مقايسة المذنب طريقة فعالة للكشف عن وقوع أضرار الحمض النووي بما في ذلك الحمض النووي مفرد، ومزدوج-الذين تقطعت بهم السبل. يصف لنا فحوصات المذنب القلوية ومحايدة لقياس الأضرار الحمض النووي في الخلايا السرطانية لتقييم التأثير العلاجي للعلاج الكيميائي.
أضرار الحمض النووي هو ظاهرة شائعة لكل خلية أثناء به العمر، ويعرف بأنه تغيير التركيب الكيميائي للحمض النووي. علاجات السرطان، مثل الإذاعة والعلاج الكيميائي، إدخال كمية هائلة من المزيد من الضرر الحمض النووي، مما أدى إلى توقيف دورة الخلية والمبرمج للحد من تطور السرطان. التقييم الكمي للأضرار الحمض النووي أثناء علاج السرطان التجريبية خطوة رئيسية لتبرير فعالية عامل سمية جينية. في هذه الدراسة، علينا أن نركز على خلية مفردة التفريد مقايسة، المعروف أيضا مقايسة المذنب، التي يمكن قياس واحد ويكسر مزدوجة-حبلا الحمض النووي في المختبر. مقايسة المذنب هو أسلوب القياس الكمي تلف الحمض النووي التي تتسم بالكفاءة ومن السهل القيام به، وانخفاض الوقت/الميزانية المطالب وإمكانية تكرار نتائج عالية. هنا، نحن تسليط الضوء على فائدة مقايسة المذنب لدراسة السريرية بتقييم تأثير سمية جينية للعلاج المركب أولاباريب/تيموزولوميدي إلى U251 الدبقي الخلايا.
مقايسة المذنب تضعها لأول مرة قبل أوستلينج وجوهانسون في عام 1984 مما يدل على الهجرة من الحمض النووي وشظايا من الأنوية تحت شرط الحياد1. التقنية وضعت في وقت لاحق سينغ وآخرون، تبين أن شرط قلوية ازدادت كثيرا بخصوصية وإمكانية تكرار نتائج التحليل2. ومنذ ذلك الحين، مقايسة المذنب محايدة غالباً ما يستخدم للكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، بينما مزدوجة حبلا الحمض النووي فواصل، مواقع مجا القلوي، والحمض النووي DNA ومقايسة المذنب القلوية أكثر حساسية لكميات أصغر من ضرر الحمض النووي، بما في ذلك واحد أو الحمض النووي-البروتين العابرة للربط، وفواصل واحد-حبلا الحمض النووي المرتبطة بختان الإناث غير مكتملة إصلاح مواقع3،4. كلا فحوصات السماح التصور للحمض النووي مجزأة، وتوفر طريقة مباشرة لتقييم كمي تلف الحمض النووي. يعتبر أسلوب حساسة للدراسات السمية الجينية في المختبر و في فيفو مقايسة المذنب وتنطبق على مجالات بحثية مختلفة، مثل المخدرات-مرشح الاختيار المبكر والرصد البيئي والرصد البيولوجي البشري، والحريات الأساسية، البحث في ضرر الحمض النووي، وإصلاح5.
مبدأ المقايسة هو أن الحمض النووي مجزأة تحت مجال الكهربائي، يهاجر خارج الجسم نوكليويد (يعرف أيضا باسم “رأس المذنب”) وتشكل وصمة عار الحمض النووي في [اغروس] هلام (يعرف أيضا باسم “ذيل المذنب”). مع تلطيخ النوكليوتيدات، يمكن قياسها كمياً مدى الضرر الحمض النووي من خلال تحليل “المذنبات” التي شكلتها هذا التفريد خلية مفردة. كذلك يمكن أن يساعد حساب لحظة الذيل مقارنة أضرار الحمض النووي من بين المجموعات التجريبية المختلفة. بالمقارنة مع الأساليب التقليدية للكشف عن تلف الحمض النووي، مقايسة المذنب المباشر وحساسة وغير مكلفة وبسيطة نسبيا.
العلاج الإشعاعي وتشيموثيرابيس، استراتيجيات مشتركة لعلاج السرطان عن طريق توليد جديلة واحدة والحمض النووي المزدوج حبلا فواصل في الكروموسومات6. التقدم الأخيرة في مثبطات إصلاح الحمض النووي يسمح له آثار سمية جينية أكثر فعالية عن طريق الجمع بين العلاج الكيميائي، وذلك، يحتمل أن يقلل من الآثار الجانبية الجهازية مثل الإصابة بفقر الدم ونخاع العظام قمع7، 8-في هذه الدراسة، ونحن أظهر التحقيق مثبط بوليميراز (تسنى) بولي (ADP-ريبوز)، أولاباريب (علا)9. تسنى بروتين النووي وفيرة وهي المسؤولة عن إصلاح الختان قاعدة الحمض النووي عن طريق تشكيل بوليمر بولي (ADP-ريبوز)10. Temozolomide (زد) هو عامل alkylating متاحة شفويا وقد استخدمت على نطاق واسع لمعالجة المرضى الدبقي. باستخدام مقايسة المذنب للتحديد الكمي للأضرار الحمض النووي، ونحن تثبت أن الجمع بين أولاباريب تيموزولوميدي عميقا يعزز تلف الحمض النووي في الخلايا الدبقي، مما يوحي بتركيبة أولاباريب/تيموزولوميدي العلاج استراتيجية فعالة لعلاج الدبقي، مقارنة مع تيموزولوميدي وحدها11.
مقايسة المذنب أداة فعالة لقياس مفردة ومزدوجة-حبلا فواصل الحمض النووي على المستوى الخلوي. الإنزيم طبق على نطاق واسع ك “معيار ذهبي” في الدراسات بشأن السمية الجينية والرصد البيولوجي13، بدءاً من آفات قاعدة، كروسلينكس الحمض النووي وتطوير العقاقير والمواقع الحساسة القلوي. في هذه ا?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا البحث “برنامج البحوث الداخلية” للمعاهد الوطنية للصحة ولجنة التحقيق الوطنية، ومركز الحقوق الدستورية. وتلقى جميع المؤلفين “منحة بحثية داخلية” من المعاهد الوطنية للصحة، ولجنة التحقيق الوطنية، ومركز الحقوق الدستورية.
Reagents | |||
10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
EDTA | TEKnova | E0308 | |
Trizma base | Sigma | T1503 | |
NaOH | Sigma | 72068 | |
Sodium lauryl sarcosinate | Sigma | L7414 | |
Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
Sodium acetate | Sigma | 32318 | |
Glacial acetic acid | Sigma | 695092 | |
Ammonium acetate | Sigma | A1542 | |
SYBR Green | Invitrogen | S33102 | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
Agarose | Invitrogen | 16500 | |
95% ethanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Consumables | |||
Glass tissue slides | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | DENVILLE | ||
Pipette Tips | SHARP | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipments | |||
Microwave | Avanti | ||
Waterbath | PRECISION | ||
Horizontal electrophoresis chamber | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
Power supply | Bio-Rad | ||
Incubator | Quincy Lab | Model 12-140E | |
Fluorescent microscope | Zeiss | LSM700 | |
Micropipettor | Eppendorf |