Forberedelse af primære akut lymfoblastær leukæmiceller i forskellige cellecyklus faser af Centrifugal Elutriation
Summary
Denne protokol beskriver brugen af centrifugal elutriation til at adskille primære akut lymfoblastær leukæmiceller i forskellige cellecyklus faser.
Abstract
Evnen til at synkronisere celler har været central for fremme vores forståelse af cellecyklus regulering. Fælles anvendte teknikker inkluderer serum afsavn; kemikalier som arrestere celler på forskellige cellecyklus faser; eller brug af mitotiske shake-off som udnytter deres reducerede tilslutning. Dog har alle disse ulemper. For eksempel, fungerer serum sult godt for normale celler, men mindre godt for tumorceller med kompromitteret cellecyklus checkpoints på grund af onkogen aktivering eller tumor suppressor tab. Ligeledes kan kemisk behandlet cellepopulationer harbor narkotika-induceret skade og Vis stress-relaterede ændringer. En teknik, der omgår disse problemer er counterflow centrifugal elutriation (CCE), hvor celler er udsat for to modsatrettede kræfter, centrifugalkraften og væske velocity, hvilket resulterer i adskillelsen af celler på baggrund af størrelse og tæthed. Da celler rykke frem gennem cyklussen typisk forstørre, kan CCE bruges til at adskille celler i forskellige cellecyklus faser. Her anvender vi denne teknik til primære akut lymfoblastær leukæmiceller. Under optimale betingelser, kan en hovedsagelig ren befolkning af celler i G1 fase og en yderst højberiget befolkning af celler i G2/M faser fås i glimrende udbytte. Disse cellepopulationer er velegnet til at studere cellecyklus-afhængige virkningsmekanismer af anticancer narkotika og andre programmer. Vi også vise, hvordan ændringer til standard procedure kan resultere i ikke-optimal ydeevne og diskutere begrænsningerne af teknikken. Den detaljerede metodologi præsenteret bør lette anvendelsen og udforskning af teknikken til andre typer af celler.
Introduction
Dyrkede celler typisk vokse asynkront og enkelte celler findes i forskellige faser af cellecyklus. Nogle organismer udstille naturligt synkron celle cykler eller kan synkroniseres ved specifikke fysiologiske stimuli. For eksempel, kløft kerner i gigantiske plasmodia af slim skimmel Physarum polycephalum i en særdeles synkron mode1, og celler af grønalger Desmodesmus quadricauda kan synkroniseres ved vekslende lyse og mørke perioder2. Mens disse skadeorganismer tilbyder unikke eksperimentelle attributter, model de utilstrækkeligt kompleksiteten i pattedyrsceller. Evnen til at kunstigt synkronisere pattedyr cellepopulationer har været central for fremme vores forståelse af celle cyklus regulering og det molekylære grundlag af cellecyklus checkpoints. Almindelige metoder omfatter serum afsavn, kemiske blok og frigivelse, eller at udnytte fysiske egenskaber3,4. Tilbagetrækning af serum får ofte cellerne til at indtaste ubevægelighed, og fornyet tilsætning af serum fremmer celle cyklus genindtræden i G1 fase5. Kemiske hæmmere omfatter agenter som overskydende thymidine eller hydroxyurea som blokere cellerne i G1/S grænsen eller mikrotubulus-hæmmere, som typisk arrestere celler i M fase3,4. Tilgange, der udnytter fysiske egenskaber omfatte mitotiske shake-off som kan bruges til at berige for mitotiske celler, da de er mindre klæbende end interphase celler6. Men alle disse teknikker har potentielle ulemper. For eksempel, bevare ikke alle celletyper levedygtighed i mangel af serum eller tilstedeværelsen af kemiske hæmmere, og udbyttet af celler efter mitotiske shake-off er begrænset uden forudgående synkronisering med mitotiske hæmmere.
Med undtagelse af tidlige embryonale cellen cyklusser, hvor celler gradvist falde i størrelse, som de deler7, de fleste celler gennem cyklussen gennemgå vækst faser og blive større. Denne egenskab udnyttes i en teknik, counterflow centrifugal elutriation (CCE), som kan bruges til at adskille celler forskellige i størrelse og dermed i cellecyklus fase8,9. Under CCE, celler er under indflydelse af to modsatrettede kræfter: centrifugalkraft, der driver celler væk fra rotationsaksen, og væske velocity (counterflow), der driver celler mod rotationsakse (figur 1). Celler i elutriation kammer nå en ligevægt stilling hvor disse kræfter er ens. Nøglefaktorerne dikterer ligevægt stilling er celle diameter og densitet. Som strømmen sats stødpudeopløsning er øget og counterflow træk kraft opvejer centrifugalkraften, en ny ligevægt er etableret, forårsager en ændring i holdning af celler inde i salen. Alle celler er flyttet mod salen exit, resulterer i mindre virksomheder forlader salen først, mens de større celler blive inden for sal, indtil counterflow er steget tilstrækkeligt til at fremme deres exit. Cellerne undslippe elutriation salen med på hinanden følgende stigninger i counterflow sats kan indsamles i bestemte fraktioner og hver fraktion indeholder celler af sekventielt stigende størrelser. I stedet for at gennemføre elutriation med mindre stigninger i counterflow sats, vil sekventiel falder i centrifugalkraften ved faldende centrifugering hastighed opnå det samme resultat. Processen med elutriation kræver optimering afhængigt af celletype, elutriation buffer ansat, og de specifikke apparater, der anvendes. Satsen for sedimentation af celler under disse betingelser er bedst beskrives ved Stokes lov: SV = [d2(Rhop– Rhom) / 18η] .ω2r, hvor SV = sedimentering hastighed; d = diameter af partikler; Rhop = massefylde af partiklen; Rhom = massefylde af buffer; Η = viskositet af buffer; Ω = vinkelhastighed rotorens; og r = radiale position af en partikel. Således SV er proportional med celle diameter og densitet, og da diameter er opløftet til anden potens, det bidrager mere væsentligt end tæthed, som er generelt konstant gennem cellecyklus.
En vigtig fordel af CCE er, at cellerne ikke udsættes for barske betingelser for kemisk behandling eller ernæringsmæssige afsavn og kan inddrives i fremragende udbyttet hovedsagelig uforstyrrede. Et krav er, at de pågældende celler undergår en betydelig stigning i diameter på mindst 30%, når de krydser den celle cyklus. Den største ulempe er udgifterne til det specialiserede centrifuge, rotor og tilbehør. Ikke desto mindre har evnen til at forberede celler beriget med specifikke cellecyklus faser af CCE høj grad lettet celle cyklus forskning i organismer fra gær til pattedyrceller9,10. Derudover udvider de seneste fremskridt anvendelser til separation af celler fra sunde versus cancervævet, adskillelse af forskellige celletyper i heterogene blandinger, og at produktionen af specifikke celletyper for immunterapi9.
Vores store interesse har været i forståelse af virkningsmekanismen af mikrotubulus målretning agenter (MTA’er) som vinca alkaloider og taxanes. Disse lægemidler blev anset for at handle udelukkende i mitosen, blokerer spindel mikrotubulus funktion11,12, men de seneste tyder på, de kan også være rettet mod interphase mikrotubuli13,14. Vi har for nylig rapporteret, at primære akut lymfoblastær leukæmi (alle) celler gennemgå død i enten G1-fase eller i M fase når behandlet med Vincristin og andre MTA’er i en celle cyklus-afhængige måde15. Evnen til at adskille alle celler i forskellige cellecyklus faser af CCE var medvirkende til at nå frem til denne konklusion. I denne artikel vil vi beskrive de tekniske detaljer og tilbyde praktiske tips til anvendelsen af CCE til forberedelse af primær alle celler i forskellige cellecyklus faser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrevet en metode til at indhente primære alle celler i forskellige faser i cellecyklus ved hjælp af CCE. Under optimale betingelser en hovedsagelig ren befolkning af celler i G1 fase og en yderst højberiget befolkning af celler i G2/M faser kunne let opnås i fremragende udbytte, og celler stærkt beriget i S fase kan også fås, hvis det ønskes. Resultaterne præsenteres her blev opnået med en primær alle kultur (specifikt, ALL-5), og det væsentlige identiske resultater er opnået med en uafhængig kult…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH CA109821 (til TCC). Vi takker Beckman Coulter for generøst at give midler til at dække udgifter og teknisk bistand i opsætning og drift af elutriation systemet. Vi takke Dr. Fred Falkenburg for at give første primære alle kulturer.
Materials
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD – 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
- Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
- Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
- Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
- Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
- Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
- Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
- Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
- Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
- Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
- Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
- Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
- Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
- Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).
