Summary
Bu iletişim kuralı birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayırmak için santrifüj elutriation açıklar.
Abstract
Hücreleri eşitlemek için yetenek hücre döngüsü Yönetmeliği anlayışımızı ilerleyen merkezi olmuştur. Ortak teknikler istihdam serum yoksunluk içerir; hücreleri farklı hücre döngüsü aşamaları tutuklama kimyasallar; veya Mitotik sallamak-hangi azaltılmış onların bağlılık yararlanan kapalı kullanımı. Ancak, tüm bu dezavantajları var. Örneğin, serum açlık normal hücreleri için iyi ama daha az tümör hücreleri nedeniyle onkogen harekete geçirmek ya da Tümör baskılayıcı kaybı güvenliği aşılan hücre döngüsü kontrol noktaları ile iyi çalışır. Benzer şekilde, kimyasal tedavi hücre popülasyonlarının ilaçla zarar liman ve stres ile ilgili değişiklikler gösterir. Hangi bu sorunları circumvents bir akışlı santrifüj elutriation (CCE), nerede hücreleri iki karşıt güç, merkezkaç kuvveti ve hücre boyutu ve yoğunluğu temelinde ayrılması sonucunda sıvı hız tabi tekniktir. Hücreler arasında geçiş yapma genellikle ilerleyen büyütmek, CCE hücreler farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayırmak için kullanılabilir. Burada birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri için bu tekniği uygulamak. Optimal koşullar altında G1 evresi hücrelerde aslında saf bir nüfusa ve G2/M aşama hücre zenginleştirilmiş bir nüfus içinde mükemmel verim elde edilebilir. Bu hücre popülasyonlarının ideal eğitim hücre döngüsü bağlı mekanizmaları eylem antikanser ilaçların ve diğer uygulamalar için uygundur. Biz de nasıl değişiklikler standart bir prosedür olabilir suboptimal performansa yol göstermek ve teknik sınırlamaları tartışıyorlar. Sunulan ayrıntılı metodoloji uygulama ve araştırma tekniği hücreleri diğer türleri için kolaylaştıracaktır.
Introduction
Genellikle zaman uyumsuz olarak kültürlü hücrelerin büyümesine ve tek tek hücreler hücre döngüsünün farklı aşamalarında mevcuttur. Bazı organizmalar doğal olarak zaman uyumlu hücre döngüsü sergi veya belirli fizyolojik uyaranlar tarafından eşitlenebilir. Örneğin, bir çok zaman uyumlu moda1ve Desmodesmus quadricauda açık ve koyu alternatif tarafından senkronize edilebilir yeşil algler hücrelerinin çekirdekleri içinde sümük kalıp Physarum polycephalum dev plasmodia bölmek dönem2. Bu tür organizmalar benzersiz deneysel öznitelikleri sunarken, yeterli ölçüde memeli hücreleri karmaşıklığı modeli. Memeli hücre popülasyonlarının yapay olarak eşitlemek için yetenek hücre döngüsü Yönetmeliği anlayışımızı ve hücre döngüsü kontrol noktaları moleküler temeli ilerleyen merkezi olmuştur. Ortak yöntemleri serum yoksunluğu, kimyasal blok ve yayın veya fiziksel özellikleri3,4istismar olabilir. Serum geri çekilmesi kez sendika girmek hücreleri neden olur ve yeniden ekleme serum G1 faz5hücre döngüsü iniş teşvik etmektedir. Kimyasal inhibitörleri aşırı timidin G1/S sınır hücreleri engellemek hidroksiüreye veya genellikle hücre M faz3,4tutuklama Mikrotubul inhibitörleri gibi ajanlar içerir. Mitotik sallamak-onlar Interphase hücreleri6' dan daha az yapışık olduğundan kullanılabilecek zenginleştirmek için Mitotik hücre dışı fiziksel özellikleri istismar bir yaklaşım içerir. Ancak, tüm bu tekniklerin potansiyel sakıncaları var. Örneğin, Mitotik sallamak-off olmadan önceki eşitleme Mitotik inhibitörleri ile sınırlıdır sonra tüm hücre tipleri canlılığı serum veya kimyasal inhibitörleri varlığı yokluğu ve hücreleri verimini korumak.
Nerede onlar7bölmek gibi hücreleri aşamalı olarak boyutu küçülür, erken embriyonik hücre döngüsü dışında çoğu hücre döngüsü boyunca ilerleyen büyüme fazları geçmesi ve daha büyük hale. Bu özellik boyut olarak farklı hücreleri ayırmak için kullanılan ve dolayısıyla Hücre döngüsünde8,9aşama kanatlı santrifüj elutriation (CCE), teknikte istismar edilir. CCE sırasında iki karşıt güç etkisi altında hücrelerdir: hücreler dönüş ekseni uzak sürücüler, merkezkaç kuvveti ve dönüş (şekil 1) eksenini karşı hücreleri sürücüler akışkan hızı (kanatlı),. Elutriation odası hücrelerde bu kuvvetlerin eşit olduğu bir denge konuma ulaşmak. Hücre çapı ve yoğunluk denge konumu dikte anahtar faktörlerdir. Akış Arabellek çözüm oranı artar ve kanatlı sürükle kuvvet merkezkaç kuvveti daha ağır basar, hücrelerin odası içinde konumunu bir değişiklik neden yeni bir denge kurulmuştur. Tüm hücreleri ise kanatlı oranı yeterince kendi çıkış tanıtmak için artış kadar büyük hücreleri odası içinde kal küçük olanlar öncelikle, oda bırakarak kaynaklanan odası çıkış doğru kaydırılır. Elutriation odası ardışık kanatlı oranı artış ile kaçan hücreleri belirli kesirler toplanabilir ve her kesir sırayla boyutları artan hücreler içerir. Artımlı kanatlı oranı artış ile elutriation iletken yerine, merkezkaç kuvveti tarafından Santrifüjü hızı azalan sıralı düşüşler aynı sonuca ulaşmak. Elutriation süreç optimizasyonu bağlı olarak hücre tipi, istihdam elutriation arabellek ve kullanılan belirli cihazları gerektirir. Bu koşullar altında hücre sedimantasyon oranı en iyi Stokes yasa ile anlatılan: SV = [d2(ρp- ρm) / 18η] .ω2r, nereye SV = sedimantasyon hızı; d = çap parçacık; Ρp = yoğunluğu parçacık; Ρm = yoğunluğu arabelleği; Η viskozite arabelleği; = Ω = açısal hızı Open End; ve r = parçacığın Radyal konumu. Böylece, SV hücre çapı ve yoğunluğu ile doğru orantılıdır ve çapı ikinci kuvvetine yükseltilmiş beri daha da önemlisi hangi hücre döngüsünün genellikle sabittir yoğunluğu daha katkıda bulunur.
CCE önemli bir avantajı hücreleri kimyasal arıtma veya besin yoksunluğu sert koşullara tabi değil ve mükemmel verim aslında soğukkanlı kurtarılabilir olduğunu. Hücre döngüsü Travers olarak söz konusu hücreler çapı, en az % 30, önemli bir artış geçmesi zorunludur. Ana dezavantajı ise özel santrifüj, rotor ve aksesuarları maliyetidir. Yine de, hücreleri belirli hücre döngüsü aşamalarında CCE tarafından zenginleştirilmiş hazırlamak yeteneği büyük ölçüde hücre döngüsü araştırma memeli hücreleri9,10üzerinden Maya organizmalarda kolaylaştırdı. Ayrıca, son gelişmeler kullanır üzerinden kanserli doku, farklı hücre tipleri heterojen karışımları ve belirli hücre tiplerinin immünoterapi9üretim için ayrılması karşı sağlıklı hücreleri ayırma için arttırıyoruz.
Bizim büyük ilgi ajanlar (MTAs) Cezayir menekşesi alkoloidler ve taxanes gibi hedefleme Mikrotubul hareket mekanizması anlamakta olmuştur. Bu ilaçların iğ Mikrotubul işlevi11,12, engelleme sadece mitoz içinde hareket düşünüldü ama onlar da Interphase mikrotübüller13,14hedefleyebilir son kanıtlar gösteriyor. Biz son zamanlarda birincil Akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücreleri ya da ölümde G1 evresi geçmesi veya M yılında vincristine ve hücre döngüsü bağlı şekilde15dakika sonra diğer MTAs ile tedavi ederken aşama bildirdi. Farklı hücre döngüsü aşamaları CCE tarafından tüm hücreler ayrı yeteneği bu sonuca ulaşmada vesile oldu. Bu makalede, biz teknik ayrıntıları açıklamak ve CCE uygulamaya İlköğretim hazırlanması için pratik ipuçları tüm hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: bu protokolü birincil B-tüm 13 µm (G2/M aşama) için yaklaşık 8 µm (G1 evresi) üzerinden çapı değişen hücreleri için optimize edilmiştir. Böylece, belirli santrifüj hızları ve pompa akış oranları farklı boyut aralıkları içeren hücreler için geçerli olmayabilir. Yine de, uygun elutriation parametreleri sedimantasyon hızı denklemi kullanarak tahmin edilebilir. Hücreleri tanımlanmış bir serum-Alerjik Orta olarak açıklanan 16 / 1-3 x 10 6 hücre/mL en uygun bir yoğunluk, kültürlü. Buz-serin borular kullanarak 4 ° C'de yürütülen topluluğu kesirler hariç, oda sıcaklığında ve en fazla 24 20 ° C'de ayarla santrifüj tüm adımları yapılmaktadır ° C.
1. hazırlık Elutriation tampon ve malzeme
hücrelerinin topaklanma azaltmak, Hank, bir elutriation arabellek hazırlamak için- ' s fenol kırmızı takıma % 2 fetal sığır serum () ile tuzlu çözüm (HBSS) dengeli Elutriation süreci ve 1.6 g/M 2-naftol-6,8-disulfonic asit dipotassium tuz (NDA), olumsuz ücret hücre dış işler ve topaklanma azaltır sırasında mekanik stres hücreleri korumak için FBS).
- NDA 1.6 g 50 mL konik tüp ekleyin.
- Steril koşullarda, HBSS 35 mL 1 L şişeden NDA içeren 50 mL konik tüp ekleyin. NİV eriyene kadar tüp girdap.
- 0.2 µm filtre kullanarak yeni bir steril 50 mL konik tüp içine çözünmüş NİV transfer. HBSS kalan 1 L için NİV ekleyin.
- Son olarak son konsantrasyonu % 2 (v/v) elde etmek için HBSS 21 mL FBS ekleyin.
Not: Elutriation arabellek olabilir hazırlanmış ve HBSS veya kadar pH büyük bir değişiklik bir göstergesi boya sararma tarafından belirtildiği şekilde sona erme tarihine kadar 4 ° C'de depolanan.
- Böylece etiketli tüpler 1 ve 2 (W1 ve W2), kesirler 1-20 (F1 - F20) yıkama ve DURDURMAK 50 mL konik tüpler kesirler topluluğu için etiket.
- Bu tüpler buzda kesirleri toplama önce önceden chill.
2. Derleme Elutriation sisteminin
- önce yükleyin strobe derleme santrifüj böylece güç kablosunu dışarı sol tarafındaki bağlantı noktası ile odaya besleniyor. Santrifüj kapatıldığında bu görüntüleme penceresi ile aynı hizada şekilde flaş flaş lamba odası ön tarafta olduğundan emin olun.
- İlk başta-in belgili tanımlık her destek iki delik içine iki-yıldız tornavida vida sıkma ve yanında parmak vidası her dirseğinin dibinde sıkma tarafından derleme yerde güvenli.
- Flaş güç bağlantı santrifüj arkasındaki güç kablosunu takın.
- Sonra rotor santrifüj sürücü hub düz aşağı ve T-kolu onaltılık anahtarıyla güvenli.
Not: santrifüj elutriation olmayan amaçlar için gerekli değilse, strobe derleme ve rotor santrifüj arasında çalıştırır içinde tutulabilir.
Rotor güvenli bir kez, - mühür montaj ve montaj plakası rotor döner içeren elutriation odası, sayaç ayarı, hızlı çıkarma derleme yerleştirin.
- Aşağı doğru itin eşit tek eliyle elutriation odası ve sayaç denge Öte yandan Open End civatalar Montaj plakası üzerinde delik içine snap kadar.
- Son olarak, pin kablo bir tarafında dönen mühür derleme deliğe yerleştirip sol tarafında o dirsek üzerinde biriyle (2.1.1 içinde belirtilen)-yıldız tornavida vidaları kablonun diğer tarafında eyehole güvenliğini sağlama bağlantı kablosunu takın f odası.
- Sonra bir değişken hız pompa kullanarak akış sistemi montajı ve pompa arabelleğe elutriation boru Kamara ve toplamak arabellek elutriation odadan akarken.
- Değişken hızlı pompa üst bağlantı noktası üzerinden gelen boyutu 16 giriş boru yaptı santrifüj TMMOB odasına girer böylece INSERT.
- Uygun bir ücretsiz giriş hortumunun sonuna eklemek ve dönen mühür derleme tarafında giriş deliği montaj takın.
- Boyutu 16 bağlantı noktası üzerinden boru çıkış ve transferi tüp dönen üst ekleyin Ekle mühür derleme.
Not: Akış sistemi de elutriation çalışmaları arasında birleştirilmiş kalabilir.
- Son olarak, santrifüj açmak ve teknik özellikleri deneme için gereken şekilde ayarlayın.
- Değişiklik rotor kimliği.
- Santrifüj zaman giriş gerektiriyorsa, çalıştırmak bir elutriation tamamlamak daha--dan yeterli 2 h için ayarla.
- İle maksimum geçici 24 + 20 ° C sıcaklık ayarla ° C.
- Max için hızlanma ve yavaşlama için yavaş ayarla.
- Son olarak, 867 x g. hıza ayarlayın
3. Elutriation sistemi priming
ilk elutriation sistem sterilize etmek, rezervuar boru %5 çamaşır suyu içeren bir 500 mL plastik şişe içine yerleştirin ve çıkış boru boş 1 L plastik atık şişe içine yerleştirmek için- .
- Pompa açmak ve 25 mL/dk için hızını ve %5 çamaşır suyu atık şişe içine çıktı tüp dışarı pompalanır kadar sonuna kadar elutriation sistemi üzerinden akmasına izin.
- Santrifüj açmak ve hız (867 x g) serbest kabarcıklar ve backpressure için belirlenmiş maksimum gelmesini izin.
- Santrifüj durdurmak. Rotor döner durdu sonra kapağını açmak ve herhangi bir sızıntı için odası incelemek.
- Hiçbir sızıntı varsa, çamaşır suyu çözüm izin en az 5 dakika süreyle sistem ile akışı
- Çamaşır suyu hangi kurşun hücreleri topaklanma için hem de hücreleri zarar elutriation arabellek precipitates oluşumu için kurşun gibi daha sonra autoclaved su ile sistem floş.
- Ve su ile en az 10 dk. temizlemek izin yer autoclaved 1 L şişe içine rezervuar boru
- Su ile yıkama sonra elutriation arabellek sisteme tanıtmak. Elutriation arabellek ve hücreler için su deposu oluşturmak için autoclaved olmuştur 150 mL cam şişe kullanın.
- Elutriation arabellek 100 mL şişe ekleyin ve tüp çok altında olması rezervuar cam şişe Boru taşımak.
- Ve suyu floş için sistemi aracılığıyla akış arabellek izin santrifüj başlayın.
- Arabellek sistem üzerinden geri dönüştürülmüş böylece çıkış atık şişe için rezervuar boru rezervuar şişe neredeyse boş ve su tamamen sistemden aktarılmadan kez hareket.
- Son olarak, izleme penceresi geçerli hızda elutriation odası görülebilir şekilde ayarlayın.
- Basın flaş lamba güç düğmesi santrifüj dışındaki böylece lamba yanar. Elutriation k açmaksantrifüj sol sonuna kadar dışarıdan da Nob. Elutriation odası görünümü ve strobe ışık gelene sağdaki düğmeyi rotor dönüşü ile zamanında edip inceleyen pencereden yavaş yavaş
- çevirmek.
Not: hücreleri prepped kadar elutriation sistemi bu durumda bırakılabilir.
4. Hücre örneği hazırlanması
- Kont hücreleri ve aliquot 300-400 milyon içinde büyüme orta birkaç 50 mL konik tüpler içine. Spin aşağı vasıl 1210 x g 3 dakika süreyle hücre
- Aspiratı büyüme medya ve resuspend hücreleri yukarı ve aşağı yavaşça pipetting tarafından elutriation arabellek 25 ml. Azaltmak için
- topaklanma hücre, bir 25 ile iki kez geçiş hücreleri iğne ölçmek.
- 10 mL şırınga kullanarak hücreleri çizin ve sonra 25 gauge iğne takmak ve hücreler arasında iç geçmek bir steril 50 mL konik tüp duvarına. Tüm 25 mL geçti kadar iğne ile bu işlemi tekrarlayın.
- Yeni iğne ve şırınga elde etmek ve bir kez yukarıda tekrarlayın.
Dikkat: Şırınga iğneleri "Sharps" kaplarda yerleştirilmelidir.
Not: Bu hücreleri iğne ile daha önce hemen onları tanıştırmak elutriation sisteme hücre minimumda topaklanma tutmak için itilir bu önemlidir.
5. Hücre örnek giriş içine belgili tanımlık Elutriation sistemi ve kesirler koleksiyonu
- tanıtmak hücre örnek hücre örnek üzerinden geri dönüşüm kalan elutriation tampon vardır rezervuar tankı içine dökme tarafından elutriation sistemine .
- İzin girmek belgili tanımlık sistem ve denge elutriation odası içinde ulaşmak hücreleri.
Not: Bu işlem yaklaşık 5 dakika sürer ve ilerleme izleme penceresi Odaya girerken hücreleri izleyerek izlenebilir. Tüm hücreleri odasında emin olmak için bir damla alın eluent, yer bir cam slayt üzerinde ve mikroskop altında görüntülemek. Örnek sağlam hücreleri serbest ise, bu onların saklama odasında onaylar.
- İzin girmek belgili tanımlık sistem ve denge elutriation odası içinde ulaşmak hücreleri.
- Bir kez tüm hücreleri odasına girdiniz ve denge içinde olduğu hücreleri odası geniş kısmında ayrı bir sınır kesirler toplamaya başlamak.
- 50 mL konik tüp çıktı tüp hareketli tarafından
- Begin W1 etiketli. Toplamak için rezervuar tank göz kulak ve elutriation arabellek gerektiğinde yeniden doldurmak emin bu kesir elutriation arabellek 50 mL.
Not: ilk kez depo dolum önce neredeyse boş olmak rezervuar tank tüm hücreleri içine belgili tanımlık sistem girdiğinizden emin olun için olanak verir. Sonra ilk dolum havzanın neredeyse boş olmak beklemek gerekmez. Ayrıca, yapmak değil hiç bu sistemde kabarcıklar ve geri dönüş basıncı yaratacak gibi boş olmak tank izin. - 50 mL toplanan bir kez W1 için aynı anda 821 x g hızla değiştirin ve W2 etiketli konik tüp çıktı tüp taşımak ve 50 mL bu hızda daha fazla toplamak.
- Değiştirme hızı ve tablo 1'de gösterildiği gibi kesirler toplamaya devam ediyor. Havzanın medyada tank ve buz üzerinde konik tüp her zaman tutmak emin olun. Son olarak, yavaş yavaş hızı azaldıkça sağdaki düğmeyi çevirerek görüntüleme penceresi ayarlamak.
- Bir kez tüm 20 kesirler toplanmıştır, santrifüj durdurmak ve STOP etiketli konik tüp içinde 50 mL toplamak.
- Begin W1 etiketli. Toplamak için rezervuar tank göz kulak ve elutriation arabellek gerektiğinde yeniden doldurmak emin bu kesir elutriation arabellek 50 mL.
6. Flushing Elutriation sisteminin
- santrifüj tamamen gömme rezervuar tüp autoclaved su ve çıkış tüpünde geri atık şişe 1 L şişe koyarak sistem durduktan sonra
- .
- Pompa hızı 50 mL/dk'ya kadar açın ve onu tükenmiş kadar sistem üzerinden çalıştırmak su izin.
- Çevirmek pompa kapatmak giriş ve çıkış hortumu hızlı çıkarma derlemesinden kaldırmak ve ankraj kablo iğnesinden dışarı çıkarmak.
- Kaldır rotor hızlı çıkarma derlemesinden.
Not: ne santrifüj için kullanılan bağlı olarak, elutriation sistem şimdi olduğu gibi bırakılabilir. Aksi takdirde, tüm montaj ters sırada yukarıda açıklandığı gibi alınabilir. Elutriation odası hızlı çıkarma derlemesinden kaldırıldı ve ultrasonik su banyosu kullanarak çalışmaları arasında temizledim. Bu enkaz ve kirletici daha sonra ishal olumsuz yönde etkileyebilecek odası duvardan kaldırır.
- Kaldır rotor hızlı çıkarma derlemesinden.
7. Kesirler ve koleksiyon G1 ve G2/M havuzları analizi.
Not: elutriation etkinliğini göstermek için her kesir sayısı, hücre çapı ve DNA içeriği için analiz edilir ve havuzları oluşturulur hücrelerinin immunoblot analizleri, G1 ve G2/M aşamasında açıklandığı gibi Temsilcisi sonuçları. Bu iletişim kuralı bölüm bu havuzları oluşturmak ve onları deneysel kullanım için hazırlamak nasıl anlatacağım.
- Her kesir 2000 x g 4 ° C ve elutriation arabellek kapalı aspiratı 5 min için de spin.
- Birlikte bir G1 evresi havuzu ve G2/M aşamaları havuzu elde etmek için birleştirin kesirler.
- İçin G1 aşama Havuzu, toplam fosfat tampon tuzlu çözüm (PBS) ve 15 mL konik tüp transfer 1 mL 788 x g hız aralığında 661 x g (F1 - F5) toplanan kesirler resuspend. G2/M aşamaları havuzu için 387 x g ve 333 x g (F17 - F20) hız aralığında toplanan kesirler resuspend.
- 2000 x g 4 ° C ve aspiratı PBS kapalı 5 min için hücreleri aşağı spin.
- Resuspend 10 mL büyüme ortamının hücreleri ve hücre sayısı alır.
- Bir aliquot için DNA analiz edilecek her havuzundan propidium iyodür boyama yoluyla içeriği almak ve akış sitometrik analiz 15.
Not: Her havuzu geri kalanı için daha fazla deney kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Birincil tüm hücreleri (3-4 10 x8) için santrifüj elutriation tabi ve toplanan iki yıkama kesirler ve yirmi ana kesirler, iletişim kuralında tanımlandığı gibi. Tablo 1 nerede her kesir hem de karşılık gelen rotor hızı toplam sayısı sunulmaktadır temsilcisi verileri gösterir. Genel olarak verim genellikle üzerinde % 80 oldu. Bu hücre çapı elutriation (Şekil 2) ilerleyen ile artan bireysel kesirler hücre çapı ölçümü doğruladı. Bu sonuçlar iki bağımsız tespitler Ortalamalar temsil ve veri tekrarlanabilirlik yüksek derecede yansıtmaktadır. Kesirler sonraki propidium iyodür boyama için tabi tutuldu ve Akış Sitometresi DNA içeriği (şekil 3) belirlemek için. Erken kesirler (F1 - F5) neredeyse sadece hücreleri 2N DNA içeriği ile G1 evresi temsil eden yer. G1 evresi ve S faz hücrelerde karışımı ara kesirler (F6 - F9) gözlendi ve hücrelerin 4N DNA içeriği ile F10 içinde başlayan görülmektedir. Daha sonra kesirler G2/M aşamaları temsil eden 4N DNA içeriği ile esas olarak hücreleri vardı. Bu veriler Şekil 2 sonuçlar ile birlikte hücre boyutu ve hücre döngüsü aşama arasında bir ilişki doğruladı.
Bu sonuçlara dayanarak, kesirler F1 - F5 G1 aşamasında bir havuzu hücre oluşturmak için kombine edilmiştir ve kesirler F17 - F20 G2/M aşamasında bir havuzu hücre oluşturmak için birleştirilmiştir. Hücreleri 2N DNA içeriği G1 evresi havuzu ile oranı genellikle % 99 idi, ve 4N DNA içeriği G2/M havuzunda hücrelerle oranı genellikle % 85, propidium iyodür boyama tarafından belirlenen ve Akış Sitometresi. Zaman uyumsuz, 60-%70 G1 evresi ve 15-20 %'tüm hücrelerdir İlköğretim koşullardadır G2/M aşamaları15, böylece elutriation yansıtacak sonra zenginleştirme yüksek düzeyde elde edilen değerler. Daha fazla hücre döngüsü aşama ile ilgili olarak iki havuzu kimliğini doğrulamak için her gelen özler G1 ve G2/M aşama işaretleri ile immunoblotting için tabi tutuldu. İlk olarak, biz de Rb giderek fosforile olur hücreleri önceden17 hücre döngüsü boyunca olarak oluşturulduktan beri tanıyan fosforile Retinoblastom (Rb) protein Ser-807 ya da Ser-811, fosfo özgü antikor kullanılan . Şekil 4' te gösterildiği gibi hücrelerde G2/M havuzu beklentilerle tutarlı G1 evresi havuzu karşı fosfo-Rb düzeyde, daha yüksek. Ayrıca en çok G2/M faz hücrelerde ifade edilir, siklin B1 ve en çok G1 evresi hücreleri18 ' (şekil 4) ifade edilir siklin D1 probed. G2/M havuz siklin B1 G1 Havuzu, beklentilerle tutarlı kıyasla çok daha yüksek seviyede vardı. Siklin D1 sadece zayıf bir sinyal bu hazırlıklar verdi ama yine de G1 havuzu tespit ve G2/M havuzunda tespit edilemez oldu. GAPDH kullanılan eşit protein yükleme onaylamak için bir denetim.
Standart protokol değişiklikler etkilerini değerlendirmek için ve en iyi performans koşullarını oluşturmak için yapıldı. Üç üzerinden belirlenen hızları kullanarak tablo 1 için hücre koleksiyonu aşamasında G1, S ve G2/M, terminal Puan temsil etmek için Tablo 2'de gösterildiği gibi yalnızca ilk, kesirler toplanan sayısı, standart yirmi üzerinden azalma. Kesirler F1 ve F3 DNA içeriğinin analizini şekil 5A' gösterilir. Kesir 1 yüksek oranda (% 95) G1 aşamasında zenginleştirilmiş hücrelerin bulunan ve böylece benzer saflık için standart koşullar altında (şekil 3) elde edildi. Ancak, kesir 3, görünüşte hücreleri son derece G2/M aşamasında zenginleştirilmiş nüfus, aşamasında G1 ve S de mevcut hücrelerle verdi. G2/M hücreleri temsil sadece toplamı %51 %85 standart koşullar altında karşılaştırıldığında. Bu sonuçlar bu yordamı kesirler tavizler örnek kalite sayısını azaltarak kolaylaştırmak çalışır gösterir. Ardından, kesir birim, reaktif tüketimi azaltmak için bir araç olarak azaltılması etkisini test ettik. 50 mL kesirler yerine 40 mL toplanan bu dışında standart bir elutriation gerçekleştirildi. Kesirler F1 ve F20 DNA içeriği için analiz edildi. Şekil 5Biçinde gösterildiği gibi kesir F1 son derece hücrelerdeki G1 evresi (%98), standart koşullar altında elde benzer zenginleştirilmiş. Ancak, kesir bulunan F20 hücrelerle hücreler yalnızca toplam, % 64'ü temsil eden G2/M aşamasında tüm üç aşamada standart koşullar altında % 85 ile karşılaştırıldığında. Bu sonuçlar kesir ses düzeyini azaltmayı da örnek kalitesi tavizler gösterir.
Resim 1 . Kanatlı santrifüj elutriation prensibi.
Not hücre o elutriation burada belirtildiği gibi kanatlı oranı artan veya azalan rotor hızı elde edilebilir. Macmillan yayıncılar Ltd gelen izniyle uyarlanmıştır: [doğa protokolleri] (Ref 8.), telif hakkı (2008)8. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Çapı birincil tüm hücreleri elutriation kesir ile artar.
Ortalama çapı bir hücre Analyzer'ı örnek başına 500-4.500 bireysel hücrelerden veri kayıtları her kısmı için tespit edilmiştir. Gösterilen veriler ortalama ± SD iki bağımsız deney gelen vardır. Not hata çubukları çok puan için sembol küçüktür ve netlik için ihmal. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . DNA içeriği analiz İlköğretim başarılı ayrılık tüm hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında doğruluyor.
Her kesir 10 mL % 70'sabit propidium iyodür lekeli ve Akış Sitometresi tarafından olarak analiz alkol, açıklanan15. Propidium entegre iyodür yoğunluğu (x ekseni) nerede 2N DNA içeriği G1 aşamayı gösterir ve 4N DNA içeriği G2 veya M aşamada hücreleri gösterir her aşamasında, hücreleri bölümünü belirlemek için hücre sayısı (y ekseni) karşı çizildi. Gösterilen Veri temsili bir deneyden vardır ve dört tekrarlar içinde temel aynı sonuçlar elde edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Proteinler hücre döngüsü ile ilgili analizini Immunoblot havuzlukesirler.
TÜM hücreleri, kesirler F1 - F5 G1 evresi havuzu ve kesirler F17 - oluşturmak için kombine edilmiştir birincil standart bir elutriation F20 G2/M faz havuzu oluşturmak için kombine. Özler hazırlanmış ve 40 µg/daha önce15, antikorlar fosfo-Rb (Ser807/811) ile açıklandığı gibi immunoblot analize tabi siklin B1 veya siklin D1, tüm 1:2,000 seyreltme kullanılan lane vardı. GAPDH (1:10, 000) yükleme denetimi olarak kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Suboptimal elutriations açıklayıcı veriler.
A) toplanan kesirler sayısı azalan etkisi. Sadece üç ana kesirler (F1 - F3), standart yirmi, her biri 100 mL, yerine, hızlarda tablo 2'de gösterildiği gibi toplanmıştır. Kesirler F1 ve F3 DNA içeriği olduğu gibi şekil 3için analiz edildi. B) kesir ses düzeyini azaltmayı etkisi. Tablo 1, olduğu gibi aynı koşullar altında yirmi kesirler toplanmıştır ama elutriation arabellek standart 50 mL yerine sadece 40 mL her için kullanıldı. Kesirler F1 ve F20 DNA içeriği olduğu gibi şekil 3için analiz edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Kesir | Dönüş hızı (rpm) | G-Force | Toplam hücreleri (x 10 ^ 6) |
| W1 | 3000 | 867 x g | 17,75 |
| W2 | 2920 | 821 x g | 7,00 |
| F1 | 2860 | 788 x g | 4,60 |
| F2 | 2800 | 755 x g | 10,75 |
| F3 | 2740 | 723 x g | 15.25 |
| F4 | 2680 | 692 x g | 22,50 |
| F5 | 2620 | 661 x g | 26,75 |
| F6 | 2560 | 631 x g | 25,00 |
| F7 | 2500 | 602 x g | 22,75 |
| F8 | 2440 | 573 x g | 18.00 |
| F9 | 2380 | 546 x g | 14.00 |
| F10 | 2320 | 518 x g | 10,75 |
| F11 | 2260 | 492 x g | 7.43 |
| F12 | 2200 | 466 x g | 8,63 |
| F13 | 2140 | 441 x g | 6,63 |
| F14 | 2100 | 425 x g | 4,98 |
| F15 | 2060 | 409 x g | 3,46 |
| F16 | 2020 | 393 x g | 3.43 |
| F17 | 1980 | 378 x g | 2.63 |
| F18 | 1940 | 363 x g | 3,17 |
| F19 | 1900 | 248 x g | 2,78 |
| F20 | 1860 | 333 x g | 1.66 |
| DUR | 0 | 0 x g | 5,19 |
| Toplam verim | 245.06 | ||
| Yüzde verim | 81.69 | ||
Tablo 1. Hücre verim ve her kısmı için karşılık gelen rotor hızı.
Hücre sayısı bir otomatik hücre sayaç tespit edilmiştir. Toplam verim giriş (3 x 108 hücreleri) karşı bireysel kesirler toplamı tarafından tespit edilmiştir. İki temsilcisi deney ortalama verilerdir. Merkezkaç kuvveti ve karşılık gelen rotor hız verilmiştir.
| Kesir | Dönüş hızı (rpm) | G Force |
| W1 | 3000 | 867 x g |
| W2 | 2920 | 821 x g |
| F1 | 2620 | 661 x g |
| F2 | 2020 | 393 x g |
| F3 | 1860 | 333 x g |
| Dur | 0 | 0 x g |
Tablo 2. Suboptimal elutriation hız parametreleri.
Merkezkaç güçleri ve yıkama için karşılık gelen rotor hızı ve bir sıkıştırılmış suboptimal elutriation toplanan üç kesirler gösterilmiştir. Şekil 5A karşılık gelen DNA içeriği ve metin ayrıntılı bilgi için bkz:.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CCE kullanarak hücre döngüsünün farklı aşamalarında tüm hücreleri birincil elde etmek için bir yöntem anlatmıştık. Optimal koşullar altında G1 evresi hücrelerde aslında saf bir nüfusa ve G2/M aşama hücre zenginleştirilmiş bir nüfus kolayca mükemmel verim elde edilebilir ve son derece S aşamasında zenginleştirilmiş hücreleri de istenirse edinilebilir. Sonuçları burada sunulan bir birincil tüm kültür (özellikle, ALL-5) ve temelde aynı sonuçlar elde edilen bağımsız bir kültür ile ALL-215kullanarak elde edilmiştir. Buna ek olarak, tüm kültürler için tarihi incelendiğinde benzer yoğunluğu aralıkları sırasında zaman uyumsuz büyüme var ve büyük olasılıkla diğer tüm birincil gerçekleştirmek benzer şekilde ne zaman CCE için tabi. Bizim önceki çalışmalarda da HL60 ve K562, dahil olmak üzere diğer lösemi hücre satırları CCE19,20kullanarak farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayrılmış olabilir göstermiştir. Yordamdaki kritik adımlar hücreleri çalışma başlangıcında ve mono dağınık değil olmalı sağlama içerir; kanatlı oranı ve rotor hızı şartları getirilmesi; sistemin bileşenlerinin sağlanması temiz ve enkaz ücretsiz; ve hava kabarcıkları akışı satırlarının içine giriş kaçınarak. CCE en iyi onlar hücre döngüsü ile peşin olarak önemli ölçüde hücre Boyutu'nda artırın hücreleri ile çalışır. Süspansiyon hücrelerde verilen nüfus için bu başlangıçta ve kolayca DNA içeriği ve yan-dağılım, ikincisi bağımlı hücre boyutu için arasındaki ilişkiyi inceleyerek kurulabilir. Biz15açıklandığı gibi her iki parametre aynı anda Akış Sitometresi tarafından boyama, propidium iyodür sonra ölçülebilir. Yan-dağılım ve DNA içeriği arasında doğrusal bir ilişki hücre döngüsü avans ile hücre boyutunu artırır ve böylece CCE ayrı hücreler potansiyeline sahiptir hücre döngüsü aşamasına dayalı güven sağlar.
Biz (şekil 5) gösterdiği gibi en iyi duruma getirilmiş yordamı sapmalar özellikle hücrelerde G2/M aşamaları için güvenliği aşılan örnek kalite neden. Ancak, kesirler veya kesir birim sayısını azaltma kayda değer hücre saflığı G1 evresi (şekil 5) etkilemedi. Böylece, saflaştırılmış G1 evresi hücreler gerekli olan yalnızca yordamı için kısayollar tolere. CCE süspansiyon hücre kültürleri için kolayca mükellef olmasına rağmen aynı zamanda hücre altı kesirler için uygulanabilir. Örneğin, fare pre-B hücreleri hücre çekirdeği başarıyla boyutu-CCE8kullanarak ayrılmış oldu. Yapisan hücre tipleri boru ve elutriation odası yüzeylerin kümeleyerek ve olası bağlılığı için onların eğilimi nedeniyle olası sorunları poz ve böylece dikkatle araştırılmalıdır.
Ana CCE ekipman maliyeti kısıtlamasıdır; gerekli aparatı olan bir laboratuar ile işbirliği mümkün bir çözümdür. Ancak rotor adanmış bir araç olsa da, santrifüj genel Santrifüjü amaçlar için kullanılabilir, böylece maliyet azaltarak yatırım sadece CCE dikkat edin. Başka bir sınırlama deney planlaması serum açlık veya kimyasal eşitleme gibi diğer yöntemleri esnekliğini kıyasla daha sorunlu olmasıdır. Elutriation çalışır, genellikle 5-6 saat sürer ve elde edilen hücreleri, kısa vadeli veya çok zaman noktası deneyler için daha sonra gerekirse bu sakıncaya planlamada yol açabilir. En büyük avantajı bu yöntemle elde edilen hücreleri soğukkanlı ve biz15gösterdiği gibi birçok gün sıkıntı, belirtisi olmadan kültürlü olabilir olduğunu. Hangi ilaçla zarar olabilir liman kimyasal yollarla senkronize hücreleri ile karşıttır. Yapılan bir çalışmada, akut myeloid lösemi türetilmiş NB4 hücreleri kullanarak patlamaların, doğrudan CCE ve serum açlık, hidroksiüreye veya tedavi ile siklin bağımlı kinaz 1 inhibitörü, RO-330621tutuklama dahil olmak üzere diğer yöntemleri ile karşılaştırıldığında. Elutriated hücreleri ve hücre DNA içeriği ve siklin ifade ile ilgili olarak benzer çıktı karşılaştırılabilir aşamaları, tutuklandı. Ancak, Proteom incelendiğinde, büyük protein bolluk içinde özellikle stres kaynaklı değiştirir ve tutuklama-spesifik proteinler, eşdeğer hücre boyutu pozisyonlarda elutriated hücreleri değil de tutuklandı hücrelerdeki gözlendi. Bu sonuçlar CCE yarar için soğukkanlı hücrelerinin üretimini vurgulayın ve vurgulamak hücrelerden veri yorumlama başka yollarla senkronize zaman dikkatli kullanılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Anisha Kothari şu anda bölümü hücre ve moleküler biyoloji St. Jude çocuk araştırma hastanesinde çalışıyor.
Acknowledgments
Bu eser NIH CA109821 (TCC için) tarafından desteklenmiştir. Beckman Coulter cömertçe yayın maliyetlerini karşılamak için fon sağlamak için ve teknik yardım kurulum ve elutriation sisteminin çalışması için teşekkür ederiz. Biz Dr Fred Falkenburg ilk İlköğretim tüm kültürler için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
- Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
- Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
- Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
- Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
- Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
- Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
- Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
- Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
- Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
- Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
- Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
- Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
- Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).
