Forberedelse av primære akutt lymfatisk leukemi celler i forskjellige cellen syklus faser av sentrifugal Elutriation
Summary
Denne protokollen beskriver bruk av sentrifugal elutriation skille primære akutt lymfatisk leukemi celler i forskjellige cellen syklus faser.
Abstract
Muligheten til å synkronisere celler har vært sentralt å fremme vår forståelse av cellen syklus. Vanlige teknikker ansatt inkluderer serum deprivasjon; kjemikalier som arrestere cellene på ulike celle syklus faser. eller bruk av mitotisk riste av som utnytter deres redusert etterlevelse. Men har alle disse ulemper. For eksempel, fungerer serum sult godt for normale celler, men mindre godt for kreftceller med kompromittert celle syklus sjekkpunkter på grunn oncogene aktivisering eller tumor suppressor tap. Tilsvarende kan kjemisk behandlet celle populasjoner havn narkotikainduserte skade og Vis stress-relaterte endringer. En teknikk som omgår problemene er motstrøm sentrifugal elutriation (Screen), der celler er utsatt for to motstridende krefter, sentrifugalkraften og væske hastighet, noe som resulterer i separasjon av cellene basert på størrelsen og tettheten. Siden celler bla gjennom syklusen vanligvis forstørre, kan Screen brukes til å skille celler i forskjellige cellen syklus faser. Her bruker vi denne teknikken primære akutt lymfatisk leukemi celler. Under optimale forhold, kan en i hovedsak ren populasjon av celler i G1 fase og høyanriket innbyggere celler i G2/M faser fås i god avkastning. Disse celle populasjoner er ideell for studere celle syklus-avhengige virkningsmekanismer av anticancer narkotika og andre programmer. Vi viser hvordan endringer i standard prosedyre kan resultere i ytelse under det optimale og diskutere begrensningene av teknikken. Detaljert metodikken presentert skal lette program og utforsking av teknikken til andre typer celler.
Introduction
Kultivert cellene vokse vanligvis asynkront og individuelle celler finnes i forskjellige faser av cellen syklus. Noen organismer viser naturlig synkron cellen sykluser eller kan synkroniseres ved bestemte fysiologiske stimuli. For eksempel dele kjerner innenfor gigantiske plasmodia av Slim mold Physarum polycephalum i en svært synkron mote1, og celler i de grønne algene Desmodesmus quadricauda kan synkroniseres av vekslende lyse og mørke perioder2. Slike organismer tilbyr unike eksperimentelle egenskaper, modell de mangelfullt kompleksiteten i pattedyrceller. Muligheten til å synkronisere kunstig pattedyr celle populasjoner har vært sentralt å fremme vår forståelse av cellen syklus og molekylære grunnlaget for cellen syklus sjekkpunkter. Vanlige metoder omfatter serum deprivasjon, kjemiske blokk og løslate eller utnytte fysiske egenskaper3,4. Tilbaketrekning av serum fører ofte til cellene inn gågaten og the re-tillegg av serum fremmer celle syklus reentry i G1 fase5. Kjemisk hemmere inkluderer agenter som overflødig thymidine eller hydroxyurea som blokkerer cellene på G1/S grensen eller microtubule hemmere som vanligvis arrestere celler i M fase3,4. Tilnærminger som utnytte kjennetegn inkluderer mitotisk riste-off som kan brukes til å berike for mitotisk celler siden de er mindre tilhenger enn interphase celler6. Men har alle disse teknikkene potensielle ulemper. For eksempel opprettholde ikke alle celletyper levedyktighet i fravær av serum- eller tilstedeværelsen av kjemiske hemmere og avkastningen av cellene etter mitotisk riste-off er begrenset, uten forutgående synkronisering med mitotisk hemmere.
Med unntak av tidlig embryonale cellen sykluser, der celler gradvis reduksjon i størrelse som de dele7, de fleste cellene bla gjennom syklusen gjennomgå vekstfaser og bli større. Denne egenskapen er utnyttet i teknikken for motstrøm sentrifugal elutriation (CCE), som kan brukes til å skille celler ulik størrelse og dermed i cellen syklus fase8,9. Screen, celler er under påvirkning av to motstridende krefter: sentrifugalkraften, som driver cellene fra rotasjonsaksen, og flytende hastighet (motstrøm), som driver cellene mot rotasjonsaksen (figur 1). Celler i det elutriation kammeret nå en likevekt stillingen der disse styrkene er like. De viktigste faktorene dikterer likevekt stillingen er cellen diameter og tetthet. Som flyten hastighet på buffer løsning er økt og motstrøm dra kraft enn sentrifugalkraften, en ny likevekt er etablert, forårsaker en endring i plasseringen av celler inne i kammeret. Alle celler flyttes mot kammer utgangen, resulterer i mindre de forlater kammeret først mens større cellene bo innenfor kammeret til motstrøm hastigheten er økt tilstrekkelig til å fremme sine avslutte. Cellene unnslippe elutriation kammeret med en påfølgende økning i motstrøm rate kan samles i bestemte fraksjoner og hver fraksjon inneholder celler med sekvensielt øke størrelser. I stedet for å gjennomføre elutriation med trinnvis økning i motstrøm rate, vil sekvensielle nedgang i sentrifugalkraften ved å redusere sentrifugering hastighet oppnå samme resultat. Prosessen av elutriation krever optimalisering av celle type, elutriation buffer ansatt og bestemt apparater. Frekvensen av sedimentering celler under disse forholdene er best beskrives Stokes loven: SV = [d2(ρp– ρm) / 18η] .ω2r, der SV = sedimentering hastighet; d = diameter av partikkel; Ρp = tetthet av partikkel; Ρm = tettheten av bufferen; Η = viskositet av bufferen; Ω = vinkelhastighet av rotoren; og r = radial posisjon av partikkel. Dermed SV er proporsjonal med cellen diameter og tetthet, og siden diameter er opphøyd andre, den bidrar mer betydelig enn tetthet som er vanligvis konstant gjennom cellen syklus.
En viktig fordel med Screen er at cellene ikke utsettes for harde forhold av kjemisk behandling eller ernæringsmessig deprivasjon og kan gjenopprettes i utmerket avkastning i hovedsak Uaffisert. Et krav er at cellene aktuelle gjennomgå en betydelig økning i diameter, på minst 30%, som de traversen cellen syklus. Den største ulempen er kostnadene av spesialiserte sentrifuge, rotor og tilbehør. Likevel har muligheten til å forberede celler beriket bestemt celle syklus faser av Screen mye lettere celle syklus forskning i organismer fra gjær pattedyrceller9,10. Videre utvide nylige fremskritt bruker til separasjon av celler fra sunn mot kreft tissue, separasjon av ulike celletyper i heterogene blandinger og produksjon av spesifikke celletyper for immunterapi9.
Vår store interesse har vært forstå virkningsmekanismen av microtubule målretting agenter (MTAs) som vinca alkaloider og taxanes. Disse stoffene var tenkt å fungere i mitose, blokkerer spindel microtubule funksjonen11,12, men nyere bevismateriale tyder på de kan også målrette interphase piskehale som henger13,14. Vi har nylig rapportert at primære akutt lymfatisk leukemi (alle) celler gjennomgå død i enten den G1 fasen eller i M fase når behandlet med vincristine og andre MTAs i en celle syklus-avhengige måte15. Muligheten til å dele alle celler i forskjellige cellen syklus faser av Screen var medvirkende i å nå denne konklusjonen. I denne artikkelen vi beskrive de tekniske detaljene og tilbyr praktiske tips for bruk av Screen til utarbeidelse av primære alle celler i forskjellige cellen syklus faser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrevet en metode for å få primære alle celler i forskjellige faser av cellen syklus bruker Screen. Under optimale forhold en i hovedsak ren populasjon av celler i G1 fase og høyanriket innbyggere celler i G2/M faser kan lett fås i god avkastning, og cellene høyanriket i S fase kan også oppnås hvis ønskelig. Resultatene presenteres her ble innhentet med en primær alle kultur (spesielt alle-5), og i hovedsak identiske resultater er anskaffet med en uavhengig kultur, ALL-215. I ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH CA109821 (å TCC). Vi takker Beckman Coulter sjenerøst gir midler til å dekke publikasjonen kostnader og teknisk assistanse i oppsett og drift av elutriation. Vi takker Dr. Fred Falkenburg for å gi første primære alle kulturer.
Materials
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD – 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
- Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
- Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
- Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
- Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
- Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
- Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
- Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
- Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
- Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
- Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
- Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
- Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
- Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).
