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Neuroscience

उच्च सामग्री के लिए परख विकास Sod1 उत्परिवर्ती प्रोटीन समग्र गठन के रहने की कोशिकाओं में ठहराव

Published: October 4, 2017 doi: 10.3791/56425
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1Automation & Logistics Management, Screening Sciences & Novel Assay Technologies, Institut Pasteur Korea, 2School of Pharmacy, Sungkyunkwan University, 3Technology Development Platform, Institut Pasteur Korea

Summary

हम एक विधि का वर्णन करने के लिए प्रकट प्रोटीन का एकत्रीकरण मात्रा । हमारे प्रोटोकॉल विवरण lentiviral प्रेरित स्थिर सेल लाइन पीढ़ी, स्वचालित फोकल इमेजिंग, और प्रोटीन समुच्चय की छवि विश्लेषण । एक उदाहरण के आवेदन के रूप में, हम एक समय में SOD1 एकत्रीकरण को बढ़ावा देने में छोटे अणुओं के प्रभाव का अध्ययन किया और खुराक-निर्भर तरीके से.

Abstract

पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (एस) एक घातक neurodegenerative रोग है कि जीन एंकोडिंग तांबा-जस्ता सुपरऑक्साइड dismutase 1 (SOD1) में विरासत में उत्परिवर्तनों के कारण हो सकता है । SOD1 की संरचनात्मक अस्थिरता और SOD1-एस रोगियों में सकारात्मक समावेश का पता लगाने के लिए एक संभावित कारण भूमिका का समर्थन करता है और एस विकृति विज्ञान में समग्र SOD1 । इस अध्ययन में, हम उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के दृष्टिकोण से जीवित कोशिकाओं में SOD1 एकत्रीकरण की गतिशीलता को बढ़ाता है एक सेल आधारित परख के विकास का वर्णन । lentiviral वैक्टर का उपयोग करना, हम स्थिर सेल जंगली प्रकार व्यक्त लाइनों और उत्परिवर्ती A4V SOD1 पीली फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग की गईं और पाया कि दोनों प्रोटीन एकत्रीकरण के किसी भी हस्ताक्षर के बिना cytosol में व्यक्त किया गया था उत्पंन । दिलचस्प है, केवल SOD1 A4V छुरा HEK-२९३ में व्यक्त की है, लेकिन U2OS या एसएच SY5Y सेल लाइनों में नहीं, proteasome अवरोध करनेवाला उपचार पर समुच्चय का गठन किया । हमें पता चलता है कि यह खुराक के आधार पर एकत्रीकरण करने के लिए संभव है-विभिन्न proteasome अवरोधकों की प्रतिक्रिया विश्लेषण, और समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा कुल गठन कैनेटीक्स ट्रैक करने के लिए. हमारे दृष्टिकोण कुल गठन में SOD1 की भूमिका पर एस उत्परिवर्तनों के प्रभाव को बढ़ाता है और साथ ही छोटे अणुओं है कि SOD1 A4V एकत्रीकरण को रोकने के लिए स्क्रीनिंग की संभावना का परिचय ।

Introduction

प्रोटीन एकत्रीकरण एक जैविक प्रक्रिया है जिसके द्वारा प्रोटीन समूह अप और neurodegenerative रोगों (amyloidosis) में प्रेरणा का एजेंट के रूप में कार्य कर सकते हैं । निस्र्पक प्रोटीन एकत्रीकरण सेलुलर रोग में समुच्चय की भूमिका को समझने में के रूप में अच्छी तरह के रूप में नए कारकों है कि विकृति की शुरुआत को प्रभावित की खोज को सुविधाजनक बनाने में आवश्यक है । प्रतिदीप्ति के दृश्य-कोशिकाओं में रहने वाले प्रोटीन टैग उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (HCS)1,2,3,4के लिए लागू परख के विकास में सहायता कर सकते है जो एक शक्तिशाली तरीका है ।

पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (एस) समग्र करने के लिए प्रवृत्ति के साथ एक प्रकट प्रोटीन की उपस्थिति के कारण एक proteopathic रोग के रूप में माना जाता है और दोनों पारिवारिक एस (fALS) और छिटपुट एस में मोटर न्यूरॉन्स में जमा (sALS)5,6 . fALS मामलों के ~ 20% का एक सबसेट जीन cytosolic एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम तांबा-जस्ता सुपरऑक्साइड dismutase प्रकार 1 (SOD1)7,8एंकोडिंग में प्रमुख उत्परिवर्तनों के साथ जुड़े रहे हैं । इस आनुवंशिक रूप से व्युत्पंन शिथिलता के लिए कई संभावित कारणों का प्रस्ताव किया गया है, संरचना और SOD1 वेरिएंट के समारोह में परिवर्तन सहित, जैसे ंयायपालिका स्थिरता, बढ़ खुलासा दर, और कुल करने के लिए प्रवृत्ति9, 10. विशेष रूप से, केवल सत्यापित और संभावित विषाक्त दोनों एस-लिंक्ड SOD1 वेरिएंट और जंगली प्रकार (WT) द्वारा साझा संपत्ति SOD1 compartmentalized प्रोटीन समुच्चय या proteinaceous समावेशन के रूप में एक वृद्धि की प्रवृत्ति है11,12 . reSOD1ed उत्परिवर्ती, लगातार polyubiquitinated है और ubiquitin-proteasome प्रणाली द्वारा नीचा । नतीजतन, proteasome गतिविधि के निषेध के एक निम्न स्तर के उत्परिवर्ती SOD1 समुच्चय के संचय की ओर जाता है13,14, जो अमली रूप से घुलनशील घटकों से बना संरचनाओं के फार्म का है कि घुलनशील उत्परिवर्ती के साथ आदान प्रदान कर सकते हैं SOD1 cytosol15में । विशेष रूप से, SOD1 उत्परिवर्ती A4V (4 codon में alanine वैलिन को बदल दिया) सबसे आम एस उत्परिवर्तन के कारण है, और एक औसत से कम 2 साल के अस्तित्व के समय के साथ तेजी से neurodegeneration की ओर जाता है रोग की शुरुआत के बाद16। जैव रासायनिक, SOD1 A4V monomerize, कुल के लिए एक वृद्धि की प्रवृत्ति है, और फार्म amyloid pores; इसकी ताकना की तरह समुच्चय अंय रोग के amyloid pores जैसे α-synuclein और β-amyloid17प्रोटीन के रूप में, जुड़े उत्परिवर्ती रूपों, के समान हैं । SOD1-समग्र संचय की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, घुलनशील और अघुलनशील SOD1 समग्र रूपों की निगरानी के लिए तरीके विकसित किए जाने के लिए रहते हैं ।

हम पहले से दिखाया है, लाइव सेल इमेजिंग और HEK-२९३ कोशिकाओं क्षणिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ transfected-SOD1 टैग का उपयोग कर, कि एस-जुड़े उत्परिवर्तनों SOD1 dimerization और एकत्रीकरण11ख़राब । हालांकि क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली अल्पकालिक जीन एक्सप्रेस के जैविक परिणाम के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं, वांछित जीन के स्थिर एकीकरण उपलब्ध कराने के तरीकों परख विकास के लिए पसंद किया जा सकता है । जैसे, lentiviral वैक्टर स्तनधारी कोशिकाओं 18पर दीर्घकालिक और विनियमित जीन अभिव्यक्ति प्रदान करने की क्षमता प्रदान करते हैं । इस अध्ययन में, हम स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी पर ध्यान केंद्रित संयोजक lentivirus असर WT और उत्परिवर्ती SOD1 पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) के साथ टैग के साथ transduced । SOD1 एकत्रीकरण के लाइव सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी और स्वचालित ठहराव का उपयोग करना, हम ट्रिगर और proteasome के निषेध पर SOD1 एकत्रीकरण की घटनाओं मात्रा ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. Lentivirus उत्पादन

< p class = "jove_content" > नोट: lentiviral वैक्टर के उत्पादन और हेरफेर बाहर किया गया था के अनुसार राष्ट्रीय स्वास्थ्य के संस्थान (NIH) को शामिल अनुसंधान के लिए दिशानिर्देश संयोजक डीएनए. प्लाज्मिड एंकोडिंग जंगली प्रकार और A4V उत्परिवर्ती SOD1 बढ़ाया YFP के साथ टैग (SOD1WT-YFP और SOD1A4V-YFP) किम एट अल में वर्णित हैं । < सुप वर्ग = "xref" > ११ दोनों जीन फ्यूजन उत्पादों को प्रवर्धित कर रहे थे पीसीआर प्राइमरी पेयर 5 & #8242;-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3 & #8242; और 5 & #8242;-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 & #8242; और pTRIP-डेल्टा U3 सीएमवी में डाला प्लाज्मिड < सुप वर्ग = "xref" > १९ प्रयोग XhoI व BsrGI प्रतिबन्ध करेल. पूर्व प्रयोगों में, HEK-293T कोशिकाओं को हर दो दिन में 1:4 से 1:6 के अनुपात में विभाजित किया गया. 20 से अधिक मार्ग के परिहार और कम ६०% पर कोशिकाओं के रखरखाव के प्रवाह को अच्छी अभिकर्मक क्षमता सुनिश्चित करने में मदद करता है ।

  1. पर दिन 1, भाजित HEK-293T कोशिकाओं में 30-40% संगम पर एक 10 सेमी व्यास ऊतक संस्कृति प्लेट (3 x 10 6 कोशिकाओं/डिश) सेल संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर में (उच्च ग्लूकोज DMEM के साथ 10% FBS और 4 मिमी एल-glutamine) वायरस उत्पादन के लिए.
  2. एक सह में 10 सेमी व्यास ऊतक संस्कृति प्लेट रखने के 2 मशीन (३७ & #176; C, 5% सह 2 ) रातोंरात.
    3. 2 दिवस पर
  3. , एक DNA अभिकर्मक समाधान तैयार करना जिसमे 10 & #181; छ lentiviral वैक्टर (pTRIP-डेल्टा U3 सीएमवी-SOD1WT-YFP or-SOD1A4V-YFP) के साथ मिलकर lentiviral पैकेजिंग plasmids (5 & #181; g के pVSVg; 10 & #181; g of pCMV-dr 8.71) ( < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ) < सुप वर्ग = "xref" > २० . Add १२५ & #181; l के 1 M CaCl 2 और मात्रा को समायोजित करने के लिए ५०० & #181; l आसुत जल का प्रयोग । धीरे जोड़ें ५०० & #181; के एल ०.०५ एम HEPES मिश्रण में और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
  4. की जगह HEK-293T कोशिकाओं के माध्यम से 10 मिलीलीटर पूर्व गर्म ताजा संस्कृति मध्यम एंटीबायोटिक-मुक्त मिश्रित के साथ 1 मिलीलीटर डीएनए अभिकर्मक समाधान और रात भर में ३७ & #176; ग, 5% कं 2 .
    5. 3 दिन पर
  5. , ताजा संस्कृति माध्यम के साथ सेल supernatant की जगह ।
    6. 4 दिन पर
  6. , एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में supernatant फसल और ५०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक को मृत कोशिकाओं और मलबे को हटा दें । इसके अलावा एक ०.४५ & #181 के माध्यम से इसे पारित करके supernatant शुद्ध; एम फिल्टर एक बड़ी ६० मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर. एकल उपयोग aliquots (३०० & #181; L) में तुरंत वितरण करें, और स्टोर पर-८० & #176; C. अधिकतम उत्पाद गतिविधि बनाए रखने के लिए, एक फ्रीज-गल चक्र से बचें ।
< p class = "jove_title" > 2. Lentiviral transduction

  1. सेल लाइन ६०% संगम (HEK-२९३ कोशिकाओं और एसएच-SY5Y पर संक्रमित होने के लिए विभाजित; 5 x 10 5 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से और U2OS; 1 x 10 5 कोशिकाओं को प्रति well) में एक 6-well टिशू कल्चर प्लेट में 2 मिलीलीटर DMEM मीडिया के साथ पूरक 10% FBS.
  2. 6-well टिशू कल्चर प्लेट रखने में एक ३७ & #176; सी मशीन पर 5% कं 2 रात भर.
  3. से जम lentivirus निकाल-८० & #176; सी फ्रीजर और गल प्रत्येक प्रयोग से पहले बर्फ पर एक aliquot; reफ्रीज़ न करें.
  4. जबकि वायरस गल रहा है, सेल संस्कृति माध्यम को गर्म करने वाले सीरम युक्त ब्याज की सेल लाइन के साथ संगत । एक बार वायरस पूरी तरह से गल गया है, एक ताजा १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब में DMEM में कमजोर पड़ने की एक सीमा (1:3, 1:10, 1:30, और 1:100) तैयार करते हैं ।
  5. ट्यूबों में मात्रा लाने के लिए कम सीरम मीडिया के साथ 1 मिलीलीटर ।
  6. Add 2 & #181; l के Polybrene (4 & #181 के एक स्टॉक पर; g/& #181; l) से 1 मिलीलीटर के वायरस/ pipetting द्वारा अच्छी तरह मिलाएं और कोशिकाओं को मिश्रण के 1 मिलीलीटर जोड़ें । 24 एच
    7. के लिए वायरस के साथ कोशिकाओं की मशीन
  7. वायरस मीडिया निकालें और सामान्य DMEM मीडिया के साथ प्रतिस्थापित 10% FBS के साथ पूरक । ३७ पर कोशिकाओं को बनाए रखना & #176; ग, 5% कं 2 .
  8. कोशिकाओं के विकास की निगरानी और संस्कृति मीडिया हर दो दिन में बदल जाते हैं । संगम में, 6-एक 10-cm व्यास ऊतक संस्कृति की थाली में अच्छी तरह से पकवान का विस्तार करें ।
  9. एक बार कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से विस्तारित किया गया है, बीज १.५ x 10 4 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से ५० & #181; DMEM मीडिया के एल ३८४ पर-अच्छी तरह से परख प्लेटों YFP के अभिव्यक्ति स्तर की जांच करने के लिए सूक्ष्म द्वारा प्रोटीन टैग । यदि YFP चिह्नित प्रोटीन सेल अभिव्यक्ति एक संकेत के लिए शोर अनुपात & #8805; 3, संबंधित सेल लाइन के लिए सेल स्टॉक तैयार दिखाता है ।
< p class = "jove_title" > 3. प्रोटीन एकत्रीकरण पर proteasome अवरोधक के समय निर्भर प्रभाव

< p class = "jove_content" > नोट: एक स्वचालित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि अधिग्रहण प्रदर्शन ( सामग्री देखें).

  1. औषधालय ०.२५ & #181; DMSO या proteasome अवरोध करनेवाला के एल में भंग १००% DMSO (ALLN, 2 मिमी) ३८४ पर-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटें.
  2. मैंयुअल रूप से बीज १.५ x 10 4 कोशिकाओं प्रति well in ५० & #181; एक ही परख प्लेट पर DMEM मीडिया के एल. proteasome अवरोध करनेवाला (ALLN) अंतिम एकाग्रता होनी चाहिए 10 & #181; M.
  3. माइक्रोस्कोप प्रणाली पर्यावरण नियंत्रण इकाई की स्थापना के लिए ३७ & #176; ग और 5% कं 2 । प्रायोगिक स्थापक का एक स्क्रीनशॉट < सुदृढ वर्ग में दिखाया गया है = "xfig" > चित्रा ३ .
  4. व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति मोड में माइक्रोस्कोप संचालित, निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर: LWD 20X उद्देश्य, गैर-फोकल मोड, 4 क्षेत्रों/ठीक है, एक घंटे के एक कैद अंतराल के साथ. प्रत्येक रन के अंत में, कब्जा कर लिया छवियों को स्वचालित रूप से सर्वर पर अपलोड कर रहे हैं.
< p class = "jove_title" > 4. समय चूक इमेजिंग जीवित कोशिकाओं में YFP अभिव्यक्ति के लिए, और छवि विश्लेषण (एकल चैनल)

< p class = "jove_content" > नोट: निम्न चरणों का वर्णन अनुप्रयोग के सॉफ़्टवेयर ( उदा. , कोलंबस).

  1. प्राथमिक ऑब्जेक्ट्स (cytosol और एग्रीगेट) सेगमेंट करने के लिए उपयुक्त एल्गोरिथम का चयन करें. यदि आवश्यक हो, तो पृष्ठभूमि थ्रेशोल्ड और कंट्रास्ट पैरामीटर्स समायोजित करें (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 4 ).
  2. गणना कक्ष & #39 का उपयोग कर रहा है; YFP तीव्रता चैनल के लिए ०.१ की एक व्यक्तिगत सीमा के साथ कोशिकाओं & #39; खोजें । एक & #39 का उपयोग करते हुए समुच्चय का निर्धारण; find स्पॉट & #39; कलन के साथ एक सापेक्ष YFP स्थान तीव्रता & #62; ०.२ और १.०.
    3. के एक बंटवारे गुणांक
< p class = "jove_title" > 5. खुराक प्रतिक्रिया अपने नाभिक (दो चैनलों) के लिए दाग रहने वाली कोशिकाओं पर प्रोटीन एकत्रीकरण पर proteasome अवरोधकों का प्रभाव

< p class = "jove_content" > नोट: एक स्वचालित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि अधिग्रहण करते हैं । proteasome अवरोधकों की एकाग्रता सीमा का निर्धारण (ALLN, Epoxomicin, और MG132) अपेक्षित आईसी ५० मूल्य के आधार पर एक इष्टतम वक्र फिट सुनिश्चित करने के लिए ।

  1. मानक 1:3 कमजोर पड़ने श्रृंखला द्वारा एक ३८४-अच्छी तरह से भंडारण के प्लेट पर यौगिकों के धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करते हैं । यौगिक कमजोर पड़ने वालों को अच्छी तरह मिक्स करने के लिए सुनिश्चित करें कि चक्रवृद्धि सांद्रता सटीक हैं ।
  2. औषधालय ०.२५ & #181; खाली फ्लैट के नीचे काले ३८४-अच्छी तरह से परख प्लेट पर proteasome अवरोधकों के एल । हम एक तरल एक ३८४-केशिका सिर मात्रा में स्थानांतरित करने में सक्षम के साथ सुसज्जित हेंडलर का उपयोग करें ।
  3. बीज १.५ x 10 4 कोशिकाओं प्रति कुआं में ५० & #181; परख प्लेटों पर DMEM मीडिया के एल. ३७ पर परख प्लेटें मशीन & #176; ग और 5% कं 2 के लिए 24 ज.
  4. Add 10 & #181; DMEM मीडिया के एल (पूर्व ३७ पर गरम & #176; C) धुंधला समाधान के साथ (10 मिलीग्राम/एमएल के एक शेयर पर ३३३४२ Hoechst) और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  5. माइक्रो लॉंचसामना ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर । प्रायोगिक सेटअप का एक स्क्रीनशॉट < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 6 में दिखाया गया है । select & #34; कॉन् & #34; tab और select 20X & #160; उद्देश्य और सही प्लेट प्रकार । चत & #34; कालर & #34; अलग प्लेट प्रकार के साथ उचित ध्यान देने की अनुमति उद्देश्य पर सही मूल्य के लिए सेट है ।
  6. Select & #34; माइक्रोस्कोप & #34; टैब YFP (४८८ लेज़र) और Hoechst (४०५ लेज़र) के रूप में एक्सपोज़र 2 के रूप में एक्सपोज़र 1 निर्धारित करें । दोनों जोखिम पर फिल्टर को सक्रिय करने और 2 कैमरे के लिए 1 और जोखिम 2 कैमरे के लिए जोखिम आवंटित । सेट एक्सपोजर के लिए समय ~ ८०० जोखिम के लिए ms 1 और ~ ४० जोखिम के लिए ms 2.
  7. का चयन करें एक्सपोजर 1. सेट फोकस ऊंचाई 0 & #181; m. चय & #34; फोकस & #34;. एक बार ध्यान केंद्रित, कैमरा 1 बेनकाब । फोकस ऊंचाई समायोजित करने के लिए जोखिम विमान का अनुकूलन और पर क्लिक करें & #34; लो कद & #34;. जोखिम बार और लेजर शक्ति बदलें ~ ३,००० की अधिकतम पिक्सेल तीव्रता देने के लिए । एक्सपोज़र पैरामीटर्स सहेजें । जोखिम के लिए दोहराएं 2.
  8. Select & #34; प्रयोग परिभाषा & #34; tab. लेआउट और उपलेआउट बनाएं । प्रासंगिक लेआउट, एक्सपोज़र, संदर्भ छवि, skewcrop फ़ाइल और उपलेआउट को खींचें और छोड़ें । प्रयोग सहेजें.
  9. Select & #34; स्वचालित प्रयोग & #34; टैब और छवियों का अधिग्रहण । प्रत्येक रन के अंत में, कब्जा कर लिया छवियों को स्वचालित रूप से सर्वर पर अपलोड कर रहे हैं.
< p class = "jove_title" > 6. दो चैनल छवियों की छवि विश्लेषण

  1. प्राथमिक ऑब्जेक्ट्स खंड करने के लिए सॉफ़्टवेयर एल्गोरिथ्म का चयन करें (नाभिक, cytosol, और एग्रीगेट) (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ७ ).
  2. उस विधि का चयन करें जो सेगमेंटेड ऑब्जेक्ट्स के विज़ुअल निरीक्षण द्वारा नाभिक को सही करता है. Hoechst-1 चैनल में सना हुआ ऑब्जेक्ट्स (Ch1) कक्षों की संख्या निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाएगा । YFP के उत्परिवर्ती SOD1-A4V चैनल 2 (Ch2) से धुंधला करने के लिए समुच्चय की मात्रा का निर्धारण किया जाएगा ।
  3. गणना कक्षों का उपयोग कर & #39; find नाभिक & #39; कलन के रूप Hoechst-धुंधलान क्षेत्रको & #62; 20 & #181; m 2 , ७.० के विभाजन कारक के साथ, ०.४० की एक व्यक्ति थ्रेशोल्ड, और एक कंट्रास्ट & #62; ०.१०.
  4. डेटा तालिका बनाने और चुनाव आयोग ५० का उपयोग कर प्रत्येक यौगिकों के लिए & #39; गैर रेखीय प्रतीपगमन & #39; ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर में समीकरण ।

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Representative Results

lentivirus का उपयोग करके स्थिर सेल लाइन जनरेट कर रहा है: SOD1 प्रोटीन समुच्चय की निगरानी के लिए समग्र रणनीति चित्रा 1में सचित्र है । पहले चरण में, हम एक lentiviral अभिव्यक्ति वेक्टर SOD1 स्थिर जीन वितरण के लिए सेल लाइनों (चरण 1) में उत्पंन । दो lentiviral वैक्टर एंकोडिंग YFP-tagged SOD1 WT और SOD1 A4V (SOD1WT-YFP and SOD1A4V-YFP, क्रमशः) पैकिंग और लिफाफा plasmids के साथ (चित्र 2a) तैयार किए गए थे । पर lentiviral transduction (चरण 2) सेल लाइनों का परीक्षण (HEK-२९३, U2OS, और एसएच-SY5Y) स्वस्थ बने रहे, उच्च अभिव्यक्ति का स्तर दिखाया (चित्रा 2 बी), और दीर्घकालिक YFP लेबलिंग चाहे SOD1 फार्म । दिलचस्प बात यह है कि न तो WT और न ही उत्परिवर्ती SOD1 तीन सेल लाइनों जो दिखाई एकत्रीकरण दिखाया, क्षणिक अभिव्यक्ति सेलुलर मॉडल पहले11परीक्षण के विपरीत में व्यक्त की ।

स्थिर कक्ष रेखाओं को SOD1 एग्रीगेट के लिए मांय करना और उसके डायनेमिक का अध्ययन करना: reSOD1ed SOD1 उत्परिवर्ती के सेलुलर संचय पर समग्र गठन को ट्रिगर करने के लिए, हम proteasome अवरोध करनेवाला ALLN का इस्तेमाल किया (यह भी calpain मैं और द्वितीय अवरोध करनेवाला कहा जाता है; Ki = १९० और २२० एनएम क्रमशः), पहले एक क्षणिक SOD1 अभिव्यक्ति सेलुलर मॉडल11का उपयोग कर मांय । SOD1 एग्रीगेट की जांच HEK-२९३, U2OS, और एसएच-SY5Y सेल लाइंस transduced के साथ SOD1WT-YFP और SOD1A4V-YFP के साथ की गई । proteasome अवरोधक ALLN के साथ उपचार (10 µ m) 24 घंटे के लिए दृढ़ता से YFP-२९३ कोशिकाओं में SOD1A4V-HEK समुच्चय के संचय को बढ़ावा (चित्रा 2c). हालांकि, SOD1WT-YFP transduced सेल लाइनों में कोई एकत्रीकरण नहीं पाया गया और एकत्रीकरण के बहुत कम स्तर U2OS और एसएच-SY5Y सेल लाइनों में पाया गया SOD1A4V-YFP transduced SOD1WT-YFP और SOD1A4V-YFP (चित्रा 2c) । इन टिप्पणियों के आधार पर, हम proteasome अवरोध (चरण 3, चित्रा 3) द्वारा प्रेरित SOD1A4V-YFP एकत्रीकरण गठन के गतिशील की जांच करने के लिए समय-चूक माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया और एक एकल YFP का उपयोग SOD1A4V-YFP एकत्रीकरण यों तो. प्रतिदीप्ति चैनल के रहने वाले कोशिकाओं में व्यक्त कोशिकाओं और समुच्चय का पता लगाने के लिए (चरण 4, चित्रा 4). कोशिकाओं की उपस्थिति और ALLN की अनुपस्थिति में वरीयता प्राप्त थे, और ५० घंटे की अवधि के लिए नजर रखी (चित्र 5 ए) । हमारे प्रायोगिक शर्तों के तहत, हम कुल ALLN द्वारा प्रेरित गठन 24 घंटे में एक पठार तक पहुंच पाया और अगले 12 घंटे से अधिक स्थिर रहा । हम बताते है कि कोशिका घनत्व काफी कम 28 घंटे के बाद ALLN के साइटोटोक्सिक प्रभाव का एक परिणाम के रूप में, जबकि सेल संख्या DMSO-इलाज नकारात्मक प्रयोग में वृद्धि हुई है ।

निस्र्पक लघु अणु ईसी ५० एकत्रीकरण गठन के लिए SOD1 सेल मॉडल का उपयोग: SOD1A4V-YFP व्यक्त कोशिकाओं छोटे अणु proteasome अवरोधकों के साथ एक खुराक पर निर्भर तरीके से इलाज किया गया. हम एक परमाणु मार्कर का इस्तेमाल किया SOD1A4V-YFP सेल लाइन है, जो cytosol डिब्बे के भीतर समग्र पता लगाने के लिए लाभप्रद है लेबल । दरअसल, चूंकि प्रत्येक कोशिका में एक नाभिक होता है, नाभिक को सेगमेंट करके और उन्हें कोशिकाओं के जलग्रहण सेगमेंट में बीज के रूप में उपयोग करके, कोशिका सेगमेंट को21सरलीकृत किया जाता है. हम Hoechst धुंधला है, जो कोई विषाक्तता जब एक अल्पकालिक अवधि के लिए इस्तेमाल किया जाता है और कम सांद्रता22, शर्तों जो पिछले समय चूक इमेजिंग प्रयोग में इस्तेमाल नहीं किया गया जाना जाता है इस्तेमाल किया । proteasome अवरोधकों की उपस्थिति में सेल संवर्धन के 24 घंटे के बाद, SOD1A4V-YFP कोशिकाओं 10 मिनट के लिए Hoechst समाधान (10 µ जी/एमएल) के साथ दाग थे । अगले हम Hoechst और YFP एक 20X ०.४ ना उद्देश्य (चरण 5, चित्रा 6) का उपयोग कर के लिए प्रतिदीप्ति छवियों का अधिग्रहण किया । एक छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म जो खाते में सेल नाभिक और SOD1A4V-YFP वितरण लेता है का उपयोग करना, कोशिकाओं छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (चरण 6, चित्रा 7) का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । Hoechst-सना हुआ वस्तुओं पृष्ठभूमि के ऊपर उचित फ्लोरोसेंट तीव्रता का प्रदर्शन और एक नाभिक की रूपात्मक आकार विशेषताओं (चौड़ाई, लंबाई, और क्षेत्र) की पहचान की और छवि विभाजन द्वारा वर्गीकृत किया गया । Hoechst धुंधला से व्युत्पंन परमाणु मुखौटा सेल cytosolic क्षेत्र के भीतर समीपस्थ SOD1A4V-YFP स्थान वितरण को ट्रैक करने के लिए और उपस्थिति या समुच्चय के अभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । नाभिक और धब्बे पता लगाने के आधार पर, समुच्चय बनाम कक्षों का अनुपात परिकलित किया गया था । हमारे परख की संवेदनशीलता का निर्धारण, हम अगले मात्रा एकत्रीकरण SOD1A4V-YFP HEK-२९३ कोशिकाओं तीन अलग proteasome अवरोधकों के साथ इलाज किया (ALLN, MG132, और epoxomicin) एक खुराक एकाग्रता ढंग से जो सक्षम फिटिंग मात्रा डेटा और हमने ६.५३ ± १.१७, ०.१७ ± ०.०६, और ०.०३ ± ०.०३ µ m के ALLN, MG132 और epoxomicin, क्रमशः (चित्रा 8B) के लिए ईसी५० मूल्यों की गणना की । सभी तीन proteasome अवरोधकों के लिए सापेक्ष विषाक्तता अनुयाई Hoechst डाई के साथ अच्छी तरह से लेबल में शेष कोशिकाओं की संख्या को मापने के द्वारा मात्रा था । हमने पाया है कि कुल सेल संख्या यौगिक प्रभाव के जवाब में कमी करने के लिए, के रूप में ६.५८ ± १.०६, ०.१९ ± ०.०३ के समान चुनाव आयोग५० मूल्यों का सबूत है, और ०.०५ ± ०.०१ ALLN, MG132 और epoxomicin के लिए µ एम, क्रमशः ।

Figure 1
चित्र 1. प्रोटीन एकत्रीकरण के सेल-लाइन जनरेशन और उच्च सामग्री विश्लेषण (HCA) के लिए कार्यप्रवाह और टाइमलाइन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. SOD1 WT आणि A4V स्थिर लाईन जनरेशन.
(क) lentiviral और पैकेजिंग वैक्टर के योजनाबद्ध आरेख (पैकिंग और ढंक plasmids) जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती SOD1 A4V lentivirus पीढ़ी के लिए । (ख) तीन कोशिकाओं के चयनित फोकल छवियों (HEK-२९३, U2OS, और एसएच-SY5Y) lentivirus जंगली प्रकार SOD1 (WT) और उत्परिवर्ती SOD1 (A4V) के साथ transduced । (ग) proteasome अवरोधक, ALLN (10 µ मीटर) के साथ 24 घंटे के लिए इलाज तीन स्थिर कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियां । SOD1A4V-YFP समुच्चय HEK-२९३ में प्रचुर मात्रा में उपस्थित (लाल तीर) पाए गए थे, लेकिन U2OS या एसएच-SY5Y कोशिकाओं में विरल उपस्थित थे. छवियां एक 20X उद्देश्य का उपयोग कर अधिग्रहीत की गईं । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
ांग > चित्रा 3. एक समय-चूक नियंत्रित पर्यावरणीय परिस्थितियों (३७ ° c और 5% CO2) के साथ एक माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग कर के लिए प्रयोगात्मक सेट अप का स्क्रीनशॉट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. YFP चैनल का उपयोग कर कोशिकाओं और समुच्चय का पता लगाने के लिए एकत्रीकरण के छवि विश्लेषण के लिए आवश्यक चार कदम ।
(1) छवि डेटा भंडारण और विश्लेषण प्रणाली से आयात छवियों । (2) कक्षों की गिनती के लिए "कक्ष ढूंढें" का चयन करें । (3) समुच्चय का निर्धारण करने के लिए "स्पॉट खोजें" का चयन करें । (4) प्रत्येक एल्गोरिथ्म के आधार पर परिणामों को परिभाषित करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. Proteasome HEK-२९३ कोशिकाओं में SOD1A4V-YFP समुच्चय के संचय के लिए अग्रणी अवरोध ।
(क) चयनित SOD1A4V के फोकल छवियों-YFP HEK-२९३ कोशिकाओं ALLN के 10 µ मीटर के साथ इलाज किया । (ख) ALLN के साथ प्रेरित कुल गठन का परिमाणात्मक विश्लेषण (10 µ m) और एक समय पर निर्भर तरीके से कोशिका गिनती । छवियां एक LWD 20X उद्देश्य का उपयोग कर प्राप्त किए गए हर ६० मिनट । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6. दो चैनल अधिग्रहण (YFP और Hoechst) के लिए प्रयोगात्मक स्थापित की स्क्रीन शॉट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7. SOD1 समुच्चय और YFP और Hoechst के साथ लेबल कोशिकाओं के छवि विश्लेषण के लिए आवश्यक चार कदम ।
(1) छवि डेटा भंडारण और विश्लेषण प्रणाली से इनपुट छवियों । (2) "find नाभिक" कक्षों की गिनती के लिए का चयन करें । (3) समुच्चय का निर्धारण करने के लिए "स्पॉट खोजें" का चयन करें । (4) प्रत्येक एल्गोरिथ्म के आधार पर परिणामों को परिभाषित करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8. SOD1 A4V एकत्रीकरण और खुराक-निर्भर proteasome अवरोधक एकाग्रता का मात्रात्मक विश्लेषण.
(क) यहां हम धब्बे और कोशिका गिनती के लिए छवि और ठहराव विश्लेषण विधि कोलंबस छवि विश्लेषण प्रणाली का उपयोग कर पेश करते हैं । दो फ्लोरोसेंट Hoechst (Ch1) और YFP (Ch2) के लिए विशिष्ट चैनल के लिए इसी चित्र क्रमिक रूप से प्राप्त कर रहे थे । Hoechst-सना हुआ ऑब्जेक्ट (बाएं) छवि विभाजन द्वारा पहचाना गया था । परमाणु मास्क (केंद्र) से व्युत्पंन "खोज नाभिक" एल्गोरिथ्म कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए लागू किया गया था, स्पॉट मास्क द्वारा पीछा (सही) "स्पॉट खोजें" एल्गोरिथ्म समुच्चय का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया । (ख) खुराक प्रतिक्रिया अध्ययन के उत्परिवर्ती SOD1 A4V है, जो एक चर चुनाव आयोग५० रैंकिंग से ६.५३ µ एम, ALLN, ०.१७ µ एम के लिए MG132, और µ के लिए ०.०३ Expoxomicin मीटर से पता चलता है की एकत्रीकरण पर proteasome ' अवरोधों की पढ़ाई । उत्परिवर्ती SOD1 A4V के चयनित फोकल छवियों ईसी५० एकाग्रता में proteasome इलाज किया । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

स्थिर कक्ष रेखाएँ जनरेट करने के लिए दो मुख्य पहुँच हैं । पहले कई हफ्तों लेता है और जीनोमिक एकीकृत प्लाज्मिड डीएनए वैक्टर के क्षणिक अभिकर्मक और प्रतिरोध चयन की आवश्यकता है । दूसरा lentivirus के उपयोग के माध्यम से घंटे की बात लेता है, इस प्रोटोकॉल सीमित प्रयास के साथ कई सेल लाइनों में लक्ष्य प्रोटीन की प्रभावी अभिव्यक्ति के लिए उत्तरदायी बना । यात्रा-सीएमवी वेक्टर19 एक निरंतर वेक्टर का उपयोग करने के लिए, संरक्षण transduction दक्षता और स्थिर transgene अभिव्यक्ति के साथ था । हमारे आश्चर्य करने के लिए, तीन कोशिका उत्पंन लाइनों उत्परिवर्ती SOD1 का कोई दिखाई एकत्रीकरण, प्रायोगिक प्रोटोकॉल के विपरीत में क्षणिक अभिव्यक्ति के आधार पर पूर्व11वर्णित दिखाया । यह संभावना है कि क्षणिक अभिव्यक्ति प्रोटीन एकत्रीकरण एहसान के रूप में यह समय की एक अपेक्षाकृत कम अवधि में उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति पैदा करता है । क्षणिक अभिकर्मक पर, ubiquitin – proteasome प्रणाली है, जो प्रोटीन के बहुमत नीचा, एक संतृप्ति बिंदु है जिसमें अपनी क्षमता के लिए समग्र प्रवण प्रोटीन नीचा करने के लिए पूरी तरह से उपयोग किया जाता है तक पहुंचता है । लेकिन, हम तर्क है कि स्थिर लाइनों और शारीरिक स्थिति में जो प्रोटीन एक अपेक्षाकृत स्थिर स्तर जो proteasome, autophagosome-lysosome के माध्यम से उत्पंन प्रोटीन के उंमूलन से मेल खाती है पर व्यक्त कर रहे है पुन: पेश करने की संभावना है, और exocytosis । हालांकि प्राथमिक एस करने के लिए अग्रणी घटनाओं अभी भी अज्ञात हैं, ubiquitin proteasome प्रणाली की कमी गतिविधि के संबंध में उंर बढ़ने, एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक है23। के रूप में हमारे सेलुलर परख द्वारा सचित्र, proteasome अवरोध का खुलासा प्रोटीन के एकत्रीकरण को बढ़ावा देता है (SOD1 A4V) । जैसे, इस परख autophagy संकेत मार्ग या निगरानी नेटवर्क के छोटे अणु उत्प्रेरक के लिए स्क्रीन करने के लिए नए अवसर पैदा करता है । दरअसल, निगरानी प्रेरण के लिए इस एवेंयू का वादा लगता है, के रूप में कीरन एट अल से रिपोर्ट द्वारा सचित्र । दिखा रहा है कि गर्मी सदमे प्रतिक्रिया के एक सह-उत्प्रेरण के साथ उपचार SODG93A की उंर का विस्तार करके चिकित्सीय लाभ है पाया गया था चूहों24.

यह उल्लेख है कि वहां कुछ नुकसान इस परख का उपयोग करने से पहले विचार कर रहे है महत्वपूर्ण है । परख अनुकूलन प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, हमने पाया है कि 1% या इसके बाद के संस्करण पर DMSO की सांद्रता हमारी परख में मापा YFP का मतलब तीव्रता बढ़ जाती है । इसलिए किसी भी ऐसी मूर्ति से बचने के लिए DMSO की एकाग्रता को कम करने के लिए ०.५% महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, लेंस इज़ाफ़ा और परख प्लेट में सेल घनत्व के चयन के लिए परख की मजबूती का अनुकूलन पर विचार महत्वपूर्ण हैं ।

हमारे अध्ययन में, हमें पता चला है कि एक lentiviral प्रणाली का उपयोग करना, SOD1A4V-YFP HEK-२९३ सेल लाइन अच्छी तरह से SOD1 अवरोधकों द्वारा प्रेरण पर निगरानी उत्परिवर्ती A4V proteasome कुल गठन के लिए अनुकूल है । proteinopathies के तंत्र को समझने के लिए प्रोटीन और एकत्रीकरण का खुलासा के अध्ययन के लिए आवश्यक है । यद्यपि प्रोटीन एकत्रीकरण का विश्लेषण करने के लिए अनुसंधान उपकरण पिछले दशकों में विस्तार किया गया है, का पता लगाने और मात्रा एकत्रीकरण के लिए कुशल दृष्टिकोण अणुओं है कि कुल गठन को प्रतिबंधित करने के लिए आवश्यक हैं । यह काम परख विकास और प्रोटीन एकत्रीकरण के अध्ययन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है । उंमीद है, HCS, HCA और रासायनिक या CRISPR/सिरना पुस्तकालयों के उपयोग के समर्थन के साथ, इस काम चिकित्सकीय या उपंयास लक्ष्य खोज के लिए नए रास्ते खोलने चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम कोरियाई सरकार (MSIP) (एनआरएफ-2014K1A4A7A01074642) द्वारा वित्तपोषित अनुदान द्वारा समर्थित था, और कोरिया की नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) व्यक्तिगत वैज्ञानिक सहायता कार्यक्रम (एनआरएफ-2013M3A9B5076486/एनआरएफ-2015R1D1A1A09057239) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ALLN (C20H37N3O4) Millipore 208719
MG132 (C26H41N3O5) Sigma-Aldrich C2211
Epoxomicin (C28H50N4O7) Sigma-Aldrich E3652
Hoechst 33342 Invitrogen H-3570
Opera Perkin Elmer OP-QEHS-01
Opera EvoShell software Perkin Elmer Ver 1.8.1
Operetta Perkin Elmer OPRT1288
Harmony Imaging software Perkin Elmer Ver 3.0.0
Columbus Image analysis software Perkin Elmer Ver 2.3.2
CyBi Hummingwell liquid handling CyBio AG OL 3387 3 0110

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References

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तंत्रिका विज्ञान १२८ अंक पारिवारिक एस सुपरऑक्साइड dismutase 1 कुल lentivirus proteasome अवरोधकों ठहराव उच्च सामग्री विश्लेषण (HCA) उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (HCS)
उच्च सामग्री के लिए परख विकास Sod1 उत्परिवर्ती प्रोटीन समग्र गठन के रहने की कोशिकाओं में ठहराव
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Lee, H., Radu, C., Han, J. W., Grailhe, R. Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells. J. Vis. Exp. (128), e56425, doi:10.3791/56425 (2017).

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