Comet analysen er en effektiv måte å oppdage DNA skade inkludert single og double-strandet DNA bryter. Vi beskriver alkaliske og nøytrale comet analyser for å måle DNA skade i kreftcellene evaluere den terapeutiske effekten av kjemoterapi.
DNA skade er et vanlig fenomen for hver celle i løpet av sin levetid, og er definert som endring den kjemiske strukturen til genomisk DNA. Kreft behandlinger, som radio- og kjemoterapi, introdusere enorm ytterligere DNA skade, fører til celle syklus arrestasjon og apoptose begrense kreft progresjon. Kvantitativ vurdering av DNA skade under eksperimentelle kreft terapi er et viktig skritt å rettferdiggjøre effektiviteten av en gentoksisk agent. I denne studien vi fokusere på en enkelt celle geleelektroforese analysen, også kjent som kometen analysen, som kan kvantifisere enkelt og dobbel-strand DNA bryter i vitro. Comet analysen er en DNA skade kvantifisering metode som er effektiv og enkel å utføre, og har lav tid/budsjett krav og høy reproduserbarhet. Her markere vi nytten av kometen analysen for en prekliniske studie ved å evaluere gentoksisk effekten av olaparib/temozolomide Kombinasjonsbehandling U251 glioma celler.
Comet analysen ble først utviklet av Ostling og Johanson i 1984 ved å demonstrere migrering av DNA fragmenter fra atomkjerner under en nøytral betingelse1. Teknikken ble senere utviklet av Singh et al., viser at en alkalisk tilstand vesentlig økt spesifisitet og reproduserbarhet analysen2. Siden da nøytral comet analysen brukes hovedsakelig til å oppdage double-strandet DNA pauser, mens alkaliske comet analysen er mer følsomme for mindre mengde DNA-skader, inkludert single og double strand DNA bryter, lut-labil nettsteder, DNA-DNA eller DNA-protein cross-linking og DNA single-strand bryter forbundet med ufullstendig excision reparere nettsteder3,4. Begge analyser tillate visualisering av fragmentert DNA, og gir en enkel måte å evaluere kvantitativt DNA skade. Comet analysen regnes som sensitive metode for i vitro og i vivo genetiske toksikologiske undersøkelser og gjelder for ulike forskningsfelt, som tidlig narkotika-kandidat valg, miljøovervåking, menneskelige biomonitoring, og grunnleggende forskning i DNA skade og reparere5.
Prinsippet om analysen er at under et elektrisk felt, fragmenterte DNA overfører ut av nucleoid kroppen (også kjent som “comet-hodet”) og danner en DNA flekk i agarose gel (også kjent som “comet-hale”). Med nukleotid flekker, kan omfanget av DNA skade kvantifiseres ved å analysere “comets” dannet av dette enkelt celle geleelektroforese. Beregning av halen kan videre hjelpe sammenligne DNA skade annerledes eksperimentell grupper. Sammenlignet med tradisjonelle metoder for DNA skade gjenkjenning, er comet analysen direkte, følsom, billig og relativt enkle.
Strålebehandling og chemotherapies er vanlige strategier for kreftbehandling ved å generere enkelt tråd og dobbel tråd DNA bryter i kromosomene6. Det nylige fremskrittet i DNA reparasjon hemmere gjør en mer effektiv gentoksisk effekten av kombinasjonen kjemoterapi, og derfor reduserer potensielt systemisk bivirkninger som anemi, infeksjoner og benmarg undertrykkelse7, 8. i denne studien vi viste etterforskningen av en poly (ADP-ribose) utvalg (PARP) hemmer, olaparib (Ola)9. PARP er en rikelig kjernefysiske protein og er ansvarlig for DNA base excision reparasjon ved å danne en poly (ADP-ribose) polymer10. Temozolomide () er en muntlig tilgjengelig alkylating agent og har vært mye brukt for glioma pasient behandling. Ved hjelp av kometen analysen kvantifisere DNA skade, viser vi som kombinerer olaparib med temozolomide dypt øker DNA skade i glioma celler, noe som tyder på olaparib/temozolomide Kombinasjonsbehandling er en effektiv strategi å behandle glioma, som sammenlignet med temozolomide alene11.
Comet analysen er et effektivt verktøy til å måle singel og dobbel-strand DNA pauser på cellenivå. Analysen er mye brukt som en “gyllen standard” i studier om gentoksisitet og biomonitoring13, alt fra grunnleggende lesjoner, DNA krysskoblinger, narkotika utvikling og alkali følsomme områder. I studien viste vi to forskjellige trinnvise protokoller for alkaliske og nøytrale comet analyser, henholdsvis. Kombinere enkelt celle geleelektroforese, fluorescerende mikroskopi og bilde tolkning, gi…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av programmet for Intramural forskning på NIH, NCI og CCR. Alle forfattere fikk Intramural forskningsstipend fra NIH og NCI CCR.
Reagents | |||
10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
EDTA | TEKnova | E0308 | |
Trizma base | Sigma | T1503 | |
NaOH | Sigma | 72068 | |
Sodium lauryl sarcosinate | Sigma | L7414 | |
Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
Sodium acetate | Sigma | 32318 | |
Glacial acetic acid | Sigma | 695092 | |
Ammonium acetate | Sigma | A1542 | |
SYBR Green | Invitrogen | S33102 | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
Agarose | Invitrogen | 16500 | |
95% ethanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Consumables | |||
Glass tissue slides | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | DENVILLE | ||
Pipette Tips | SHARP | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipments | |||
Microwave | Avanti | ||
Waterbath | PRECISION | ||
Horizontal electrophoresis chamber | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
Power supply | Bio-Rad | ||
Incubator | Quincy Lab | Model 12-140E | |
Fluorescent microscope | Zeiss | LSM700 | |
Micropipettor | Eppendorf |