Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından
Summary
Bu iletişim kuralı birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayırmak için santrifüj elutriation açıklar.
Abstract
Hücreleri eşitlemek için yetenek hücre döngüsü Yönetmeliği anlayışımızı ilerleyen merkezi olmuştur. Ortak teknikler istihdam serum yoksunluk içerir; hücreleri farklı hücre döngüsü aşamaları tutuklama kimyasallar; veya Mitotik sallamak-hangi azaltılmış onların bağlılık yararlanan kapalı kullanımı. Ancak, tüm bu dezavantajları var. Örneğin, serum açlık normal hücreleri için iyi ama daha az tümör hücreleri nedeniyle onkogen harekete geçirmek ya da Tümör baskılayıcı kaybı güvenliği aşılan hücre döngüsü kontrol noktaları ile iyi çalışır. Benzer şekilde, kimyasal tedavi hücre popülasyonlarının ilaçla zarar liman ve stres ile ilgili değişiklikler gösterir. Hangi bu sorunları circumvents bir akışlı santrifüj elutriation (CCE), nerede hücreleri iki karşıt güç, merkezkaç kuvveti ve hücre boyutu ve yoğunluğu temelinde ayrılması sonucunda sıvı hız tabi tekniktir. Hücreler arasında geçiş yapma genellikle ilerleyen büyütmek, CCE hücreler farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayırmak için kullanılabilir. Burada birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri için bu tekniği uygulamak. Optimal koşullar altında G1 evresi hücrelerde aslında saf bir nüfusa ve G2/M aşama hücre zenginleştirilmiş bir nüfus içinde mükemmel verim elde edilebilir. Bu hücre popülasyonlarının ideal eğitim hücre döngüsü bağlı mekanizmaları eylem antikanser ilaçların ve diğer uygulamalar için uygundur. Biz de nasıl değişiklikler standart bir prosedür olabilir suboptimal performansa yol göstermek ve teknik sınırlamaları tartışıyorlar. Sunulan ayrıntılı metodoloji uygulama ve araştırma tekniği hücreleri diğer türleri için kolaylaştıracaktır.
Introduction
Genellikle zaman uyumsuz olarak kültürlü hücrelerin büyümesine ve tek tek hücreler hücre döngüsünün farklı aşamalarında mevcuttur. Bazı organizmalar doğal olarak zaman uyumlu hücre döngüsü sergi veya belirli fizyolojik uyaranlar tarafından eşitlenebilir. Örneğin, bir çok zaman uyumlu moda1ve Desmodesmus quadricauda açık ve koyu alternatif tarafından senkronize edilebilir yeşil algler hücrelerinin çekirdekleri içinde sümük kalıp Physarum polycephalum dev plasmodia bölmek dönem2. Bu tür organizmalar benzersiz deneysel öznitelikleri sunarken, yeterli ölçüde memeli hücreleri karmaşıklığı modeli. Memeli hücre popülasyonlarının yapay olarak eşitlemek için yetenek hücre döngüsü Yönetmeliği anlayışımızı ve hücre döngüsü kontrol noktaları moleküler temeli ilerleyen merkezi olmuştur. Ortak yöntemleri serum yoksunluğu, kimyasal blok ve yayın veya fiziksel özellikleri3,4istismar olabilir. Serum geri çekilmesi kez sendika girmek hücreleri neden olur ve yeniden ekleme serum G1 faz5hücre döngüsü iniş teşvik etmektedir. Kimyasal inhibitörleri aşırı timidin G1/S sınır hücreleri engellemek hidroksiüreye veya genellikle hücre M faz3,4tutuklama Mikrotubul inhibitörleri gibi ajanlar içerir. Mitotik sallamak-onlar Interphase hücreleri6‘ dan daha az yapışık olduğundan kullanılabilecek zenginleştirmek için Mitotik hücre dışı fiziksel özellikleri istismar bir yaklaşım içerir. Ancak, tüm bu tekniklerin potansiyel sakıncaları var. Örneğin, Mitotik sallamak-off olmadan önceki eşitleme Mitotik inhibitörleri ile sınırlıdır sonra tüm hücre tipleri canlılığı serum veya kimyasal inhibitörleri varlığı yokluğu ve hücreleri verimini korumak.
Nerede onlar7bölmek gibi hücreleri aşamalı olarak boyutu küçülür, erken embriyonik hücre döngüsü dışında çoğu hücre döngüsü boyunca ilerleyen büyüme fazları geçmesi ve daha büyük hale. Bu özellik boyut olarak farklı hücreleri ayırmak için kullanılan ve dolayısıyla Hücre döngüsünde8,9aşama kanatlı santrifüj elutriation (CCE), teknikte istismar edilir. CCE sırasında iki karşıt güç etkisi altında hücrelerdir: hücreler dönüş ekseni uzak sürücüler, merkezkaç kuvveti ve dönüş (şekil 1) eksenini karşı hücreleri sürücüler akışkan hızı (kanatlı),. Elutriation odası hücrelerde bu kuvvetlerin eşit olduğu bir denge konuma ulaşmak. Hücre çapı ve yoğunluk denge konumu dikte anahtar faktörlerdir. Akış Arabellek çözüm oranı artar ve kanatlı sürükle kuvvet merkezkaç kuvveti daha ağır basar, hücrelerin odası içinde konumunu bir değişiklik neden yeni bir denge kurulmuştur. Tüm hücreleri ise kanatlı oranı yeterince kendi çıkış tanıtmak için artış kadar büyük hücreleri odası içinde kal küçük olanlar öncelikle, oda bırakarak kaynaklanan odası çıkış doğru kaydırılır. Elutriation odası ardışık kanatlı oranı artış ile kaçan hücreleri belirli kesirler toplanabilir ve her kesir sırayla boyutları artan hücreler içerir. Artımlı kanatlı oranı artış ile elutriation iletken yerine, merkezkaç kuvveti tarafından Santrifüjü hızı azalan sıralı düşüşler aynı sonuca ulaşmak. Elutriation süreç optimizasyonu bağlı olarak hücre tipi, istihdam elutriation arabellek ve kullanılan belirli cihazları gerektirir. Bu koşullar altında hücre sedimantasyon oranı en iyi Stokes yasa ile anlatılan: SV = [d2(ρp– ρm) / 18η] .ω2r, nereye SV = sedimantasyon hızı; d = çap parçacık; Ρp = yoğunluğu parçacık; Ρm = yoğunluğu arabelleği; Η viskozite arabelleği; = Ω = açısal hızı Open End; ve r = parçacığın Radyal konumu. Böylece, SV hücre çapı ve yoğunluğu ile doğru orantılıdır ve çapı ikinci kuvvetine yükseltilmiş beri daha da önemlisi hangi hücre döngüsünün genellikle sabittir yoğunluğu daha katkıda bulunur.
CCE önemli bir avantajı hücreleri kimyasal arıtma veya besin yoksunluğu sert koşullara tabi değil ve mükemmel verim aslında soğukkanlı kurtarılabilir olduğunu. Hücre döngüsü Travers olarak söz konusu hücreler çapı, en az % 30, önemli bir artış geçmesi zorunludur. Ana dezavantajı ise özel santrifüj, rotor ve aksesuarları maliyetidir. Yine de, hücreleri belirli hücre döngüsü aşamalarında CCE tarafından zenginleştirilmiş hazırlamak yeteneği büyük ölçüde hücre döngüsü araştırma memeli hücreleri9,10üzerinden Maya organizmalarda kolaylaştırdı. Ayrıca, son gelişmeler kullanır üzerinden kanserli doku, farklı hücre tipleri heterojen karışımları ve belirli hücre tiplerinin immünoterapi9üretim için ayrılması karşı sağlıklı hücreleri ayırma için arttırıyoruz.
Bizim büyük ilgi ajanlar (MTAs) Cezayir menekşesi alkoloidler ve taxanes gibi hedefleme Mikrotubul hareket mekanizması anlamakta olmuştur. Bu ilaçların iğ Mikrotubul işlevi11,12, engelleme sadece mitoz içinde hareket düşünüldü ama onlar da Interphase mikrotübüller13,14hedefleyebilir son kanıtlar gösteriyor. Biz son zamanlarda birincil Akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücreleri ya da ölümde G1 evresi geçmesi veya M yılında vincristine ve hücre döngüsü bağlı şekilde15dakika sonra diğer MTAs ile tedavi ederken aşama bildirdi. Farklı hücre döngüsü aşamaları CCE tarafından tüm hücreler ayrı yeteneği bu sonuca ulaşmada vesile oldu. Bu makalede, biz teknik ayrıntıları açıklamak ve CCE uygulamaya İlköğretim hazırlanması için pratik ipuçları tüm hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
CCE kullanarak hücre döngüsünün farklı aşamalarında tüm hücreleri birincil elde etmek için bir yöntem anlatmıştık. Optimal koşullar altında G1 evresi hücrelerde aslında saf bir nüfusa ve G2/M aşama hücre zenginleştirilmiş bir nüfus kolayca mükemmel verim elde edilebilir ve son derece S aşamasında zenginleştirilmiş hücreleri de istenirse edinilebilir. Sonuçları burada sunulan bir birincil tüm kültür (özellikle, ALL-5) ve temelde aynı sonuçlar elde edilen bağımsız bir kültür ile …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH CA109821 (TCC için) tarafından desteklenmiştir. Beckman Coulter cömertçe yayın maliyetlerini karşılamak için fon sağlamak için ve teknik yardım kurulum ve elutriation sisteminin çalışması için teşekkür ederiz. Biz Dr Fred Falkenburg ilk İlköğretim tüm kültürler için teşekkür ederiz.
Materials
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD – 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
- Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
- Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
- Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
- Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
- Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
- Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
- Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
- Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
- Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
- Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
- Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
- Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
- Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).
