Summary
Vi beskriver en metode til at kvantificere sammenlægning af fejlfoldede proteiner. Vores lentiviral protokoloplysninger induceret stabil celle linje generation, automatiseret Konfokal imaging og billedanalyse af protein aggregater. Som et vejledende program undersøgte vi effekten af små molekyler i at fremme SOD1 akkumulering i en tid - og dosisafhængig måde.
Abstract
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en dødelig neurodegenerativ sygdom, der kan være forårsaget af nedarvede mutationer i genet kodning kobber-zink superoxiddismutase 1 (SOD1). Den strukturelle ustabilitet i SOD1 og påvisning af SOD1-positive optagelser i familiær ALS patienter understøtter en potentiel kausal rolle for fejlfoldede og/eller aggregerede SOD1 i ALS patologi. I denne undersøgelse beskriver vi udviklingen af en celle-baserede assay designet til at kvantificere dynamikken i SOD1 aggregation i levende celler ved høje indhold screening tilgange. Bruger lentiviral vektorer, genereret vi stabil cellelinjer udtrykker vildtype og mutant A4V SOD1 markeret med gult fluorescerende proteiner og fandt, at begge proteiner blev udtrykt i cytosol uden nogen tegn på akkumulering. Interessant, kun SOD1 A4V udtrykt stabilt i HEK-293, men i U2OS eller SH-SY5Y cellelinjer, dannede ikke aggregater på proteasom hæmmer behandling. Vi viser, at det er muligt at kvantificere sammenlægning baseret på dosis-respons analyser af forskellige proteasom hæmmere og spore aggregat-dannelsen kinetik af time-lapse mikroskopi. Vores tilgang indfører mulighed for at kvantificere effekten af ALS mutationer på rollen af SOD1 i samlede dannelse samt screening for små molekyler, der forhindrer SOD1 A4V sammenlægning.
Introduction
Protein sammenlægning er en biologisk proces hvorved fejlfoldede proteiner gruppe op og kan fungere som sygdomsfremkaldende agenser i neurodegenerative sygdomme (amyloidose). Kendetegner protein sammenlægning er afgørende i forståelsen af aggregater i cellulære dysfunktion såvel som i at lette opdagelsen af nye faktorer, der påvirker udbrud af patologi rolle. Visualisering af fluorescens-tagged proteiner i levende celler er en kraftfuld metode, som kan støtte i udviklingen af assays gælder for højt indhold af screening (HCS)1,2,3,4.
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) betragtes som en proteopathic sygdom forårsaget af tilstedeværelsen af fejlfoldede proteiner med tilbøjelighed til at aggregere og ophobe sig i motoriske neuroner i både familiær ALS (fALS) og sporadiske ALS (sALS)5,6 . En delmængde af ~ 20% af fALS tilfælde er associeret med dominerende mutationer i det gen, der koder cytosole antioxidant enzymet superoxiddismutase kobber-zink type 1 (SOD1)7,8. Flere mulige årsager til denne genetisk afledte dysfunktion har været foreslået, herunder ændringer i struktur og funktion af SOD1 varianter, som afvigende stabilitet, øget udfoldelsen sats og tilbøjelighed til samlede9, 10. Især, den eneste verificerede og potentielt giftige egenskab deles af begge ALS-knyttet SOD1 varianter og wild-type (WT) SOD1 er en øget tilbøjelighed til at danne opdelte protein aggregater eller proteinholdige indeslutninger11,12 . Fejlfoldede mutant SOD1, er vedvarende polyubiquitinated og nedbrudt af ubiquitin-proteasom system. Som et resultat, fører et lavt niveau af hæmning af proteasom aktivitet til ophobning af mutant SOD1 aggregater13,14, hvilken form amorfe strukturer sammensat af opløselige komponenter, der kan udveksle med opløselige mutant SOD1 i cytosol15. I særdeleshed SOD1 mutant A4V (alanin på codon 4 ændret til valin) er den mest almindelige ALS-forårsager mutation, og fører til hurtige neurodegeneration med en gennemsnitlige overlevelsestid på mindre end 2 år efter sygdom udbrud16. Biokemisk, har SOD1 A4V en øget tendens til monomerize, samler og danne amyloid porer; dens pore-lignende aggregater ligner amyloid porerne i andre sygdom-linked mutante former, såsom α-synuclein og β-amyloid protein17. For at studere dynamikken i SOD1-samlet ophobning, fortsat metoder til overvågning af opløselige og uopløselige SOD1 samlede former skal udvikles.
Vi har tidligere vist, ved hjælp af live-celle imaging og HEK-293 celler transfekteret forbigående med fluorescerende proteiner-markeret SOD1, at ALS-associerede mutationer forringe SOD1 dimerization og sammenlægning11. Selv om forbigående udtryk systemer kan give nyttige oplysninger om de biologiske resultatet af kortsigtede gen overekspression, kan metoder giver stabil integration af ønskede gener være foretrukne til assay udvikling. Som sådan tilbyder lentiviral vektorer muligheden for at overdrage langsigtede og regulerede genekspression pattedyrceller 18. I denne undersøgelse, vi fokuserede på generation af stabil cellelinjer transduced med rekombinant lentivirus forsynet med WT og mutant SOD1 markeret med gult fluorescerende proteiner (YFP). Ved hjælp af live-celle imaging mikroskopi og automatiseret kvantificering af SOD1 sammenlægning, vi udløst og kvantificeret SOD1 sammenlægning begivenheder ved hæmning af proteasom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. lentivirus produktion
Kommentar: produktion og manipulation af lentiviral vektorer blev udført Ifølge National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for forskning, der indebærer rekombinant DNA. Plasmid kodning wild-type og A4V mutant SOD1 markeret med udvidet YFP (SOD1WT-YFP og SOD1A4V-YFP) er beskrevet i Kim mfl. 11 begge genprodukter fusion, der blev forstærket ved hjælp af PCR primer par 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ og 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ og indsat i pTRIP-delta U3 CMV plasmid 19 ved hjælp af XhoI og BsrGI begrænsning websteder. I forudgående eksperimenter, blev HEK-293T celler delt i forholdet 1:4 1:6 hver to dage. Undgåelse af mere end 20 passager og vedligeholdelse af celler på mindre 60% confluency bidrager til at sikre god Transfektion effektivitetsgevinster.
- På dag 1, delt HEK-293T celler på 30-40% confluence i en 10-cm diameter vævskultur plade (3 x 10 6 celler/parabol) i 10 mL i cellekulturmedium (high-glucose DMEM med 10% FBS og 4 mM L-glutamin) for virus produktion.
- Holde 10-cm diameter vævskultur plade i en CO 2 inkubator (37 ° C, 5% CO 2) natten.
- På dag 2, forberede en DNA Transfektion opløsning indeholdende 10 µg lentiviral vektorer (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP eller -SOD1A4V-YFP) sammen med den lentiviral emballage () plasmider (5 µg af pVSVg, 10 µg for pCMV-dR8.71) figur 2A) 20. Tilsæt 125 µL 1 M CaCl 2 og justere lydstyrken til 500 µL med destilleret vand. Forsigtigt tilføje 500 µL af 0,05 M HEPES i blandingen og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.
- Erstat HEK-293T celler medium med 10 mL pre varmede frisk kultur medium antibiotikum-fri blandet med 1 mL DNA Transfektion opløsning og inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO 2.
- På dag 3, erstatte cellen supernatanten med friske næringssubstratet.
- På dag 4, høste supernatanten i en 15 mL rør og centrifugeres i 5 min. 500 x g ved at fjerne døde celler og debris. Yderligere rense supernatanten ved, at det gennem et 0,45 µm filter ved hjælp af en stor 60 mL sprøjte. Straks give afkald til engangsbrug delprøver (300 µL), og opbevar ved-80 ° C. For at bevare maksimal produkt aktivitet, undgå en fryse-tø cyklus.
2. Lentiviral transduktion
- Split cellelinie inficeret på 60% confluence (HEK-293 celler og SH-SY5Y; 5 x 10 5 celler pr. brønd og U2OS; 1 x 10 5 celler pr. brønd) i en 6-godt vævskultur plade i 2 mL af DMEM media suppleret med 10% FBS.
- Holde 6-godt vævskultur pladen i et 37 ° C inkubator på 5% CO 2 natten.
- Fjerne den frosne lentivirus fra-80 ° C fryser og tø en alikvot på is før hver brug; ikke genfryses.
- Mens virussen optøning, varm cellekulturmedium indeholdende serum kompatibel med cellelinie af interesse. Når virus er helt optøet, forberede en række fortyndinger (1:3, 1:10, 1:30 og 1: 100) i DMEM i en frisk 1,5 mL mikrofuge tube.
- Opdrage volumen i rørene til 1 mL med nedsat serum media.
- Tilføje 2 µL af Polybrene (på et lager af 4 µg/µL) til 1 mL af virus/medier. Bland godt af pipettering og tilsættes 1 mL af blandingen til cellerne. Inkuber celler med virus for 24 h.
- Fjerne virus medier og udskifte med normale DMEM media suppleret med 10% FBS. Vedligeholde celler ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Overvåge vækst af celler og ændre kultur medierne hver to dage. På sammenløbet, udvide 6-godt parabol til en 10-cm diameter vævskultur plade.
- Når cellerne er blevet tilstrækkelig udvidet, frø 1,5 x 10 4 celler pr. brønd i 50 µL af DMEM media på 384-godt assay plader til at kontrollere udtryk niveauet af YFP tagged protein ved mikroskopi. Hvis YFP markeret protein cell udtryk viser signal til støjforhold ≥ 3, forberede de tilsvarende cellelinie celle stock.
3. Tid afhængig af effekten af proteasom hæmmer på protein sammenlægning
Bemærk: udføre image erhvervelse ved hjælp af en automatiseret mikroskop (Se materialer).
- Give afkald på 0,25 µL af DMSO eller proteasom hæmmer opløst i 100% DMSO (ALLN, 2 mM) på 384-godt flad bundplade.
- Manuelt frø 1,5 x 10 4 celler pr. brønd i 50 µL af DMEM medier på samme assay plade. Proteasom hæmmer (ALLN) endelige koncentration skal være 10 µM.
- Oprettet mikroskop system miljøkontrol enhed til 37 ° C og 5% CO 2. Et screenshot af den eksperimentelle setup er vist i figur 3.
- Operere mikroskop i bredt felt fluorescens mode, bruger softwaren med følgende indstillinger: LWD 20 X mål, ikke-Konfokal tilstand, 4 felter/godt, med en capture interval på en time. For enden af hvert løb optagne billeder overføres automatisk til serveren.
4. Tid bortfalder imaging til YFP udtryk i levende celler, og billede analyse (enkelt kanal)
Bemærk: de følgende trin beskriver anvendelsen af software (fx Columbus).
- Vælg den passende algoritme at segmentere de primære objekter (cytosol og tilslagsmaterialer). Hvis det er nødvendigt, justere baggrund tærskel og kontrast parametre ( figur 4).
- Tælle celler ved hjælp af ' finde celler ' med en individuel tærskel på 0,1 til YFP intensitet kanal. Finde ud af, aggregeringer ved hjælp af en ' finde steder ' algoritme med en relativ YFP spot intensitet > 0,2 og 1,0 opsplitning koefficienten.
5. Dose respons effekt af proteasom hæmmere på protein aggregering på levende celler farvet for deres kerner (to kanaler)
Bemærk: udføre image erhvervelse ved hjælp af en automatiseret mikroskop. Bestemme koncentrationen række proteasom hæmmere (ALLN, Epoxomicin og MG132) baseret på den forventede IC 50 værdi til at sikre en optimal curve fit.
- Forbered serielle fortyndinger af forbindelser på et 384-godt opbevaring polypropylen plade af standarden 1:3 fortyndingsrække. Sørg for at blande de sammensatte fortyndinger godt til at sikre, at de sammensatte koncentrationer er korrekte.
- Give afkald på 0,25 µL af proteasom hæmmere på tomme flad bund sort 384-godt assay plader. Vi bruger en flydende handler udstyret med 384-kapillær hoved habil i overfører diskenheder.
- Frø 1,5 x 10 4 celler pr. brønd i 50 µL af DMEM Media på assay plader. Inkuber assay plader på 37 ° C og 5% CO 2 til 24 h.
- Tilsæt 10 µL af DMEM Media (pre varmes ved 37 ° C) med farvning løsning (Hoechst 33342 på et lager af 10 mg/mL) og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
- Lancere mikroerklare opererer software. Et screenshot af den eksperimentelle setup er vist i figur 6. Vælg den " konfiguration " fanen og vælg 20 X mål og den rigtige plade type. Sikre " krave " er indstillet til den korrekte værdi på målet at tillade korrekt fokus med forskellige plade typer.
- Vælg den " mikroskop " tab. Definer eksponering 1 som YFP (488 laser) og eksponering 2 som Hoechst (405 laser). Aktivér filter på begge engagementer og tildele eksponering 1 til kamera 1 og eksponering 2 til kamera 2. Indstille eksponering gange til ~ 800 ms for eksponering 1 og ~ 40 ms for eksponering 2.
- Vælg eksponering 1. Indstil fokus højde til 0 µm. Vælg " fokus ". Når fokuseret, udsætte kamera 1. Justere fokus højden for at optimere eksponering flyet og klik på " tage højde ". Ændre eksponering gange og laser-magt til at give en maksimal pixel intensiteten af ~ 3.000. Gemme eksponering parametre. Gentag for eksponering 2.
- Vælg " eksperiment Definition " tab. oprette et layout og sublayout. Træk og slip den relevante layout, eksponering, referenceafbildning, skewcrop fil og sublayout. Gemme eksperimentet.
- Vælg " automatisk eksperiment " fanen og erhverve billeder. For enden af hvert løb optagne billeder overføres automatisk til serveren.
6. Billede analyse af to kanal billeder
- Vælg software algoritmen at segmentere de primære objekter (kerner, cytosol og aggregater) ( figur 7).
- Vælg den metode, segmenter kerner præcist ved visuel inspektion af de segmenterede objekter. Hoechst-farvede objekter i kanal 1 (Ch1) vil blive brugt til at bestemme antallet af celler. YFP farvning fra mutant SOD1-A4V på kanal 2 (Ch2) vil blive brugt til at bestemme beløbet af nationalregnskabsaggregater.
- Tælle celler ved hjælp af den ' finde kerner ' algoritme som Hoechst farvning regioner > 20 µm 2, med en split faktor på 7.0, en individuel tærskel på 0,40 og en kontrast > 0,10.
- Oprette datatabellen og bestemme EF 50 for hver af de forbindelser ved hjælp af den ' ikke-lineær regression ' ligning i graftegning softwaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering stabil cellelinje ved hjælp af lentivirus: Den overordnede strategi for overvågning SOD1 protein aggregater er illustreret i figur 1. I et første skridt skabt vi et lentiviral udtryk vektor for SOD1 stabile gen levering i cellelinjer (trin 1). To lentiviral vektorer kodning YFP-mærket SOD1 WT og SOD1 A4V (SOD1WT-YFP og SOD1A4V-YFP, henholdsvis) med pakning og kuvert plasmider blev udarbejdet (figur 2A). Ved lentiviral transduktion (trin 2) cellen forblev linjer testet (HEK-293, U2OS og SH-SY5Y) raske, viste høj udtryk niveauer (figur 2B), og langsigtede YFP mærkning uanset formen SOD1. Interessant nok, hverken WT eller mutant SOD1 udtrykt i de tre cellelinjer, der viste synlige sammenlægning, i modsætning til den forbigående udtryk cellulære model tidligere testet11.
Godkender stabil celle linjer for SOD1 sammenlægning og studere dens dynamik: For at udløse SOD1 samlede dannelse på cellulære ophobning af fejlfoldede SOD1 mutant, vi brugte proteasom hæmmer ALLN (også kaldet calpain I og II hæmmer; Ki = 190 og 220 nM henholdsvis), tidligere valideret ved hjælp af en forbigående SOD1 udtryk cellulære model11. SOD1 sammenlægning blev undersøgt med HEK-293, U2OS og SH-SY5Y cellelinjer transduced med SOD1WT-YFP og SOD1A4V-YFP. Behandling med proteasom hæmmer ALLN (10 µM) for 24 timer stærkt fremmet ophobning af SOD1A4V-YFP aggregater i HEK-293 celler (figur 2 c). Ingen akkumulering konstateredes imidlertid i SOD1WT-YFP transduced cellelinjer og meget lave niveauer af sammenlægning blev fundet i U2OS og SH-SY5Y cellelinjer SOD1A4V-YFP transduced SOD1WT-YFP og SOD1A4V-YFP (figur 2 c). Baseret på disse bemærkninger, brugte vi time-lapse mikroskopi til at undersøge dynamiske SOD1A4V-YFP sammenlægning dannelsen induceret af proteasom hæmning (trin 3, figur 3) og kvantificere SOD1A4V-YFP sammenlægning ved hjælp af en enkelt YFP fluorescens kanal til at opdage den udtrykker celler og aggregater i levende celler (trin 4, figur 4). Celler var seedede i tilstedeværelse og fravær af ALLN, og overvåges i en periode på 50 timer (figur 5A). Under vores forsøgsbetingelser fandt vi den samlede dannelse induceret af ALLN nået et plateau på 24 timer og var stabilt over de næste 12 timer. Vi viser, at celle tæthed faldt betydeligt efter 28 timer som følge af den cytotoksiske effekt af ALLN, mens celle antallet steget i DMSO-behandlede negative eksperimentet.
Characterizing lille molekyle EF 50 for sammenlægning dannelse ved hjælp af SOD1 celle model: Celler, der udtrykker SOD1A4V-YFP blev behandlet i en dosisafhængig måde med lille molekyle proteasom hæmmere. Vi brugte en nuklear markør til at mærke linjen SOD1A4V-YFP celle, som er fordelagtige for samlede påvisning i cytosol rum. Faktisk, da hver celle indeholder en kerne, ved segmentering af kerner og bruge dem som frø i vandskel segmentering af cellerne, cytoplasma segmentering er forenklet21. Vi brugte, Hoechst farvning, der er kendt, for at have nogen toksicitet, når det anvendes i en kortvarig periode og ved lave koncentrationer22, betingelser, som ikke blev brugt i de tidligere tid bortfalder imaging eksperiment. Efter 24 timers celle dyrkning i overværelse af proteasom hæmmere, var SOD1A4V-YFP celler plettet med Hoechst løsning (10 µg/mL) i 10 min. Næste erhvervet vi fluorescens billeder til Hoechst og YFP ved hjælp af en 20 X 0,4 NA mål (trin 5, figur 6). Bruger et billede analyse algoritme, som tager hensyn til cellekerner og SOD1A4V-YFP distribution, blev celler analyseret ved hjælp af billede analyse software (trin 6, figur 7). Hoechst-farvede objekter udstiller den passende fluorescerende intensitet over baggrunden og morfologiske størrelse Karakteristik af en kerner (bredde, længde og areal) blev identificeret og klassificeret af billedsegmentering. Nukleare masken stammer fra Hoechst farvning blev brugt til at spore den proksimale SOD1A4V-YFP spot distribution cytosole inden cellen og til at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af aggregater. Baseret på registrering af kerner og steder, blev et forhold af aggregater opdaget versus celler beregnet. For at bestemme følsomheden af vores analyse, vi næste kvantificeret sammenlægning af SOD1A4V-YFP HEK-293 celler behandles med tre forskellige proteasom hæmmere (ALLN, MG132 og epoxomicin) i en dosis koncentration måde som aktiveret montering af kvantificerede data og vi beregnet EF50 værdier af 6,53 ± 1,17, 0,17 ± 0,06 og 0,03 ± 0,03 µM for ALLN, MG132 og epoxomicin, henholdsvis (fig. 8B). Den relative giftighed for alle tre proteasom hæmmere var kvantificeres ved at måle antallet af vedhængende celler forbliver i godt mærket med Hoechst farvestof. Vi fandt, at cellen total antal tendens til fald i svar til sammensatte virkninger, som det fremgår af lignende EF50 værdier af 6,58 ± 1,06, 0,19 ± 0,03 og 0,05 ± 0,01 µM for ALLN, MG132 og epoxomicin, henholdsvis.
Figur 1. Arbejdsproces og tidslinje for celle-line generation og høj indholdsanalyse (HCA) protein aggregeringsniveau. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. SOD1 WT og A4V stabil linje generation.
(A) skematisk diagram over lentiviral og emballage vektorer (pakning og indhylle plasmider) for vildtype og mutant SOD1 A4V lentivirus generation. (B) valgt Konfokal billeder af tre celler (HEK-293, U2OS og SH-SY5Y) transduced med lentivirus vildtype SOD1 (WT) og mutant SOD1 (A4V). (C) repræsentative billeder af tre stabile celler behandles i 24 timer med proteasom-hæmmer, ALLN (10µM). SOD1A4V-YFP aggregater fandtes for at være rigeligt til stede (røde pile) i HEK-293, men sparsomt til stede i U2OS eller SH-SY5Y celler. Billeder blev erhvervet ved hjælp af en 20 X mål. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. De fire trin, der kræves til billedanalyse af sammenlægning af YFP kanalen til påvisning af celler og aggregater.
(1) importere billeder fra image data lagring og analyse system. (2) Vælg "find celler" for at tælle celler. (3) Vælg "find steder" til at finde ud af, aggregeringer. (4) definere resultater baseret på hver algoritme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Proteasom hæmning fører til ophobning af SOD1A4V-YFP aggregater i HEK-293 celler.
(A) valgt Konfokal billeder af SOD1A4V-YFP HEK-293 celler behandles med 10 µM af ALLN. (B) kvantitativ analyse af samlede dannelse induceret med ALLN (10µM) og celle tæller i en tidsafhængig måde. Billeder blev erhvervet ved hjælp af en LWD 20 X mål hver 60 min. skala bar = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Skærmbillede af den eksperimentelle sæt op for to kanal erhvervelse (YFP og Hoechst). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. De fire trin, der kræves til billedanalyse af SOD1 aggregater og celler mærkes med YFP og Hoechst.
(1) input billeder fra image data lagring og analyse system. (2) Vælg "find kerner" for at tælle celler. (3) Vælg "find steder" til at finde ud af, aggregeringer. (4) definere resultater baseret på hver algoritme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Kvantitativ analyse af SOD1 A4V sammenlægning og dosis-afhængige proteasom hæmmer koncentration.
(A) præsenterer her vi billedet og kvantificering analysemetode for pletter og celle tæller ved hjælp af Columbus billede analysesystem. Billeder svarende til to fluorescerende kanaler bestemt til Hoechst (Ch1) og YFP (Ch2) var sekventielt erhvervet. Hoechst-farvede objekter (til venstre) blev identificeret ved billedsegmentering. Den nukleare maske (center) stammer fra den "finde kerner" algoritme blev anvendt til at tælle antallet af celler, efterfulgt af den spot maske (højre) "finde steder" algoritme bruges til at registrere aggregater. (B) dosis svar undersøgelse af proteasom hæmmere effekt på sammenlægning af mutant SOD1 A4V, som viser en variabel EF50 ranking fra 6,53 µM, ALLN, til 0,17 µM for MG132 og 0,03 µM for Expoxomicin. Valgt Konfokal billeder af mutant SOD1 A4V behandlet proteasom i EF50 koncentration. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er to primære metoder til at generere stabile cellelinjer. Først tager flere uger og kræver forbigående Transfektion og modstand udvalg af genomisk integreret plasmid DNA vektorer. Andet tager et spørgsmål om timer ved hjælp af lentivirus, hvilket gør denne protokol imødekommenhed over for den effektive udtryk for target protein i flere cellelinjer med en begrænset indsats. TUR-CMV vektor19 blev en vedvarende vektor til brug, med bevaret transduktion effektivitet og stabil transgen udtryk. Til vores overraskelse viste de tre cellelinjer genereres ingen synlige akkumulering af mutant SOD1, i modsætning til den eksperimentelle protokol baseret på forbigående udtryk beskrevet tidligere11. Det er sandsynligt, at forbigående udtryk favoriserer protein sammenlægning, da det giver højere protein udtryk i en relativt kort periode. Ved forbigående Transfektion når ubiquitin-proteasom system, som nedbryder et flertal af proteiner, et mætningspunkt, hvor dens kapacitet til at forringe aggregat-tilbøjelige proteiner er udnyttet fuldt ud. Men vi hævder, at stabile linjer er mere tilbøjelige til at reproducere den fysiologiske situation, proteiner er udtrykt på et forholdsvis konstant niveau, som svarer til fjernelse af fejlfoldede protein via proteasom, autophagosome-uspecifikke, og exocytose. Selvom de primære begivenheder, der førte til ALS er stadig ukendt, er aldring i forbindelse med nedsat aktivitet af ubiquitin proteasom system, en væsentlig risikofaktor23. Som det fremgår af vores cellulære assay, fremmer proteasom hæmning aggregering af fejlfoldede protein (SOD1 A4V). Som sådan, skaber denne analyse nye muligheder til at screene for små molekyle aktivatorer af autophagy signalering sti eller anstandsdame netværk. Faktisk denne avenue for anstandsdame induktion synes lovende, som illustreret af rapporten fra Kieran et al. viser, at behandling med en co inducer af varmen shock-responsen blev fundet for at have terapeutiske fordele ved at forlænge levetiden for SODG93A mus24.
Det er vigtigt at nævne, at der er et par faldgruber at overveje, før du bruger dette assay. Som med assay optimering protokol, fandt vi, at koncentrationer af DMSO på 1% eller derover stiger den gennemsnitlige intensitet af de målte YFP i vores analyse. Det er derfor vigtigt at reducere koncentrationen af DMSO til 0,5% for at undgå enhver sådan artefakt. Udvælgelsen af linsen forstørrelse og celle tæthed i assay plade er desuden vigtigt at overveje for at optimere robusthed i analysen.
I vores undersøgelse, har vi vist, at ved hjælp af et lentiviral system, SOD1A4V-YFP HEK-293 cellelinie er velegnet til overvågning mutant SOD1 A4V samlede dannelse ved induktion af proteasom hæmmere. Undersøgelse af fejlfoldede protein og sammenlægning er afgørende for at forstå mekanismerne i proteinopathies. Selv om forskningsværktøjer til at analysere protein sammenlægning er blevet udvidet i de seneste årtier, er effektive metoder til at detektere og kvantificere sammenlægning forpligtet til at skærmen molekyler, der forbyder samlede dannelse. Dette arbejde giver et detaljeret protokol for assay udvikling og undersøgelser af protein sammenlægning. Forhåbentlig, bør dette arbejde med støtte fra HCS, HCA og brug af kemiske eller CRISPR/siRNA biblioteker åbne nye veje for therapeutics eller roman target opdagelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud, der finansieres af den koreanske regering (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) og National Research Foundation af Korea (NRF) individuelle videnskabsmand supportprogram (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
References
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy? J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a, et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a, Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
