figura 1, que muestra franjas de enrejado similar con eso de la base UCNs nanoestructuras. Por otra parte, un típico d-espaciado alrededor de 0.52 nm está de acuerdo con la distancia entre el plano (100) de la β-NaYF4, indicando que todos los core y core-shell UCNs nanoestructuras son altamente cristalizados y mantienen la misma estructura cristalina. Además, los espectros de luminiscencia de upconversion demuestran el core-shell nanocristales emiten emisión azul fuerte con una intensidad mucho mayor a 480 nm que las partículas del núcleo sobre la excitación con un láser de diodo para lograr una onda continua en 808 nm ( Figura 4). La mayor emisión de UCNs core-shell se atribuye a la superficie suprimida apagando el efecto de Yb3 +y3 +y Tm3 + iones que están incrustados en la capa interior del core-shell nanocristales21. Estos resultados confirman fuertemente la preparación exitosa de dopados con lantánidos core-shell UCNs nanomaterial en esta propuesta.
Hay varios pasos esenciales en la síntesis de la coprecipitación de alta temperatura de estos nanocristales. En primer lugar, el volumen agregado de la solución madre de iones lantánidos en el proceso de síntesis de las UCNs core y core-shell debe ser estrictamente controlado (paso 1.1.2.2). Alto nivel doping iones provocará una relajación transversal relacionado con la concentración o apagando el efecto debido a la interacción ion-ion en los nanocristales21. En segundo lugar, la temperatura debe mantenerse a menos de 50 ° C para asegurar carga completa después de NaOH y NH4F se agregan en el matraz (paso 1.1.2.9 y paso 1.2.9), que es importante garantizar una morfología uniforme por promover el crecimiento del cristal basado en Ostwald maduración efectos22. En tercer lugar, el tamaño y propiedades ópticas de nanopartículas core-shell pueden principalmente controlar ajustando la cantidad de iones lantánidos en los precursores de la cáscara (Y3 + y Nd3 +) y las partículas como preparado base (paso 1.2.1). También es importante que la morfología de los nanocristales de core-shell se basa en el crecimiento anisotrópico cáscara de diferentes tipos de partículas fundamentales, que sirve para modular las emisiones ópticas diferentes de UCNs sobre NIR iluminación ligera23.
Además, también es un desafío considerable para convertir eficazmente UCNs hidrofóbicos a nanopartículas de UCNs hidrofílicas para más aplicaciones biológicas. Aunque se han divulgado algunos métodos para mejorar la biocompatibilidad de UCNs en solución tampón, incluyendo intercambio de ligando, capa de sílice, oxidación de ligando oleato-capsular, etc., sufren de agregación inesperada, mucho tiempo, y procedimientos complejos24,25,26. Aquí, desarrollamos un enfoque simple para obtener nanoestructuras de UCNs ligando libre agua dispersible quitando el ácido oleico en la superficie de UCNs tope de oleato en una solución de agua ácida (pH = 4). El valor de pH ajustado por HCl es fundamental para controlar la liberación de ligando de oleato y afectan la luminiscencia de UCNs. Más importante aún, un polímero biocompatible (ácido poliacrílico, PAA) con un gran número de carboxyl grupos pueden enlazar con los iones lantánidos en la superficie de UCNs por interacción de coordinación, que proporcionará más grupos funcionales de química más modificación. Por lo tanto, nos funcionalizar las moléculas de2 DBCO-NH en la superficie de UCNs más específica N3-con la etiqueta de localización de la membrana de la célula. Las imágenes TEM de ligando libre UCNs PAA UCNs y DBCO-UCNs en la figura 2 demuestran el gran dispersidad y las solubilidad de estas nanoestructuras en solución tampón después de modificación superficial. Además, fourier transforma infrarrojo (FTIR) la espectroscopia fue realizada para caracterizar la modificación superficial de grupos DBCO en nanoplatform UCNs. Como se muestra en la figura 3, la cinta fuerte de 3.430 cm-1 es debido a la vibración de estiramiento H-O de los grupos carboxilo, y las dos bandas centradas en 1550 cm-1 y 1458 cm-1 se asocian con el asimétrico y modos de vibración estiramiento simétrico de los aniones carboxilato, que indica el éxito recubrimiento de polímeros de que contiene el grupo COOH (PAA) en la superficie UCNP. Después de la reacción con moléculas de DBCO-NH2 , una banda obvio en 1.635 cm-1 está presente basado en el C = C estirar la vibración en el anillo aromático de grupos de la DBCO, que es consistente con el espectro FTIR de moieties de DBCO-NH2 al mismo Wavenumber. Por otra parte, el resultado de la dispersión ligera dinámica (DLS) indica que el mayor diámetro hidrodinámico de UCNs DBCO en solución acuosa (96.4±10.4 nm) (Figura 4A). Los resultados de potencial zeta también indican la superficie negativa de UCNs PAA (-26.1±4.4 mV) y UCNs DBCO (-11.9±5.6 mV) respectivamente (Figura 4B), demostrando la gran solubilidad y estabilidad de estas nanoestructuras en solución tampón. Además, los espectros de la UCL de UCNs PAA y UCNs DBCO demuestran que puede emitir emisiones de producir similares a 480 nm a 808 nm irradiación de la luz (figura 4), que puede ser utilizadas para más NIR mediada por luz fotoactivación en biológico sistemas.
Además, como una prueba de concepto, con el fin de demostrar el bioapplication de UCNs funcionalizados en células vivas, una proteína de canal luz-bloqueado (ChR2) está diseñada en la superficie de la célula para regular las funciones celulares por mediación de la afluencia de iones catión (p. ej., Ca2 +) en el citoplasma27,28,29. La acertada expresión de ChR2 en la membrana de las células HEK293 se confirma por la presencia de la proteína verde fluorescente (GFP) marcador (Venus) usando microscopia confocal (figura 5A). Por otra parte, la localización de UCNs en N3-etiquetada membrana celular obviamente se visualiza en la superficie de la célula (azul) después de 2 h de incubación, que puede ser atribuida al hecho de que los grupos DBCO residual en la superficie de UCNs nanoestructuras se tiñen con un colorante fluorescente que contiene azida (5-carboxytetramethylrhodamine-azida, Rhod-N3) a través de la bioorthogonal libre de cobre, haga clic en la reacción. Además, luz NIR (808 nm) se utiliza para irradiar la nanotransducer UCNs localizada en la superficie celular, que puede activar ella ChR2 cerrada luz proteínas de canal y facilitar la afluencia de Ca2 + ion a través de la membrana. Como se muestra en la figura 5B, se observó un aumento significativo de fluorescencia roja en el citosol por un estándar fluorescente Ca2 + indicador, Rhod-3 AM, mientras que no hay incremento de fluorescencia aparente se registra en la ausencia de luz. El análisis de citometría (FCM) cuantitativa del flujo en la figura 5 también demuestra que tal realce de fluorescencia NIR-luz-sensible es dosis-dependientes de la luz, claramente, lo que sugiere que la DBCO-UCNs biocompatibles pueden regular con eficacia la proteínas de canal en la membrana celular a la irradiación de luz NIR.
En Resumen, basándose en los resultados antes mencionados, esperamos que el presente Protocolo no sólo proporciona procedimientos experimentales para la síntesis de la coprecipitación de alta temperatura de nanoestructuras de UCNs core-shell, pero también convierte un simple técnica de modificación superficial biocompatible de UCNs para más NIR mediada por luz fotoactivación en aplicaciones biológicas. Más importante aún, basado en el fundamento de este método, las propiedades ópticas de UCNs más regulable por dopaje de diferentes tipos de iones lantánidos (p. ej., Erbio (III), Holmio (III), etc.) en los cristales que emiten rayos UV, verde, rojo, y Luz sobre 808 nm irradiación de la luz30de NIR. Por otra parte, la superficie de UCNs puede también modificarse con diferentes grupos funcionales (p. ej., péptido, proteína, lípido, dirigidos a ligando, etc.) para más aplicaciones biomédicas31,32. Estas ventajas hacen de nanomateriales biocompatibles de UCNs un candidato adecuado para el estudio de procesos fisiológicos in vitro e in vivoy así pueden actuar como nanomedicina personalizada de teranosis clínica en el futuro.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado parcialmente por NTU-AIT-MUV NAM/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13) y (RG 35/15) otorgado en Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur y nacional Ciencias naturales Fundación de China (NSFC) (núm. 51628201).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octadecene | Sigma Aldrich | O806 | Technical grade |
| oleic acid | Sigma Aldrich | 364525 | Technical grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | Technical grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | A405 | Technical grade |
| Acetone | Fisher Scientific | A18 | Technical grade |
| Hexane | Sigma Aldrich | H292 | Technical grade |
| Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 367702 | 99.9% trace metals basis |
| Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 325805 | 99.9% trace metals basis |
| Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326011 | 99.9% trace metals basis |
| Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326046 | 99.9% trace metals basis |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | reagent grade |
| Ammonium fluoride (NH4F) | Sigma Aldrich | 338869 | ACS reagent |
| Hydrogen chloride (HCl) | Fisher Scientific | A144 | reagent grade |
| polyacrylic acid (PAA) | Sigma Aldrich | 323667 | average Mw 1800 |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma Aldrich | 54802 | ACS reagent |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E7750 | commercial grade |
| Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2) | Sigma Aldrich | 761540 | ACS reagent |
| N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma Aldrich | D125806 | ACS reagent |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231 | Technical grade |
| HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | human embryonic kidney |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | ACS reagent |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
| plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus) | Addgene | 15753 | Plasmid sent as bacteria in agar stab |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11965092 | High glucose |
| opti-Modified Eagle Medium (MEM) | Thermo Fisher | 51985034 | Reduced Serum Media |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000015 | Lipid-Based Transfection |
| N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz) | Sigma Aldrich | A7605 | ACS reagent |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | 25200056 | Phenol red |
| Rhod-3 AM Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | R10145 | Fluorescence dye |
| 5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3) | Sigma Aldrich | 760757 | Azide-fluor 545 |
| Confical dish | ibidi GmbH | 81158 | Glass Bottom, 35 mm |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | Polypropylene |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Polypropylene |
| 1.5 ml conical microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | Polypropylene |
| Phenylmethyl silicone oil | Clearco Products | 63148-52-7 | Less than 320 degrees Celsius |
| Glass thermometer | GH Zeal | L0111/10 | From -10 to 360 degrees Celsius |
| 12-well plate | Sigma Aldrich | Z707775 | Polystyrene |
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