De bepaling van de komeet is een efficiënte methode om op te sporen DNA schade met inbegrip van single- en double-stranded DNA breekt. We beschrijven alkalisch en neutraal komeet testen voor het meten van DNA-beschadiging in kankercellen het therapeutische effect van chemotherapie te beoordelen.
DNA-beschadiging is een gemeenschappelijk fenomeen voor elke cel tijdens zijn levensduur, en wordt gedefinieerd als een wijziging van de chemische structuur van genomic DNA. Kankertherapieën, zoals radio- en chemotherapie, introduceren enorme hoeveelheid extra DNA-beschadiging, leidt tot de arrestatie van de celcyclus en apoptosis te beperken van de progressie van kanker. Kwantitatieve beoordeling van DNA-beschadiging tijdens de experimentele kankertherapie is een belangrijke stap ter rechtvaardiging van de effectiviteit van een genotoxische agent. In deze studie, richten we ons op een eencellige elektroforese assay, ook bekend als de komeet assay, die enkele kwantificeren kan en dubbele streng DNA breekt in vitro. De bepaling van de komeet is een DNA schade kwantificering methode die efficiënt en gemakkelijk uit te voeren, en heeft weinig tijd/begroting eisen en hoge reproduceerbaarheid. Hier, wijzen wij op het nut van de komeet assay voor een preklinische studie door de beoordeling van het effect van de genotoxische van olaparib/temozolomide combinatietherapie naar U251 glioma cellen.
De komeet assay werd in 1984 voor het eerst ontwikkeld door Ostling en Johanson door aan te tonen dat de migratie van DNA fragmenten van kernen onder een neutrale voorwaarde1. De techniek werd later ontwikkeld door Singh et al., waaruit blijkt dat een alkalische toestand aanzienlijk verhoogd de specificiteit en de reproduceerbaarheid van de test2. Sindsdien, de neutrale komeet bepaling wordt meestal gebruikt om op te sporen double-stranded DNA breekt, terwijl de alkalische komeet assay gevoeliger voor kleinere hoeveelheden DNA schade is, met inbegrip van enkele en dubbele streng DNA, alkali-labiele sites, DNA-DNA breekt of DNA-eiwit dwarsbinding en DNA single-strand einden gekoppeld aan onvolledige excisie repareren sites3,4. Beide testen visualisatie van gefragmenteerde DNA, verlenen en een eenvoudige manier om te kwantitatief DNA-schade te evalueren. De komeet bepaling wordt beschouwd als een gevoelige methode voor in vitro en in vivo genetische toxicologische studies en is van toepassing op de verschillende onderzoekgebieden, zoals vroege drug-kandidaat selectie, milieubewaking, menselijke biomonitoring, en fundamenteel onderzoek op DNA-beschadiging en repareren van5.
Het principe van de test is dat onder een elektrisch veld, gefragmenteerde DNA migreert uit het nucleoïde lichaam (ook bekend als de “komeet-head”) en vormt een vlek van DNA in de agarose gel (ook bekend als de “komeet-staart”). Met de nucleotide kleuring, kan de omvang van de schade van DNA door het analyseren van “kometen” gevormd door deze eencellige elektroforese worden gekwantificeerd. Berekening van het moment van de staart kan verder helpen aan het vergelijken van DNA-beschadiging onder verschillende experimentele groepen. Vergeleken met traditionele methoden van opsporing van DNA schade, is de bepaling van de komeet directe, gevoelige, goedkope en relatief eenvoudig.
Radiotherapie en chemokuren zijn gemeenschappelijke strategieën voor de behandeling van kanker door het genereren van enkele streng en dubbele streng DNA breekt in chromosomen6. De recente vooruitgang in DNA-reparatie-remmers laat een meer effectieve genotoxische werking door combinatie chemotherapie, en daarom, vermindert potentieel systemische bijwerkingen zoals bloedarmoede, infectie en het beenmerg onderdrukken7, 8. in deze studie, toonden we het onderzoek van een poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)-remmer, olaparib (Ola)9. PARP is een overvloedige nucleaire eiwit en is verantwoordelijk voor DNA base excision repair door de vorming van een poly (ADP-ribose) polymeer10. Temozolomide (TMZ) is een oraal beschikbaar alkylerend agent en is wijd verbeid gebruikt voor glioma patiënten behandeling. Met behulp van de bepaling van de komeet te kwantificeren van DNA-beschadiging, we laten zien dat de DNA-beschadiging in glioma cellen, hetgeen olaparib/temozolomide combinatietherapie is een effectieve strategie suggereert voor de behandeling van glioma, als combineren olaparib met temozolomide diep verbetert vergeleken met temozolomide alleen11.
De bepaling van de komeet is een doeltreffend instrument voor het meten van enkele en dubbele streng DNA-einden op cellulair niveau. De bepaling is algemeen toegepast als een “gouden standaard” in studies met betrekking tot genotoxiciteit en biomonitoring13, variërend van basis laesies, DNA crosslinks Geneesmiddelenontwikkeling en alkali-gevoelige plaatsen. In de huidige studie toonden we twee verschillende stapsgewijze protocollen voor alkalisch en neutraal komeet testen, respectievelijk. Combin…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gesteund door de intramurale Research Program van de NIH, NCI, en CCR. Alle auteurs ontvangen intramurale onderzoeksbeurs NIH, NCI, en CCR.
Reagents | |||
10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
EDTA | TEKnova | E0308 | |
Trizma base | Sigma | T1503 | |
NaOH | Sigma | 72068 | |
Sodium lauryl sarcosinate | Sigma | L7414 | |
Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
Sodium acetate | Sigma | 32318 | |
Glacial acetic acid | Sigma | 695092 | |
Ammonium acetate | Sigma | A1542 | |
SYBR Green | Invitrogen | S33102 | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
Agarose | Invitrogen | 16500 | |
95% ethanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Consumables | |||
Glass tissue slides | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | DENVILLE | ||
Pipette Tips | SHARP | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipments | |||
Microwave | Avanti | ||
Waterbath | PRECISION | ||
Horizontal electrophoresis chamber | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
Power supply | Bio-Rad | ||
Incubator | Quincy Lab | Model 12-140E | |
Fluorescent microscope | Zeiss | LSM700 | |
Micropipettor | Eppendorf |