Summary
Этот протокол описывает использование центробежных сцеживания для разделения клетки первичной острый лимфобластный лейкоз на фазы различных клеточного цикла.
Abstract
Возможность синхронизации клеток был центральным для продвижения нашего понимания регуляции клеточного цикла. Общие методы, используемые включают лишение сыворотки; химические вещества, которые аресту клеток в разных клеточного цикла этапов; или использование митотическая трясти-Off которая эксплуатирует их снижение присоединения. Однако все из них имеют недостатки. Например голод сыворотки работает хорошо для нормальных клеток, но менее хорошо для опухолевых клеток с нарушенной клеточного цикла контрольно-пропускных пунктах из-за потери подавитель онкогена активации или опухоли. Аналогичным образом химически обработанную клеточных популяций может гавани наркотиков индуцированного повреждения и показать изменения, связанные со стрессом. Техника, которая обходит эти проблемы — противотоком центробежные сцеживания (КЦВ), где клетки подвергаются два противостоящих сил, центробежная сила и скорость жидкости, которая приводит к разделение ячеек на основе размера и плотности. Поскольку клетки продвижения через цикл обычно увеличить, КЦВ может использоваться для разделения клетки на фазы различных клеточного цикла. Здесь мы применяем этот метод к клеткам первичных острый лимфобластный лейкоз. При оптимальных условиях по существу чисто населения клеток в фазе G1 и высокообогащенного популяция клеток в фазы G2/М можно получить отличные урожайности. Эти популяции клеток идеально подходят для изучения механизмов клеточного цикла зависимые действия противоопухолевых препаратов и других приложений. Мы также показать, как изменения стандартной процедуры может привести к неоптимальной производительности и обсудить недостатки метода. Подробная методология представлена должно облегчить применение и разведки технику для других типов клеток.
Introduction
Культивируемых клеток обычно растут асинхронно и отдельные клетки присутствуют в различных стадиях клеточного цикла. Некоторые организмы демонстрируют естественно синхронных клеток циклов или могут быть синхронизированы с конкретных физиологических раздражителей. Например ядра в гигантских плазмодия миксомицеты Physarum polycephalum разделить в весьма синхронных моды1и клетки зелёных водорослей, которые Desmodesmus quadricauda могут быть синхронизированы с чередующихся светлых и темных периоды2. Хотя такие организмы предлагают уникальные экспериментальные атрибуты, они недостаточно модель сложности mammalian клеток. Возможность искусственно синхронизации клеток млекопитающих населения был центральным для продвижения нашего понимания регуляции клеточного цикла и молекулярные основы клеточного цикла контрольно-пропускных пунктов. Распространенные методы включают лишение сыворотки, химических блока и выпуска или эксплуатации физические характеристики3,4. Снятие сыворотки часто вызывает клетки ввести покоя, и повторное добавление сыворотки способствует повторный клеточный цикл в фазе G15. Химические ингибиторы включают агентов, таких как избыток тимидина или гидроксимочевина, который блокирует клетки на границе G1/S или микротрубочек ингибиторов, которые обычно арест клетки в M фазы3,4. Подходы, которые эксплуатируют физические характеристики включают митотическая трясти офф который может использоваться для обогащения для митотическая клетки так как они являются менее адэрентных чем межфазной клетки6. Однако все эти методы имеют потенциальные недостатки. Например не все типы клеток поддерживать жизнеспособность в отсутствии сыворотки или наличие химических ингибиторов, а доходность клеток после митотическая трясти офф ограничено без предварительного синхронизации с митотическая ингибиторов.
За исключением ранних эмбриональных клеток циклов, где клетки постепенно уменьшаться в размерах, как они делят7, большинство клеток, продвижения через цикл прохождения фаз роста и стать больше. Это свойство используется в технике противоточные центробежные сцеживания (КЦВ), который может использоваться для разделения клетки, различающихся по размеру и следовательно в клеточный цикл фазы8,9. Во время КЦВ, клетки находятся под влиянием двух противостоящих сил: центробежные силы, которые побуждают клетки от оси вращения и жидкости скорости (противоток), который управляет клетки к оси вращения (рис. 1). Клетки в зале сцеживания достичь равновесия, где эти силы равны. Ключевыми факторами, диктуя положения равновесия являются диаметр ячеек и плотности. Как поток увеличивается скорость буферного раствора и силы сопротивления противоточные перевешивает центробежной силы, устанавливается новое равновесие, вызывая изменения в положении клеток внутри камеры. Все клетки смещается в сторону выхода камеры, результате поменьше, оставляя камеры сначала, тогда как более крупные клетки остаться внутри камеры до тех пор, пока противоточные ставка увеличивается недостаточно для содействия их выхода. Клетки, спасаясь сцеживания камеры с подряд увеличение темпов противоточные могут быть собраны в определенных фракций и каждая часть содержит клетки последовательно увеличения размеров. Вместо проведения сцеживания с прирост темпов противоточные, последовательно уменьшается в центробежных сил, уменьшив скорость центрифугирования достигнет того же результата. Процесс сцеживания требует оптимизации в зависимости от типа клеток, сцеживания буфер занятых и конкретные используемые приборы. Скорость оседания клеток в этих условиях лучше всего описал закон Стокса: SV = [d2(ρp- ρм) / 18η] .ω2r, где SV = скорость седиментации; d = диаметр частицы; P ρ = плотность частиц; M ρ = плотность буфера; Η = вязкость буфера; Ω = угловой скорости ротора; и r = радиальный позиция частицы. Таким образом SV пропорциональна диаметр ячеек и плотности, и так как диаметр, возведенное в степень второго, он способствует более значительно, чем плотность, которая обычно постоянна через клеточного цикла.
Важным преимуществом КЦВ, что клетки не подвергаются суровым условиям химической обработки или недостатке питания и могут быть восстановлены в отличную доходность по существу невозмущенной. Требованием является, что в вопросе клетки проходят значительное увеличение в диаметре, по крайней мере 30%, как они пересекают клеточного цикла. Основным недостатком является стоимость специализированных центрифуги, ротора и аксессуары. Тем не менее возможность готовить клетки, обогащенная КЦВ в конкретных клеточного цикла этапов значительно облегчило исследования клеточного цикла в организмах из дрожжевых клеток млекопитающих9,10. Кроме того последние достижения расширяют использует для разделения клетки от здоровых против раковой ткани, разделение различных типов клеток в гетерогенных смесей, а также производства конкретных клеток видов иммунотерапии9.
Наш основной интерес был в понимании механизма действия ориентации агенты (MTA), такие как алкалоиды барвинка и таксаны микротрубочек. Считается, что эти препараты были действовать исключительно в митозе, блокировка шпинделя микротрубочек функции11,12, однако последние данные свидетельствуют о том, что они могут также нацелены на межфазной микротрубочек13,14. Мы недавно сообщили, что первичный острый лимфобластный лейкоз (все) клетки проходят смерти в любой фазе G1 или в М фазы при обработке винкристин и других MTA в обнаруживавшие клеточного цикла15. Возможность разделить все клетки различных клеточный цикл фазы КЦВ сыграл важную роль в достижении этот вывод. В этой статье мы описать технические детали и предлагают практические советы для применения КЦВ в подготовке первичного все клетки в разных клеточного цикла этапов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: этот протокол был оптимизирован для первичного B-все клетки которые колебаются в диаметре приблизительно 8 мкм (G1 фазе) до 13 мкм (фазы G2/М). Таким образом конкретные центрифугирования скорости и расхода насоса не могут быть применимы к клеткам с разные типоразмеры. Тем не менее соответствующие сцеживания параметров может быть оценена с помощью уравнения скорость седиментации. Клетки культивируемых в определенной среде сыворотки бесплатно как описано 16 на оптимальной плотности 1-3 х 10 6 клеток/мл. За исключением коллекции фракций, который проводится на 4 ° C, с помощью льда охлаждением трубы, все шаги проводятся при комнатной температуре и центрифуги на 20 ° C максимум 24 ° с.
1. Подготовка сцеживания буфер и материалы
- для того чтобы уменьшить глыба ячеек, подготовить буфером сцеживания Хэнк ' s сбалансированный солевой раствор (HBSS) с красным фенола, дополнена плода бычьим сывороточным (2% FBS), чтобы защитить клетки от механических напряжений в процессе сцеживания и 1,6 г/Л 2-Нафтол-6,8-дисульфокислоты кислоты калия соли (НДА), который оказывает клетки снаружи отрицательно заряженные и уменьшает слипания.
- Добавить 1.6 g NDA в 50 мл Конические трубки.
- В стерильных условиях, добавить 35 мл HBSS из бутылки 1 Л конические Тюбик 50 мл, содержащие НКО. Вихревой трубе, пока не растворится НКО.
- С помощью фильтра 0,2 мкм, переноса растворенных НКО в новых стерильных 50 мл Конические трубки. Затем добавьте НКО для остальных 1 Л HBSS.
- Наконец, добавить 21 мл FBS в HBSS для получения окончательного концентрации 2% (v/v).
Примечание: В буфер сцеживания могут быть подготовлены и хранятся при температуре 4 ° C до окончания срока на HBSS или до тех пор, пока есть значительные изменения в рН, как указано пожелтение краски индикатора.
- Ярлык 50 мл конические трубы для сбора фракций, так что есть помечены трубы мыть фракциях (W1 и W2), 1 и 2 1-20 (F1 - F20) и остановить.
- Предварительно охладить эти трубы на льду до сбора фракций.
2. Монтаж системы сцеживания
- во-первых, установить сборку строб в центрифуге, таким образом, чтобы шнур питания поступает из камеры через порт на левой стороне. Убедитесь, что строб вспышки лампы в передней части камеры, так он будут выстраиваться с окном просмотра, когда закрыт центрифуги.
- Secure Ассамблеей в место, сначала затянув два крестообразной головкой в два отверстия в верхней части каждого кронштейна и затем, затянув винты с накатанной головкой в нижней части каждого кронштейна.
- Подключите шнур питания к порту строб задней центрифуги.
- Далее, установите ротор прямо вниз на hub привода центрифуг и закрепите с помощью T-ручка шестигранника.
Примечание: Если центрифуги не требуется для целей не сцеживания, строб Ассамблеи и ротора может храниться в центрифуге между запусками. - , Закрепив ротора, место быстро релиз сборку, содержащую сцеживания палаты, Счетчик баланс, Вращающиеся уплотнения Ассамблеи и монтажной в ротор.
- Опустите равномерно с одной стороны на камере сцеживания и с другой стороны на счетчик баланс до болтов в ротор оснастки в отверстия кронштейна.
- Наконец, присоедините кабель якорь, поместив PIN-код на одной стороне кабеля в отверстие в вращающейся печать Ассамблеи и обеспечения смотровой глазок на другой стороне кабеля с одним из крестообразной головкой (упомянутых в 2.1.1) на скобу на левой стороне o f камеры.
- Затем собрать системе потока, с помощью переменной скоростью насоса и шланг насоса буфер в сцеживания камеры и собирать буфера, как это вытекает из камеры сцеживания.
- Вставки, размер 16 входных труб из переменной скоростью насоса через порт в верхней левой центрифуги камеры так, что он входит в камеру.
- Прикрепить штуцер к свободному концу входной трубы и фитинга вставьте входное отверстие на стороне вращающейся Ассамблеи печать.
- Вставки размер 16 выходной трубопровод через порт и приложите его к передаче трубки в верхней части вращающейся печать Ассамблеи.
Примечание: Система потока также может оставаться собраны между запусками сцеживания.
- Наконец, включите центрифуги и характеристики необходимые для эксперимента.
- Смена ротора идентификатор.
- Если центрифуги требует ввода времени, установить 2 h, который является более чем достаточным для завершения сцеживания запустить.
- Задания температуры до 20 ° C Макс температура 24 ° с.
- Установите ускорение для Макс и замедление для медленно.
- Наконец установите скорость 867 x g.
3. Грунтовка сцеживания системы
- сначала для того, чтобы стерилизовать системе сцеживания, поместите резервуар трубопровод в пластиковая бутылка 500 мл, содержащие отбеливатель 5% и место вывода труб в пустую пластиковую бутылку отходов 1 Л.
- Включите насос и установите скорость на 25 мл/мин и разрешить отбеливатель 5% для потока весь путь через систему сцеживания, до тех пор, пока он закачивается из трубки вывода в отходов бутылку.
- Включите центрифуги и позволить ему прийти к максимально обозначено скорость (867 x g) для того чтобы выпустить пузырьки и противодавления.
- Остановка центрифуги. Когда ротор перестанет вращаться, откройте крышку и осмотрите камеры для любых утечек.
- Если есть нет утечки, пусть раствор отбеливателя поток через систему для по крайней мере 5 минут
- Затем промыть систему газобетона водой как отбеливатель может привести к образованию осадка от сцеживания буфера, который может привести к глыба ячеек, а также повредить клетки.
- Место водохранилище труб в 1 Л бутылку газобетона воды и дайте ему флеш через по крайней мере 10 мин.
- После промывки водой, ввести сцеживания буфера в систему. Используйте 150 мл стеклянной бутылке, которая была газобетона для создания водохранилища для сцеживания буфер и клетки.
- Добавить 100 мл сцеживания буфера к бутылке и перемещения труб водохранилище в стеклянной бутылке так, чтобы трубка находится в самом низу.
- Начать центрифуги и позволяют буфера потока через систему для промывки воды.
- Как только бутылка водохранилища почти пуст и вода полностью очищается из системы, переместите вывода труб из отходов бутылки в водохранилище, что буфер перерабатывается в настоящее время через систему.
- Наконец, настроить в окне просмотра, чтобы Палата сцеживания можно увидеть на текущую скорость.
- Пресс Строб лампа кнопки на внешней стороне центрифуги питания так, что лампа горит. Поверните сцеживания kНоб также на внешней стороне центрифуги вплоть до левой.
- Хотя глядя через окно просмотра, медленно поверните ручку вправо до тех пор, пока Палата сцеживания вступает в представлении и вспышки света находится в времени с частотой вращения ротора.
Примечание: Система сцеживания может остаться в этом состоянии до тех пор, пока клетки нацелен.
4. Подготовка образца клеток
- количество клеток и аликвота 300 до 400 миллионов человек в рост среднего на несколько 50 мл конические трубы. Спин вниз клетки в 1210 x g на 3 мин
- Аспирата роста средств массовой информации и Ресуспензируйте клетки в 25 мл буфера сцеживания, закупорить вверх и вниз осторожно.
- Для того чтобы уменьшить ячеек слипания, клетки пройти дважды через 25 манометра.
- С использованием шприц 10 мл составить клетки и затем присоединить 25 иглы и передайте клетки через на внутренней стене стерильные 50 мл Конические трубки. Повторяйте эти шаги до тех пор, пока все 25 мл прошло через иглу.
- Получить новые игл и шприцев и повторите процесс выше раз.
Предупреждение: Иглы для шприцов должны быть помещены в контейнерах Шарпс.
Примечание: Очень важно, что клетки передаются через иглу непосредственно до введения их в системе сцеживания Чтобы сохранить клетки слипания до минимума.
5. Введение ячейки выборки в сцеживания системы и сбора фракций
- ввести образец клеток в системе сцеживания, поливая образец клеток в бачок, который имеет оставшиеся сцеживания буфера рециркуляции через .
- Пусть клетки войти в систему и достичь равновесия в зале сцеживания.
Примечание: Этот процесс займет около 5 минут и прогресс могут быть отслежены, наблюдая клетки, как они входят камеры через окна просмотра. Чтобы гарантировать все клетки в камере, принимать капли элюента, место на слайде стекла и посмотреть под микроскопом. Если образец бесплатно нетронутым клеток, это подтверждает их сохранение в камере.
- Пусть клетки войти в систему и достичь равновесия в зале сцеживания.
- Начать сбор фракций, когда все клетки вступили в камеру и имеется собственный граница в самой широкой части камеры, в которой клетки находятся в равновесии.
- Бегин, перемещая трубку вывода 50 мл Конические трубки помечены W1. Соберите 50 мл сцеживания буфера для этой фракции, убедившись в том держать глаз на бачок и пополнить с буфером сцеживания при необходимости.
Примечание: Для того, чтобы убедиться, что все клетки введены в систему, позволяют бачок стать почти пуст перед заправкой водохранилища в первый раз. После первого пополнения не потребуется ждать водохранилище стать почти пуст. Кроме того, не всегда позволяют танк стать пустым, как это будет создавать пузыри и давления в системе. - После того, как были собраны 50 мл для W1, одновременно изменить скорость 821 x g и переместить выходной трубки Конические трубки помечены W2 и собирать 50 мл больше на этой скорости.
- Продолжают изменять скорость и сбора фракций, как указано в таблице 1. Убедитесь, есть средства массовой информации в водохранилище танк и держать конические трубы на льду во все времена. Наконец, настройте в окне просмотра, медленно поворачивая ручку вправо, как скорость уменьшается.
- После того, как все 20 фракции были собраны, остановить центрифуги и собирать 50 мл в конической трубки помечены стоп.
- Бегин, перемещая трубку вывода 50 мл Конические трубки помечены W1. Соберите 50 мл сцеживания буфера для этой фракции, убедившись в том держать глаз на бачок и пополнить с буфером сцеживания при необходимости.
6. Промывка системы сцеживания
- после центрифуги перестал полностью заподлицо системы, поставив трубку водохранилище в 1 Л бутыль из воды и трубки вывода обратно в бутылку отходов.
- Поверните скорость насоса до 50 мл/мин и разрешить воды для запуска через систему до тех пор, пока она истощается.
- Включите насос, удалите входной и выходной шланг от Ассамблеи быстро релиз и вытащить pin от крепления кабеля.
- Удалить быстро релиз Ассамблеи от ротора.
Примечание: В зависимости от чего центрифуги будет использоваться, система сцеживания можно теперь оставить как есть. В противном случае вся Ассамблея может приниматься в обратном порядке как описано выше. Сцеживания палата можно из быстро релиз сборки удалены и очищены между запусками, с использованием ультразвуковой водяной бане. Это удаляет мусор и загрязняющих веществ из стенке камеры, которые могут негативно повлиять на более поздних бежит.
- Удалить быстро релиз Ассамблеи от ротора.
7. Анализ фракций и сбор G1 или G2/М бассейны.
Примечание: для того, чтобы продемонстрировать эффективность сцеживания, каждая фракция анализируется для клеток, диаметр ячеек и содержание ДНК, и пулы создаются клеток в G1 или G2/M этапы immunoblot анализов, как описано в Представитель результаты. Этот протокол секция опишу, как создать эти бассейны и подготовить их для экспериментального использования.
- Спин каждой фракции в 2000 x g 5 мин при 4 ° C и аспирата от сцеживания буфера.
- Фракции объединить вместе, чтобы получить пул фазы G1 и G2/М бассейн фаз.
- Для G1 фазе бассейн, Ресуспензируйте фракций, которые были собраны в диапазоне скоростей 788 x g до 661 x g (F1 - F5) в общей сложности 1 мл раствора фосфатного буфера солевой раствор (PBS) и передачи в 15 мл Конические трубки. Для пула фазы G2/M, Ресуспензируйте фракций, которые были собраны в диапазоне скоростей 387 x g и 333 x g (F17 - F20).
- Спина вниз клетки на 2000 x g 5 мин при 4 ° C и аспирата от PBS.
- Ресуспензируйте клетки в 10 мл средства роста и взять число ячеек.
- Алиготе от каждого пула для анализа ДНК контента через окрашиванию пропидий йодидом и потока гранулярных анализа 15.
Примечание: Остальная часть каждого пула может быть использован для дальнейших экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основная все клетки (3-4 x 108) были подвергнуты центробежные сцеживания и собраны в две мыть фракциях и двадцать основных фракций, как описано в протоколе. Таблица 1 показывает репрезентативных данных, где представлены общее количество клеток в каждой фракции, а также соответствующую скорость ротора. Общая доходность составила обычно более 80%. Измерение диаметра клеток в отдельных фракций подтвердил, что диаметр ячеек увеличилось с продвижением сцеживания (рис. 2). Эти результаты представляют собой средние двух независимых заключений и отражают высокий уровень воспроизводимости данных. Фракций были далее подвергается окрашиванию пропидий йодидом и проточная цитометрия для определения содержания ДНК (рис. 3). Ранние фракций (F1 - F5) содержится почти исключительно клетки с содержанием ДНК 2N, представляющие G1 фазе. Смесь клеток в фазе G1 и S-фаза наблюдалось в промежуточных фракций (F6 - F9) и клеток с содержанием ДНК 4N были наблюдается начиная с F10. Позднее фракций были главным образом клетки с содержанием ДНК 4Н, представляющих фазы G2/М. Эти данные вместе с результатами Рисунок 2 подтвердили взаимосвязь между размером ячейки и фазы клеточного цикла.
На основе этих результатов, фракций F1 - F5 были объединены для создания пула клеток в фазе G1, и фракций F17 - F20 были объединены для создания пула клеток в фазе G2/М. Доля клеток с содержанием ДНК 2N в бассейне фазы G1 обычно 99%, и доли клеток с содержанием ДНК 4N в бассейне G2/М обычно было 85%, как это определено по окрашиванию пропидий йодидом и проточная цитометрия. В асинхронных условиях 60-70% первичных, которые все клетки находятся в фазе G1 и 15-20% находятся в G2/М фазы15, таким образом значения, полученные после сцеживания отражают высокий уровень обогащения. Для дальнейшей проверки подлинности два бассейна в отношении фазы клеточного цикла, выдержки из каждого были подвергнуты immunoblotting с маркерами G1 или G2/M фаз. Во-первых мы использовали фосфо специфические антитела, который признает белка ретинобластомы (Rb) фосфорилированных Ser-807 или Ser-811, поскольку хорошо известно, что Rb становится все более фосфорилированных как клетки заранее через клеточного цикла17 . Как показано на рисунке 4, уровни фосфо-РБ были намного выше в клетках в бассейне G2/М по сравнению с G1 фазе бассейн, в соответствии с ожиданиями. Мы также исследовали циклин B1, которая выражается наиболее высоко в клетках фазы G2/М, и циклин D1, который наиболее высоко выражается в G1 фазе клетки18 (рис. 4). G2/М бассейн был гораздо более высокие уровни циклин B1, по сравнению с G1 бассейн, в соответствии с ожиданиями. Циклин D1 дал только слабый сигнал в эти препараты, но тем не менее было обнаружено в бассейне G1 и обнаружить в бассейне G2/М. GAPDH был использован элемент управления для подтверждения загрузки равных белка.
Изменения в стандартный протокол были выполнены для оценки их воздействия и создание условий для оптимальной производительности. Во-первых количество фракций собранных уменьшилось, от стандартных двадцать к только три, используя скорости определяется таблица 1 для представления точки терминала для коллекции ячеек в G1, S или G2/М фазы, как показано в таблице 2. Анализ ДНК содержание фракций F1 и F3 показаны на рисунке 5А. Часть 1 содержит клетки, высокообогащенного в фазе G1 (95%) и таким образом аналогичной чистоты, полученные при стандартных условиях (рис. 3). Однако, часть 3, якобы клетки высокообогащенного G2/М этапе, дал смешанное население, с ячейками в этапах G1 и S также присутствуют. G2/M клетки представлены только 51% от общего числа, по сравнению с 85% в стандартных условиях. Эти результаты показывают, что попытки упростить процедуру путем сокращения числа фракций компромиссы образец качества. Далее мы протестировали эффект сокращения доли объема, как средства для сокращения потребления химреагентов. Стандартный сцеживания был выполнен за исключением того, что 40 мл вместо 50 мл фракций были собраны. Фракций F1 и F20 были проанализированы на предмет содержания ДНК. Как показано на рисунке 5B, фракция F1 был сильно обогащенный в G1 фазе клетки (98%), аналогична полученные при стандартных условиях. Однако фракция F20 содержатся клетки во всех трех фазах, с ячейками в фазе G2/М, представляющих только 64% от общего числа, по сравнению с 85% в стандартных условиях. Эти результаты показывают, что снижение доли объема также подрывает образец качества.
Рисунок 1 . Принцип противотока центробежные сцеживания.
Обратите внимание что сцеживания клеток может быть достигнуто либо путем увеличения частоты противоточные, как указано здесь, или уменьшая скорость ротора. Адаптированные разрешение от Macmillan Publishers Ltd: [природа протоколы] (Ref 8.), авторское право (2008)8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Диаметр первичного все клетки увеличивается с долей сцеживания.
Средний диаметр был определен для каждой фракции, с помощью анализатора ячейки, который записывает данные из отдельных ячеек 500-4500 на сэмпл. Данные являются среднее ± с.д. от двух независимых экспериментов. Обратите внимание, что планки погрешностей для многих точек меньше, чем символ и были опущены для ясности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Анализ содержания ДНК подтверждает успешное разделение первичных все клетки в разных клеточного цикла этапов.
10 мл каждой фракции был зафиксирован в 70% EtOH, окрашенных в пропидий йодидом и проанализированы проточной цитометрии, как описано15. Пропидий йодида интегрированных интенсивности (ось x) был заговор против число ячеек (ось y) для определения части клеток в каждой фазе, где содержание ДНК 2N указывает G1 фазе а 4N содержание ДНК клетки в фазы G2 или M. Данные от представителя эксперимент и основные идентичные результаты были получены в четыре повторяется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Иммуноблот анализ связанных с клеточного цикла белков в пулефракции.
После стандартной сцеживания первичных, которые все клетки, фракций F1 - F5 были объединены, чтобы создать пул фазы G1 и фракции F17 - F20 были объединены для создания пула фазы G2/М. Экстракты были подготовлены и 40 мкг/Лейн подвергнуты анализу immunoblot, как описано ранее15, с антителами к фосфо РБ (Ser807/811), циклин B1, или циклин D1, все используемые при разбавлении стоматологов. GAPDH (1:10, 000) использовался в качестве элемента управления загрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Иллюстративные данные от неоптимальных elutriations.
A) эффект уменьшается количество собранных фракций. Только три основных фракций (F1 - F3), вместо двадцать, каждый из 100 мл, были собраны, скоростью как указано в таблице 2. Фракций F1 и F3 были проанализированы на предмет содержания ДНК как показано на рисунке 3. B) эффект снижения доли объема. Двадцать фракций были собраны, на тех же условиях, как показано в таблице 1, но только 40 мл сцеживания буфера вместо стандартной 50 мл был использован для каждого. Фракций F1 и F20 были проанализированы на предмет содержания ДНК как показано на рисунке 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Фракция | Скорость (об/мин) | G-Force | Всего клеток (x 10 ^ 6) |
| W1 | 3000 | 867 х g | 17.75 |
| W2 | 2920 | 821 x g | 7.00 |
| F1 | 2860 | 788 x g | 4.60 |
| F2 | 2800 | 755 x g | 10.75 |
| F3 | 2740 | 723 x g | 15.25 |
| F4 | 2680 | 692 x g | 22.50 |
| F5 | 2620 | 661 x g | 26,75 |
| F6 | 2560 | 631 x g | 25.00 |
| F7 | 2500 | 602 x g | 22.75 |
| F8 | 2440 | 573 x g | 18.00 |
| F9 | 2380 | 546 x g | 14.00 |
| F10 | 2320 | 518 x g | 10.75 |
| F11 | 2260 | 492 x g | 7.43 |
| F12 | 2200 | 466 x g | 8.63 |
| F13 | 2140 | 441 x g | 6.63 |
| F14 | 2100 | 425 x g | 4.98 |
| F15 | 2060 | 409 x g | 3.46 |
| F16 | 2020 | 393 x g | 3.43 |
| F17 | 1980 | 378 x g | 2,63 |
| F18 | 1940 года | 363 x g | 3.17 |
| F19 | 1900 | 248 x g | 2.78 |
| F20 | 1860 | 333 x g | 1,66 |
| ОСТАНОВИТЬ | 0 | 0 x g | 5.19 |
| Общая урожайность | 245.06 | ||
| Процент доходности | 81.69 | ||
Таблица 1. Ячейки, урожайность и соответствующую скорость ротора для каждой фракции.
Клеток определяли с помощью счетчика автоматизированные ячейки. Общая доходность определяется суммой отдельных фракций против ввода (3 x 108 клеток). Данные являются в среднем по два представителя экспериментов. Центробежная сила и соответствующую скорость ротора даны.
| Фракция | Скорость (об/мин) | G силы |
| W1 | 3000 | 867 х g |
| W2 | 2920 | 821 x g |
| F1 | 2620 | 661 x g |
| F2 | 2020 | 393 x g |
| F3 | 1860 | 333 x g |
| Остановить | 0 | 0 x g |
Таблица 2. Параметры скорости для субоптимальные сцеживания.
Показаны являются центробежные силы и соответствующей скорости ротора для смывки и три фракции, собранные в сжатом субоптимальные сцеживания. Смотрите Рисунок 5A для соответствующего содержимого ДНК и текст для деталей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали метод получения первичной все клетки в различных стадиях клеточного цикла, используя КЦВ. При оптимальных условиях по существу чисто населения клеток в фазе G1 и высокообогащенного популяция клеток в фазы G2/М могут легко быть получены отличные урожайности, и клеток в S фазе высокообогащенного также можно получить при желании. Представленные здесь результаты были получены с помощью один первичный, которые были получены все культуры (в частности, все-5) и по существу идентичные результаты с независимой культуры, все-215. Кроме того все другие начальные всех культур, рассмотренных до настоящего имеют похожие диапазоны плотность во время асинхронных роста и будет вероятно аналогично выполнить когда они подвергаются воздействию КЦВ. Наши предыдущие исследования показали также, что другие линии клетки лейкемии, включая HL60 и K562, могут быть разделены на различные клеточного цикла этапов с помощью КЦВ19,20. Важнейшие шаги в процедуре включают в себя обеспечение моно дисперсионные и не скомканным клетки в начале выполнения; Оптимизация условий противоточные скорость и ротор скорости; обеспечение компоненты системы являются чистой и свободной от мусора; и во избежание введения воздушных пузырьков в поточные линии. КЦВ лучше всего работает с клетками, которые значительно увеличение размера ячейки, как они заранее через клеточного цикла. Для данной популяции клеток в суспензии это может устанавливаться первоначально и легко путем изучения взаимосвязи между содержанием ДНК и сторона точечная, последнего зависит размер ячейки. Оба параметра может быть измерена одновременно подачей cytometry после пропидий йодидом окрашивание, как мы описали15. Линейная зависимость между боковой точечной и содержание ДНК обеспечивает уверенность, что размер ячейки увеличивается с заранее клеточного цикла и таким образом что КЦВ имеет потенциал для разделения клетки основывается на фазе клеточного цикла.
Как мы показали (рис. 5), отклонения от оптимизированная процедура приведет к ослабленной образец качества, особенно для ячеек в фазы G2/М. Однако сокращение числа фракций или фракции тома не затрагивает в значительной степени чистоту клеток в фазе G1 (рис. 5). Таким образом ярлыки к процедуре может быть терпимо, если только очищенный G1 фазе клетки необходимы. Хотя КЦВ легко поддаются подвеска культур клеток, он может также применяться к субцеллюлярные фракций. Например ядра из мышиных pre-B клетки были успешно размер-разделяются с помощью КЦВ8. Типы адэрентных клеток создает потенциальные проблемы из-за их склонности к глыба и возможного присоединения к поверхности трубы и сцеживания камеры и таким образом должны расследоваться с осторожностью.
Основным ограничением КЦВ является стоимость оборудования; возможным решением является сотрудничать с лабораторией, которая имеет необходимые аппарат. Однако, обратите внимание, что хотя ротор представляет собой выделенный инструмент, центрифуги могут использоваться для целей общего центрифугирования, тем самым уменьшая стоимость инвестиций исключительно в КЦВ. Другое ограничение состоит, что планирование экспериментов является более проблематичным по сравнению с гибкостью других методов, таких как сыворотки голода или химического синхронизации. Сцеживания работает обычно занимает 5-6 часов, и если впоследствии полученные клетки необходимы для краткосрочных или Multi-времени точки экспериментов, это может привести к планирование неудобства. Самым большим преимуществом является, что клетки, полученные этим методом невозмущенной и может быть культивировали в течение многих дней без каких-либо признаков бедствия, как мы показали15. Это контрастирует с синхронизированы с химическими средствами, которые могут гавани наркотиков индуцированного повреждения клеток. Недавнее исследование, используя NB4 клетки, полученные из острой миелоидной лейкемии взрывов, непосредственно сравнивать КЦВ и другие методы, включая арест с голода сыворотки, гидроксимочевина или лечение с ингибитор Циклин зависимая киназа 1, RO-330621. Elutriated клетки и клетки, арестован в сопоставимых этапах появились подобные связи содержание ДНК и циклин выражение. Однако когда рассматривался протеом, крупные изменения в изобилии белка, особенно связанных со стрессом и арест специфических белков, были замечены в арестованных клетки и не в elutriated клетках в эквивалентные ячейки размер позиции. Эти результаты подчеркивают полезность КЦВ для производства невозмущенной клеток и подчеркнуть, что следует с осторожностью при интерпретации данных из клеток синхронизации другими средствами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ANISHA Котари в настоящее время в Департаменте клеточной и молекулярной биологии исследований больницы St. Jude Children.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана низ CA109821 (для TCC). Мы благодарим Beckman Coulter, щедро предоставляет средства для покрытия расходов на публикации и для оказания технической помощи в настройке и эксплуатации системы сцеживания. Мы благодарим д-р Фред Фалкенбург за предоставление первоначального начальных всех культур.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
- Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
- Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
- Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
- Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
- Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
- Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
- Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
- Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
- Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
- Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
- Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
- Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
- Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).
