Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

تقييم أضرار الحمض النووي في المختبر باستخدام مقايسة المذنب

doi: 10.3791/56450 Published: October 11, 2017

Summary

مقايسة المذنب طريقة فعالة للكشف عن وقوع أضرار الحمض النووي بما في ذلك الحمض النووي مفرد، ومزدوج-الذين تقطعت بهم السبل. يصف لنا فحوصات المذنب القلوية ومحايدة لقياس الأضرار الحمض النووي في الخلايا السرطانية لتقييم التأثير العلاجي للعلاج الكيميائي.

Abstract

أضرار الحمض النووي هو ظاهرة شائعة لكل خلية أثناء به العمر، ويعرف بأنه تغيير التركيب الكيميائي للحمض النووي. علاجات السرطان، مثل الإذاعة والعلاج الكيميائي، إدخال كمية هائلة من المزيد من الضرر الحمض النووي، مما أدى إلى توقيف دورة الخلية والمبرمج للحد من تطور السرطان. التقييم الكمي للأضرار الحمض النووي أثناء علاج السرطان التجريبية خطوة رئيسية لتبرير فعالية عامل سمية جينية. في هذه الدراسة، علينا أن نركز على خلية مفردة التفريد مقايسة، المعروف أيضا مقايسة المذنب، التي يمكن قياس واحد ويكسر مزدوجة-حبلا الحمض النووي في المختبر. مقايسة المذنب هو أسلوب القياس الكمي تلف الحمض النووي التي تتسم بالكفاءة ومن السهل القيام به، وانخفاض الوقت/الميزانية المطالب وإمكانية تكرار نتائج عالية. هنا، نحن تسليط الضوء على فائدة مقايسة المذنب لدراسة السريرية بتقييم تأثير سمية جينية للعلاج المركب أولاباريب/تيموزولوميدي إلى U251 الدبقي الخلايا.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مقايسة المذنب تضعها لأول مرة قبل أوستلينج وجوهانسون في عام 1984 مما يدل على الهجرة من الحمض النووي وشظايا من الأنوية تحت شرط الحياد1. التقنية وضعت في وقت لاحق سينغ وآخرون، تبين أن شرط قلوية ازدادت كثيرا بخصوصية وإمكانية تكرار نتائج التحليل2. ومنذ ذلك الحين، مقايسة المذنب محايدة غالباً ما يستخدم للكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، بينما مزدوجة حبلا الحمض النووي فواصل، مواقع مجا القلوي، والحمض النووي DNA ومقايسة المذنب القلوية أكثر حساسية لكميات أصغر من ضرر الحمض النووي، بما في ذلك واحد أو الحمض النووي-البروتين العابرة للربط، وفواصل واحد-حبلا الحمض النووي المرتبطة بختان الإناث غير مكتملة إصلاح مواقع3،4. كلا فحوصات السماح التصور للحمض النووي مجزأة، وتوفر طريقة مباشرة لتقييم كمي تلف الحمض النووي. يعتبر أسلوب حساسة للدراسات السمية الجينية في المختبر و في فيفو مقايسة المذنب وتنطبق على مجالات بحثية مختلفة، مثل المخدرات-مرشح الاختيار المبكر والرصد البيئي والرصد البيولوجي البشري، والحريات الأساسية، البحث في ضرر الحمض النووي، وإصلاح5.

مبدأ المقايسة هو أن الحمض النووي مجزأة تحت مجال الكهربائي، يهاجر خارج الجسم نوكليويد (يعرف أيضا باسم "رأس المذنب") وتشكل وصمة عار الحمض النووي في [اغروس] هلام (يعرف أيضا باسم "ذيل المذنب"). مع تلطيخ النوكليوتيدات، يمكن قياسها كمياً مدى الضرر الحمض النووي من خلال تحليل "المذنبات" التي شكلتها هذا التفريد خلية مفردة. كذلك يمكن أن يساعد حساب لحظة الذيل مقارنة أضرار الحمض النووي من بين المجموعات التجريبية المختلفة. بالمقارنة مع الأساليب التقليدية للكشف عن تلف الحمض النووي، مقايسة المذنب المباشر وحساسة وغير مكلفة وبسيطة نسبيا.

العلاج الإشعاعي وتشيموثيرابيس، استراتيجيات مشتركة لعلاج السرطان عن طريق توليد جديلة واحدة والحمض النووي المزدوج حبلا فواصل في الكروموسومات6. التقدم الأخيرة في مثبطات إصلاح الحمض النووي يسمح له آثار سمية جينية أكثر فعالية عن طريق الجمع بين العلاج الكيميائي، وذلك، يحتمل أن يقلل من الآثار الجانبية الجهازية مثل الإصابة بفقر الدم ونخاع العظام قمع7، 8-في هذه الدراسة، ونحن أظهر التحقيق مثبط بوليميراز (تسنى) بولي (ADP-ريبوز)، أولاباريب (علا)9. تسنى بروتين النووي وفيرة وهي المسؤولة عن إصلاح الختان قاعدة الحمض النووي عن طريق تشكيل بوليمر بولي (ADP-ريبوز)10. Temozolomide (زد) هو عامل alkylating متاحة شفويا وقد استخدمت على نطاق واسع لمعالجة المرضى الدبقي. باستخدام مقايسة المذنب للتحديد الكمي للأضرار الحمض النووي، ونحن تثبت أن الجمع بين أولاباريب تيموزولوميدي عميقا يعزز تلف الحمض النووي في الخلايا الدبقي، مما يوحي بتركيبة أولاباريب/تيموزولوميدي العلاج استراتيجية فعالة لعلاج الدبقي، مقارنة مع تيموزولوميدي وحدها11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-"تحضير الكواشف"

  1. تمييع PBS 10 x 100 مل مع مل 900 dH 2 س 1 x PBS
    1. وضبط ال pH إلى 7.4 باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. تخزين في درجة حرارة الغرفة-
  2. تحلل الحل (LS)
    1. إعداد 2.5 م كلوريد الصوديوم، يدتا ثنائية الصوديوم 100 مم وقاعدة تريس 10 ملم ومم هيدروكسيد الصوديوم 200 مل 900 dH 2 س؛ ويستغرق عادة حوالي 20 دقيقة للسماح الخليط بالكامل حل. قم بضبط درجة الحموضة إلى 10 باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. إضافة ساركوسيناتي سولفات الصوديوم 1% و 1% X-100 تريتون، وضبط وحدة التخزين النهائي لمل 1,000. كول إلى 4 درجات مئوية على الأقل 30 دقيقة قبل الاستخدام.
  3. الحل التفريد القلوية (AES)، ودرجة الحموضة > 13
    1. إعداد 200 ملم ثنائي هيدروكسيد الصوديوم و 1 مم يدتا في مل 800 dH 2 O. ضبط درجة الحموضة وتأكد من أن الرقم الهيدروجيني > 13. ضبط وحدة التخزين النهائي لمل 1,000. جعل الطازجة قبل الاستخدام وباردة إلى 4 درجات مئوية على الأقل 30 دقيقة قبل الاستخدام.
  4. سولوشن التفريد محايدة (متنوعة)
    1. 1,000 إعداد مل التفريد محايدة المخزن المؤقت عن طريق خلط 100 ملم خلات الصوديوم 300 ملم وقاعدة تريس لمل 1,000 dH 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 9.0 مع حمض الخليك الجليدية. كول إلى 4 درجات مئوية على الأقل 30 دقيقة قبل الاستخدام.
  5. الحل ترسيب الحمض النووي (DPS)
    1. إعداد المخزون خلات الأمونيوم 7.5 م 10 مل. 50 مل من الحمض النووي هطول الأمطار الحل، مزيج من خلات الأمونيوم 7.5 M مل 6.7 مع الإيثانول 95% 43.3 مل. تخزين في درجة حرارة الغرفة-
  6. الحل ستاينينج
    1. إضافة 1 ميليلتر 10,000 x وصمة عار الحمض النووي الفلورية الخضراء (مثلاً، سيبر الأخضر) في 30 مل تريس يدتا المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl، يدتا ثنائية الصوديوم 1 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4) ومخزن في 4 درجة حماية جيم من النور-
  7. ذوبان منخفضة 1% [اغروس]
    1. ذوبان منخفضة 1% يذوب [اغروس] نقطة (ز 1 في 100 مل dH 2 س) في فرن ميكروويف. دوامة [اغروس] كل 15-20 ثانية للتأكد من أن [اغروس] تماما المنصهر. ضع [اغروس] في حمام الماء 37 درجة مئوية على الأقل 20 دقيقة قبل الاستخدام.
  8. نصائح ماصة الحارة قبل
    1. قطع غايات ضيقة من نصائح ماصة P200 3 مم والحارة في 37 درجة مئوية قبل بيبيتينج [اغروس]-

2. إعداد "شرائح المذنب"

  1. الشريحة طلاء
    1. تذوب 1% [اغروس] (ز 1 في 100 مل dH 2 س) في فرن ميكروويف لمدة 2-3 دقيقة أو حتى [اغروس] تماما المنصهر. تراجع الشرائح مجهر الزجاج إلى [اغروس] والقضاء على جانب واحد من الشريحة باستخدام مسح خالية من الوبر.
    2. وضع الشرائح على سطح مستو أيردري أو للحرارة عند 50 درجة مئوية للتجفيف أسرع؛ وينبغي تشكيل فيلم شفافة [اغروس] بعد التجفيف. ضع الشرائح المغلفة في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. إعداد تعليق خلية مفردة
    1. الثقافة وعلاج الخلية الدبقي
      1. ثقافة الخلايا ملغ U251 في F-12 دميم-هام المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين ميكروغرام/مل 10 في 37 & # 176؛ ج مع شركة 5% 2-
      2. هضم الخلايا باستخدام التربسين 1 مل لمدة 3 دقائق، وتحييد التربسين استخدام المتوسطة F-12 دميم-هام مع FBS. جمع في أنبوب 15 مل، تدور في 300 غ x دقيقة 4 ونضح على المديين المتوسط وتعليق الخلايا في 2 × 10 5 خلية/مل في برنامج تلفزيوني 1 س.
        ملاحظة: ينبغي إعداد نموذج الخلية مباشرة قبل البدء التحليل، وينبغي التعامل مع جميع العينات في بيئة مظلمة أو معتمة لمنع تلف الحمض النووي من الضوء.
      3. الجمع بين تعليق خلية مع 1% المنصهر نقطة انصهار منخفضة [اغروس] (عند 37 درجة مئوية) بنسبة 01:10 (v/v) وتخلط بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وفورا "الماصة؛" 30 ميليلتر إلى شريحة. استخدام الجانب من تلميح ماصة لنشر الخليط [اغروس]/خلية لضمان تشكيل طبقة رقيقة.
      4. مكان الشريحة شقة في 4 درجات مئوية في الظلام 10 دقيقة زيادة وقت 30 دقيقة التبلور يحسن تقيد عينات في بيئات مرتفعة الرطوبة.
      5. تزج الشريحة في 4 درجات مئوية LS في الظلام ل 1 (ح) بين عشية وضحاها.

3. واحد "التفريد خلية"

  1. المضي قدما إلى القلوية (الخطوة رقم 3.2) أو المذنب المحايدة (الخطوة 3، 3) الاعتداء
  2. مقايسة المذنب القلوية
    1. إزالة الشرائح بلطف من ليرة سورية واستنزاف فائض المخزن المؤقت وتزج برفق في الخدمات المعمارية والهندسية ح 1 في 4 درجة مئوية للسماح بتفكيك الحمض النووي. تبقى الشرائح في الظلام-
    2. AES يبرد قبل إضافة في علبة الشريحة التفريد، لا تتجاوز 0.5 سم فوق الشرائح (وهذا يعتمد على حجم الوحدات التفريد)، وضع الشرائح داخل وتغطية بحد أقصى. تعيين الجهد إمدادات الطاقة إلى 1 V/سم (الطول بين أقطاب) وتشغيل لمدة 30 دقيقة في 4 ° C.
    3. استنزاف الحل الكهربي الزائد من الشريحة. تزج بلطف الشرائح مرتين في dH 2 س ل 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
    4. تزج بلطف الشرائح في الإيثانول 70% لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انتقل إلى الخطوة 4.
  3. مقايسة المذنب محايدة
    1. إزالة الشرائح برفق من LS واستنزاف فائض المخزن المؤقت، وتزج برفق في الدائرة الوطنية للتوظيف لمدة 30 دقيقة في 4 ° جيم تبقى الشريحة في الظلام-
    2. إضافة التفريد محايدة مبردة قبل المخزن المؤقت في علبة الشريحة التفريد، لا تتجاوز 0.5 سم فوق الشرائح (وهذا يعتمد على حجم الوحدات التفريد)، وضع الشرائح داخل وتغطية بحد أقصى. تعيين الجهد إمدادات الطاقة إلى 1 V/سم (الطول بين أقطاب) وتشغيلها لمدة 45 دقيقة في 4 ° C.
    3. استنزاف فائض المخزن المؤقت من الشرائح. تزج بلطف الشرائح في توزيعات أرباح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
    4. تزج بلطف الشرائح في الإيثانول 70% لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. انتقل إلى الخطوة 4.

4. وصمة عار "الشرائح المذنب"

  1. الجاف للشرائح في 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة في الظلام-
  2. المجففة مكان 50-100 ميليلتر أخضر نيون الحمض النووي تلطيخ محلول على كل [اغروس] ووصمة عار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام-
  3. شطف الشرائح بإيجاز في dH 2 س
  4. وجاف تماما عند 37 درجة مئوية في الظلام. المضي قدما للحصول على الصور والتحليل-

5. صورة اقتناء وتحليل

ملاحظة: التصور والتقدير الكمي للدنا فواصل تستند ابيفلوريسسينسي المجهري والبرمجيات مقايسة المذنب (انظر الجدول للمواد) 12 .

  1. بوضع الشرائح في المجهر مع حامل شريحة. كفالة [اغروس] هلام تواجه عدسة الهدف. التقاط الصور من الشرائح المذنب ملطخة باستخدام مجهر الأسفار مع عدسة هدف 10 x عشوائياً. تجنب الحواف والمناطق المحيطة بأي فقاعات الهواء-
  2. ضمان أفقياً توزع كل ذيل المذنب. رؤساء المذنب ينبغي أن تنبع من الذيل من اليمين واليسار-
  3. حفظ كل صورة في تنسيق TIF ثنائي مع مشرق الحمض النووي وصمة عار وخلفية داكنة. تحميل الصور باستخدام البرمجيات " حدد ملفات لتحليل " زر، الذي يقع على الجانب الأيمن من شريط الأدوات. يجب أن تظهر نافذة عرض صورة ( الشكل 1).
  4. رسم إطار قياس على الشاشة وضبط حجمه وفقا مذنب الخلية. انقر فوق " ضبط " الزر لإعداد العتبة للرأس، والمذنب، والذيل وفقا للصورة، ثم انقر فوق " بدء القياسات " زر ( الشكل 1).
  5. حدد خلية باستخدام الإطار وتنشيط القياس عن طريق النقر بالماوس على " الاعتداء المذنب " زر؛ وكثافة الصورة التي تظهر على " ملامح " النافذة مع معلمات القياس المحدد. يمكن حفظ النتائج بالنقر " تخزين النتيجة " زر ( الشكل 1).
    ملاحظة: يحسب البرنامج المعلمات بما في ذلك طول ذيل المذنب، النسبة المئوية للحمض النووي الذيل، لحظة الذيل (TM) ولحظة ذيل الزيتون (اطم). لحظات الذيل يتم حسابها بواسطة الصيغ كما يلي:
    Equation 1
    Equation 2
  6. تحليل خلايا على الأقل 50 كل العلاج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويصف هذا البروتوكول سير عمل خطوة بخطوة لتنفيذ المقايسة المذنب وتحليل البيانات (الشكل 1). وأظهرت النتائج من فحوصات المذنب القلوية ومحايدة أن ذيل المذنب من الخلايا U251 معاملة ميتوتريكسات (1 ميكرومتر، ح 20) كان أطول وأعلى كثافة الحمض النووي، مما يوحي تراكم كبير من الحمض النووي مجزأة بسبب العلاج الكيميائي (الشكل 2).

وأظهر التحليل الكمي أما مقايسة المذنب القلوية أو محايدة تشكيل ذيل المذنب زيادة كبيرة بعد العلاج ميتوتريكسات (الشكل 3 أ) التي تشير إلى تلف الحمض النووي. وترد النتائج يعني ± ووزارة شؤون المرأة، و t-واستخدمت الاختبارات لمقارنات إحصائية. التحديد الكمي لهذه اللحظة الذيل من كلا فحوصات أكدت الزيادة في لحظة ذيل متوسط: مقايسة المذنب القلوية، 0.134 ± 0.0448 (n = 52) مقابل 13.84 ± 1.325 (n = 51)، ف < 0.01؛ مقايسة المذنب محايدة، 0.596 ± 0.06668 (n = 78) مقابل 9.979 ± 0.658 (n = 51)، ف < 0.01. توفر هذه البيانات مؤشر قابلة للقياس الكمي لتقييم أضرار الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، تعزيز تركيبة العلاج تسنى مثبط أولاباريب وتيموزولوميدي إلى حد كبير ضرر الحمض النووي في الخلايا الدبقي (الشكل 3)، مع ازدياد طول وكثافة الإشارة ذيل المذنب. أولاباريب وحدها لم يدخل ضرر الحمض النووي، في حين أنها بوتينتياتيد تأثير سمية جينية temozolomide عامل الكيماوي ([دمس]، 0.9836 ± 0.3377 (n = 64)؛ أولاباريب، 0.6663 ± 0.2325 (n = 51)؛ زد، 6.197 ± 0.572 (n = 51)؛ أولاباريب + زد، 44.04 ± 1.269(n = 115)، ف < 0.01).

Figure 1
الشكل 1 : دليل خطوة بخطوة لتحليل الصور باستخدام برمجيات مقايسة المذنب. (أ) شريط مقايسة المذنب البرمجيات. مقايسة المذنب القلوية (ب) على سبيل مثال: واجهة المستخدم الخاصة بالبرنامج مقايسة المذنب يتكون من عرض الصورة، وكثافة الشخصية، وإطار اقتناء البيانات. (ج) الصورة الخلفية ومنطقة المذنب ورأس المذنب حددت في البرنامج. يتم رسم ملامح (د) الكثافة رأس المذنب (أحمر) والذيل (الأخضر)، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : صور الممثل لفحوصات المذنب القلوية ومحايدة- U251 الدبقي الخلايا تعامل مع ميتوتريكسات والقلوية (لوحات العلوي) والمذنب المحايدة (أفرقة أقل) بالتحقيق فحوصات (مقياس بار = 10 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: بيانات تمثيلية من المذنب ذيل لحظة. (أ) المذنب القلوية مقايسة بيانات الأرض. ف < 0.01. (ب) المذنب محايدة مقايسة بيانات الأرض. ف < 0.01. (ج) كشف تحليل مقايسة المذنب أثر التآزري للجمع بين العلاج بما في ذلك تيموزولوميدي (زد) وأولاباريب (مكتب الشؤون القانونية). ف < 0.01. (د) صور الممثل من الخلايا الدبقي تحت العلاج مزيج من تيموزولوميدي وأولاباريب (مقياس بار = 10 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مقايسة المذنب أداة فعالة لقياس مفردة ومزدوجة-حبلا فواصل الحمض النووي على المستوى الخلوي. الإنزيم طبق على نطاق واسع ك "معيار ذهبي" في الدراسات بشأن السمية الجينية والرصد البيولوجي13، بدءاً من آفات قاعدة، كروسلينكس الحمض النووي وتطوير العقاقير والمواقع الحساسة القلوي. في هذه الدراسة، واظهرنا البروتوكولين خطوة بخطوة متميزة لفحوصات المذنب القلوية ومحايدة، على التوالي. الجمع بين التفريد خلية مفردة، ومجهر فلوري، وتفسير الصور، تقدم كلا فحوصات المذنب القلوية ومحايدة أضرار النهج الكمي لتقييم مدى الحمض النووي في المختبر.

عدة خطوات رئيسية ضرورية للتنفيذ الناجح مقايسة المذنب. على سبيل المثال، ينبغي الحرص في خطوات إعداد كاشف. ينبغي إعداد كل حل طازجة وتحفظ في درجة الحرارة المناسبة لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل الاستخدام، لمنع تلف الحمض النووي الذاتية أو إصلاح أثناء إعداد عينة. وهو خطوة حيوية أخرى إعداد تعليق خلية واحدة قابلة للحياة. من المهم أن تبقى [اغروس] عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام، إلى أقصى حد ممكن بقاء الخلية أثناء إعداد الشرائح المذنب. وينبغي إعداد تعليق خلية/[اغروس] فورا قبل البدء الفحص. استخدام الجانب من نصائح ماصة لنشر تعليق خلية/[اغروس] يساعد على تحقيق طبقة رقيقة من [اغروس] على الشرائح، حيث أن معظم الخلايا يمكن وضعه في نفس المستوى البؤري أثناء الفحص المجهري. بشكل اختياري، الصفر حواف الشرائح استخدام قلم الماس يميل إلى تحسين المرفق [اغروس].

وعلى الرغم من مزايا مقايسة المذنب، هناك العديد من القيود لهذا الأسلوب التقليدي14،15. على سبيل المثال، يحد من إنتاجية مقايسة المذنب عملية إعداد الشرائح الزجاجية. في بعض المناسبات، على شريحة زجاج وليد ثمانية يوفر حلاً تحسين الإنتاجية المقايسة. قيد آخر أن مقايسة المذنب ببساطة يمثل نسبة الحمض النووي مجزأة في الخلايا. مطلوب معلومات إضافية داعمة لدقة تصوير التغييرات الخلوية إلى جانب أضرار الحمض النووي. وفي هذه الحالة، تحليل المبرمج وتلطيخ γH2A.X، وإيمونوبلوتينج يمكن أن تكون مفيدة جداً لتوفير تحليل شامل للجوانب المختلفة للكشف عن تأثير الحمض النووي يضر وكلاء.

وهناك برامج عديدة لتحليل الصور المذنب ويتضمن الإخراج مجموعة متنوعة من معلمات مختلفة. المعلمات الأكثر استخداماً هي طول الذيل، النسبة المئوية للحمض النووي في الذيل، ولحظة الذيل. طول الذيل فقط يمكن استخدامها عند مستويات منخفضة من ضرر الحمض النووي، نظراً لأنها لا تميل إلى التغيير بمجرد الذيل القائمة14. في وقت لاحق، يزيد كثافة الذيل كما هو تعزيز الضرر. النسبة المئوية للحمض النووي في ذيل المذنب معلمة مفيدة أخرى، كما يرتبط خطيا إلى تواتر كسر. يجمع بين لحظة الذيل طول الذيل والذيل كثافة في قيمة واحدة واحدة، وبالتالي، فمن المعلمة مفيدة للغاية والمستخدمة بشكل متكرر.

مقايسة المذنب قد طبقت على نطاق واسع في اختبار السمية الجينية والرصد البيولوجي البشري. مع وضع مثبطات الإنزيم إصلاح الحمض النووي، يمكن مقايسة المذنب أداة قيمة لاختبار العلاجات المركبة التي تعمل على تحسين نتائج العلاج الكيميائي التقليدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث "برنامج البحوث الداخلية" للمعاهد الوطنية للصحة ولجنة التحقيق الوطنية، ومركز الحقوق الدستورية. وتلقى جميع المؤلفين "منحة بحثية داخلية" من المعاهد الوطنية للصحة، ولجنة التحقيق الوطنية، ومركز الحقوق الدستورية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
10x PBS(Ca++, Mg++ free) TEKnova P0196
NaCl Sigma S5886
EDTA TEKnova E0308
Trizma base Sigma T1503
NaOH Sigma 72068
Sodium lauryl sarcosinate Sigma L7414
Triton X-100 Sigma 93443
Sodium acetate Sigma 32318
Glacial acetic acid Sigma 695092
Ammonium acetate Sigma A1542
SYBR Green Invitrogen S33102
Low melting point agarose Invitrogen 16520
Agarose Invitrogen 16500
95% ethanol WARNER-GRAHAM #64-17-5
Trypsin GIBICO 25300-054
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Glass tissue slides ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 63422-11
Kimwipes KIMberly-Clark
1.5 mL Microcentrifuge Tubes DENVILLE
Pipette Tips SHARP
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Microwave Avanti
Waterbath PRECISION
Horizontal electrophoresis chamber TREVIGEN Cometassay ES II
Power supply Bio-Rad
Incubator Quincy Lab Model 12-140E
Fluorescent microscope Zeiss LSM700
Micropipettor Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123, (1), 291-298 (1984).
  2. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175, (1), 184-191 (1988).
  3. Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35, (3), 206-221 (2000).
  4. Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays. Indian J Exp Biol. 54, (8), 502-508 (2016).
  5. Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch Toxicol. 87, (6), 949-968 (2013).
  6. Goldstein, M., Kastan, M. B. The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).
  7. Gavande, N. S., et al. DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment? Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).
  8. Torgovnick, A., Schumacher, B. DNA repair mechanisms in cancer development and therapy. Front Genet. 6, 157 (2015).
  9. Weston, V. J., et al. The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo. Blood. 116, (22), 4578-4587 (2010).
  10. Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors. Cancer Discov. 7, (1), 20-37 (2017).
  11. Lu, Y., et al. Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair. Cancer Res. 77, (7), 1709-1718 (2017).
  12. Konca, K., et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 534, (1-2), 15-20 (2003).
  13. Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutat Res. 681, (1), 93-109 (2009).
  14. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26, (3), 249-261 (2004).
  15. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Sci Rep. 4, 7200 (2014).
تقييم أضرار الحمض النووي <em>في المختبر</em> باستخدام مقايسة المذنب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay. J. Vis. Exp. (128), e56450, doi:10.3791/56450 (2017).More

Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay. J. Vis. Exp. (128), e56450, doi:10.3791/56450 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter