Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Evaluatie van de In Vitro DNA schade, met behulp van komeet Assay

doi: 10.3791/56450 Published: October 11, 2017

Summary

De bepaling van de komeet is een efficiënte methode om op te sporen DNA schade met inbegrip van single- en double-stranded DNA breekt. We beschrijven alkalisch en neutraal komeet testen voor het meten van DNA-beschadiging in kankercellen het therapeutische effect van chemotherapie te beoordelen.

Abstract

DNA-beschadiging is een gemeenschappelijk fenomeen voor elke cel tijdens zijn levensduur, en wordt gedefinieerd als een wijziging van de chemische structuur van genomic DNA. Kankertherapieën, zoals radio- en chemotherapie, introduceren enorme hoeveelheid extra DNA-beschadiging, leidt tot de arrestatie van de celcyclus en apoptosis te beperken van de progressie van kanker. Kwantitatieve beoordeling van DNA-beschadiging tijdens de experimentele kankertherapie is een belangrijke stap ter rechtvaardiging van de effectiviteit van een genotoxische agent. In deze studie, richten we ons op een eencellige elektroforese assay, ook bekend als de komeet assay, die enkele kwantificeren kan en dubbele streng DNA breekt in vitro. De bepaling van de komeet is een DNA schade kwantificering methode die efficiënt en gemakkelijk uit te voeren, en heeft weinig tijd/begroting eisen en hoge reproduceerbaarheid. Hier, wijzen wij op het nut van de komeet assay voor een preklinische studie door de beoordeling van het effect van de genotoxische van olaparib/temozolomide combinatietherapie naar U251 glioma cellen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De komeet assay werd in 1984 voor het eerst ontwikkeld door Ostling en Johanson door aan te tonen dat de migratie van DNA fragmenten van kernen onder een neutrale voorwaarde1. De techniek werd later ontwikkeld door Singh et al., waaruit blijkt dat een alkalische toestand aanzienlijk verhoogd de specificiteit en de reproduceerbaarheid van de test2. Sindsdien, de neutrale komeet bepaling wordt meestal gebruikt om op te sporen double-stranded DNA breekt, terwijl de alkalische komeet assay gevoeliger voor kleinere hoeveelheden DNA schade is, met inbegrip van enkele en dubbele streng DNA, alkali-labiele sites, DNA-DNA breekt of DNA-eiwit dwarsbinding en DNA single-strand einden gekoppeld aan onvolledige excisie repareren sites3,4. Beide testen visualisatie van gefragmenteerde DNA, verlenen en een eenvoudige manier om te kwantitatief DNA-schade te evalueren. De komeet bepaling wordt beschouwd als een gevoelige methode voor in vitro en in vivo genetische toxicologische studies en is van toepassing op de verschillende onderzoekgebieden, zoals vroege drug-kandidaat selectie, milieubewaking, menselijke biomonitoring, en fundamenteel onderzoek op DNA-beschadiging en repareren van5.

Het principe van de test is dat onder een elektrisch veld, gefragmenteerde DNA migreert uit het nucleoïde lichaam (ook bekend als de "komeet-head") en vormt een vlek van DNA in de agarose gel (ook bekend als de "komeet-staart"). Met de nucleotide kleuring, kan de omvang van de schade van DNA door het analyseren van "kometen" gevormd door deze eencellige elektroforese worden gekwantificeerd. Berekening van het moment van de staart kan verder helpen aan het vergelijken van DNA-beschadiging onder verschillende experimentele groepen. Vergeleken met traditionele methoden van opsporing van DNA schade, is de bepaling van de komeet directe, gevoelige, goedkope en relatief eenvoudig.

Radiotherapie en chemokuren zijn gemeenschappelijke strategieën voor de behandeling van kanker door het genereren van enkele streng en dubbele streng DNA breekt in chromosomen6. De recente vooruitgang in DNA-reparatie-remmers laat een meer effectieve genotoxische werking door combinatie chemotherapie, en daarom, vermindert potentieel systemische bijwerkingen zoals bloedarmoede, infectie en het beenmerg onderdrukken7, 8. in deze studie, toonden we het onderzoek van een poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)-remmer, olaparib (Ola)9. PARP is een overvloedige nucleaire eiwit en is verantwoordelijk voor DNA base excision repair door de vorming van een poly (ADP-ribose) polymeer10. Temozolomide (TMZ) is een oraal beschikbaar alkylerend agent en is wijd verbeid gebruikt voor glioma patiënten behandeling. Met behulp van de bepaling van de komeet te kwantificeren van DNA-beschadiging, we laten zien dat de DNA-beschadiging in glioma cellen, hetgeen olaparib/temozolomide combinatietherapie is een effectieve strategie suggereert voor de behandeling van glioma, als combineren olaparib met temozolomide diep verbetert vergeleken met temozolomide alleen11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. voorbereiden reagentia

  1. 1 x PBS
    1. 100 mL 10 x PBS met 900 mL dH 2 O Verdun en breng de pH op 7.4 met behulp van een pH-meter. Bewaren bij kamertemperatuur.
  2. Lysis oplossing (LS)
    1. bereiden 2.5 M NaCl, 100 mM Dinatrium-EDTA, 10 mM Tris base en 200 mM NaOH in 900 mL dH 2 O; het duurt gewoonlijk ongeveer 20 min te laat het mengsel volledig los. Breng de pH op 10 met behulp van een pH-meter. Voeg 1% sodium lauryl dat en 1% Triton X-100, en het uiteindelijke volume tot 1000 mL. Cool tot 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik.
  3. De Elektroforese van de alkaline oplossing (AES), pH > 13
    1. 200 mM NaOH en 1 mM Dinatrium EDTA in 800 mL dH 2 O. aanpassen de pH te bereiden en ervoor te zorgen dat er pH > 13. Het uiteindelijke volume tot 1000 mL. Maak vóór gebruik vers en koel hem af tot 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik.
  4. Neutraal elektroforese sollution (NES)
    1. bereiden 1.000 mL neutrale elektroforese buffer door het mengen van 100 mM Tris base en 300 mM Natriumacetaat naar 1000 mL dH 2 O. Adjust pH 9.0 met ijsazijn. Cool tot 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik.
  5. DNA neerslag oplossing (DPS)
    1. voorbereiding van 10 mL 7,5 M ammonium acetaat voorraad. Meng voor 50 mL DNA neerslag oplossing, 6,7 mL 7,5 M ammoniumacetaat met 43,3 mL 95% ethanol. Bewaren bij kamertemperatuur.
  6. Staining oplossing
    1. Voeg 1 µL 10.000 x groen fluorescent nucleïnezuur vlek (bijvoorbeeld, SYBR groen) in 30 mL Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM Dinatrium-EDTA, pH 7.4) en winkel bij 4 ° C. Protect van licht.
  7. 1% lage smelten agarose
    1. smelten van 1% laag punt agarose (1 g in 100 mL dH 2 O) in de magnetron te smelten. Swirl de agarose elke 15-20 s om ervoor te zorgen dat de agarose volledig gesmolten is. Plaats de agarose in het waterbad 37 ° C gedurende ten minste 20 minuten vóór gebruik.
  8. Vooraf warm Pipetteer tips
    1. afgesneden van de smalle uiteinden van P200 Pipetteer tips door 3 mm en warm bij 37 ° C vóór pipetteren agarose.

2. Bereiden Comet dia's

  1. Slide coating
    1. Melt 1% agarose (1 g in 100 mL dH 2 O) in de magnetron gedurende 2-3 minuten of totdat de agarose volledig gesmolten is. Dompel de dia's van glas, Microscoop in de agarose en één zijde van de dia met behulp van een pluisvrije doekje vegen.
    2. Leggen de dia's op een vlakke ondergrond om te drogen of warmte bij 50 ° C voor sneller drogen; een transparante agarose film moet worden gevormd na het drogen. Plaats de gecoate dia's in 37 ° C vóór gebruik.
  2. Voorbereiding van eencellige schorsingen
    1. cultuur en behandelen de glioma cel
      1. cultuur van de cellen van de U251 MG in DMEM-Ham F-12 medium aangevuld met 10% FBS, 100 U/mL penicilline en 10 µg Fe/mL streptomycine op 37 & # 176; C met 5% CO 2.
      2. Verteren de cellen met behulp van 1 mL trypsine gedurende 3 minuten, en neutraliseren met behulp van DMEM-Ham F-12 medium met FBS trypsine. Verzamelen in de tube van 15 mL, draaien op 300 x g voor 4 min, gecombineerd het medium en schorten cellen bij 2 x 10, 5 cellen/mL in 1 x PBS.
        Opmerking: Het monster van de cel onmiddellijk voordat de bepaling moet worden voorbereid en alle monsters moeten worden behandeld in de omgeving van een donker of lichter gekleurd weergegeven om te voorkomen dat DNA-beschadiging van licht.
      3. De celsuspensie combineren met 1% agarose van de gesmolten lage smeltpunt (bij 37 ° C) bij een verhouding 1:10 (v/v), meng zachtjes op en neer waarbij en onmiddellijk Pipetteer 30 µL op een dia. Gebruik de zijkant van de het uiteinde van de pipet te verspreiden het mengsel agarose/cel om ervoor te zorgen de vorming van een laagje.
      4. Plaatst de dia plat bij 4 ° C in het donker voor 10 min. steeds meer gelerend aan 30 min verbetert de hechting van monsters in omgevingen met hoge luchtvochtigheid.
      5. Onderdompelen van de dia in 4 ° C LS in het donker voor 1 h naar girale.

3. Enkele cel elektroforese

  1. Ga verder naar alkalisch (stap 3.2) of neutraal (stap 3.3) komeet assay
  2. voor alkalische komeet assay
    1. zachtjes dia's te verwijderen van de LS, afvoer van overtollige buffer en zachtjes onderdompelen in AES gedurende 1 uur bij 4 ° C om DNA tot rust te komen. Houd de dia's in het donker.
    2. De vooraf gekoeld AES toevoegen in de lade met het dia elektroforese overschrijd niet 0,5 cm boven de dia's (dit hangt af van de grootte van de elektroforese eenheden), plaatst u de dia's binnen en bedek met een cap. Het netspanningsvoltage instelt op 1 V/cm (de lengte tussen de elektroden) en u gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
    3. Afvoer overtollige elektroforese oplossing van dia. Voorzichtig Dompel dia's tweemaal in dH 2 O gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Onderdompelen zachtjes dia's in 70% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Ga verder met stap 4.
  3. Voor neutrale komeet assay
    1. zachtjes het verwijderen van de dia's uit de LS, afvoer van overtollige buffer en zachtjes onderdompelen in NES gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Houd de dia in het donker.
    2. Toevoegen vooraf gekoeld neutrale elektroforese buffer in de lade met het dia elektroforese overschrijd niet 0,5 cm boven dia's (dit hangt af van de grootte van de elektroforese eenheden), plaatst u de dia's binnen en bedek met een cap. Het netspanningsvoltage instelt op 1 V/cm (de lengte tussen de elektroden) en u voor 45 min bij 4 ° C.
    3. Afvoer overtollige buffer van de dia's. Voorzichtig Dompel onder dia's in DPS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Voorzichtig Dompel de dia's in 70% ethanol gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Ga verder met stap 4.

4. Vlekken van komeet dia's

  1. droge dia's bij 37 ° C gedurende 10-15 min. in het donker.
  2. Plaats 50-100 µL groen fluorescent nucleïnezuur kleurstofoplossing op elk gedroogde agarose en vlek gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  3. Spoel van de dia's kort in dH 2 O en droog volledig bij 37 ° C in het donker. Ga naar image aquisition en analyse.

5. Verwerving en analyse van het beeld

Opmerking: de visualisatie en de kwantificering van DNA-einden zijn gebaseerd op epifluorescence microscopie en de komeet assay software (Zie Tabel van materialen) 12 .

  1. De dia's op de microscoop met de houder van een dia plaatsen. Zorg ervoor dat de agarose gel is kijkend naar het objectief. Willekeurig opnamen uit de gekleurde komeet dia's met behulp van een fluorescentie Microscoop met een objectief van 10 x. De randen en de gebieden rond alle luchtbellen voorkomen.
  2. Zorg ervoor dat elke staart van de komeet is horizontaal verdeeld. Komeet hoofden zouden afkomstig moeten zijn uit de linker- en de staart vanaf de rechterkant.
  3. Elke afbeelding opslaan in een binaire TIF-indeling met heldere vlek van DNA en donkere achtergrond. Afbeeldingen voor het gebruik van de software laden de " Selecteer bestanden om te analyseren " knop, die aan de linkerkant van de werkbalk ligt. Het venster van de weergave van een afbeelding moet worden weergegeven ( Figuur 1).
  4. Een frame van de meting op het scherm tekent en de omvang ervan overeenkomstig de komeet van de cel aan te passen. Klik op de " aanpassen " knop voor het instellen van de drempel van het hoofd, comet en staart volgens de afbeelding en klik vervolgens op de " Start van de metingen " knop ( Figuur 1).
  5. Selecteer een cel met behulp van het frame en de meting activeren door te klikken met de muis op de " Assay de komeet " knop; een intensiteit beeld verschijnt op het " profielen " venster met de parameters van de geselecteerde meting. De resultaten kunnen worden opgeslagen door te klikken op de " resultaat opslaan " knop ( Figuur 1).
    Opmerking: De software berekent de parameters met inbegrip van de lengte van de staart van de komeet, het percentage van de staart DNA, het moment van de staart (TM) en het moment staart Olive (OTM). De staart momenten door de formules worden berekend als volgt:
    Equation 1
    Equation 2
  6. analyseren van ten minste 50 cellen per behandeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor de uitvoering van de bepaling van de komeet en data-analyse (Figuur 1). Resultaten van de alkalische en neutrale komeet testen bleek dat de staart van de komeet van Doxorubicine-behandeld U251 cellen (1 µM, 20 h) langer was en had hogere intensiteit van het DNA, suggereren een aanzienlijke accumulatie van gefragmenteerde DNA als gevolg van chemotherapie (Figuur 2).

Kwantitatieve analyse voor beide de basische of neutrale komeet assay bleek aanzienlijk verhoogde komeet staart vorming na Doxorubicine behandeling (figuur 3A) die aangeeft van DNA-beschadiging. Resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM, en t-tests werden gebruikt voor statistische vergelijkingen. Kwantificering van het moment van de staart van beide tests bevestigd de stijging van de gemiddelde staart moment: voor de alkalische komeet assay, 0.134 ± 0.0448 (n = 52) vs. 13.84 ± 1.325 (n = 51), p < 0,01; Voor de neutrale komeet assay, 0.596 ± 0.06668 (n = 78) vs. 9.979 ± 0.658 (n = 51), p < 0,01. Deze gegevens geven een kwantificeerbare index om DNA-schade te evalueren. Bovendien verbeterd combinatie behandeling van PARP-remmer olaparib en temozolomide aanzienlijk DNA-beschadiging in glioma cellen (Figuur 3 c), met een grotere lengte en intensiteit van het signaal van de staart komeet. Olaparib alleen niet overgenomen DNA-beschadiging, overwegende dat het de genotoxische effect van het chemo agent temozolomide Potentiation (DMSO, 0.9836 ± 0.3377 (n = 64); Olaparib, 0.6663 ± 0.2325 (n = 51); TMZ, 6.197 ± 0.572 (n = 51); Olaparib + TMZ, 44.04 ± 1.269(n = 115), p < 0,01).

Figure 1
Figuur 1 : Stapsgewijze handleiding voor beeldanalyse komeet assay softwarematig. (A) de werkbalk van de komeet test software. (B) Alkaline komeet assay als voorbeeld: de gebruikersinterface van komeet assay software bestaat uit een weergave van de afbeelding, intensiteit profiel en gegevens overname venster. (C) de afbeelding achtergrond, komeet regio en hoofd van de komeet zijn gedefinieerd in de software. (D) de intensiteit profielen van de kop van de komeet (rood) en de staart (groen) zijn uitgezet, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Representatieve beelden van de alkalische en neutrale komeet testen. U251 glioma cellen werden behandeld met Doxorubicine en onderzocht door alkalische (bovenste panelen) en neutraal (lagere panelen) komeet assays (schaal bar = 10 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Representatieve gegevens van de komeet staart moment. (A) Alkaline komeet assay gegevens plot. p < 0,01. (B) neutraal komeet assay gegevens plot. p < 0,01. (C) Comet assay analyse bleek het synergetische effect van de combinatietherapie met inbegrip van temozolomide (TMZ) en olaparib (Ola). p < 0,01. (D) representatieve beelden van glioma cellen onder de combinatie behandeling van temozolomide en de olaparib (schaal bar = 10 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De bepaling van de komeet is een doeltreffend instrument voor het meten van enkele en dubbele streng DNA-einden op cellulair niveau. De bepaling is algemeen toegepast als een "gouden standaard" in studies met betrekking tot genotoxiciteit en biomonitoring13, variërend van basis laesies, DNA crosslinks Geneesmiddelenontwikkeling en alkali-gevoelige plaatsen. In de huidige studie toonden we twee verschillende stapsgewijze protocollen voor alkalisch en neutraal komeet testen, respectievelijk. Combinatie van eencellige elektroforese, fluorescent microscopie en beeldinterpretatie, bieden zowel de alkalische en neutrale komeet testen kwantitatieve benaderingen te evalueren in welke mate van DNA schade in vitro.

Verschillende belangrijke stappen zijn essentieel voor de succesvolle uitvoering van de bepaling van de komeet. Bijvoorbeeld, moet worden gezorgd in de stappen van de bereiding van het reagens. Elke oplossing moet vers worden bereid en bewaard op de juiste temperatuur gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik, endogene DNA schade voorkomen of herstellen tijdens de bereiding. Een andere belangrijke stap is de voorbereiding van een levensvatbare eencellige schorsing. Het is belangrijk om te houden van het agarose bij 37 ° C vóór gebruik, om te maximaliseren van de overleving van de cel tijdens de voorbereiding van de komeet dia's. De cel/agarose schorsing moet onmiddellijk voordat de test worden voorbereid. Met behulp van de kant van de uiteinden van de pipet te verspreiden van de cel/agarose schorsing helpt om een dun laagje agarose op de dia's, zodat de meeste van de cellen kunnen worden geplaatst in de zelfde brandvlak tijdens microscopie. Optioneel, krassen op de randen van de dia's met behulp van een pen diamant-tipped ter verbetering van de agarose bijlage.

Ondanks de voordelen van de bepaling van de komeet zijn er enkele beperkingen van deze traditionele methode14,15. Bijvoorbeeld, wordt de doorvoer van de komeet bepaling beperkt door het proces van de voorbereiding van de dia's glas. In sommige gevallen biedt een acht-welled glasplaatje een oplossing om te assay doorvoer verbeteren. Een andere beperking is dat de bepaling van de komeet gewoon de verhouding van het gefragmenteerde DNA in cellen vertegenwoordigt. Extra ondersteunende informatie noodzakelijk is om grondig verbeelden de cellulaire veranderingen naast DNA-schade. In dat geval apoptosis analyse γH2A.X kleuring en immunoblotting kunnen zeer nuttig zijn om een grondige analyse van de verschillende aspecten te onthullen van het effect van DNA beschadigen agenten.

Er zijn vele software voor beeldanalyse van de komeet en de uitvoer omvat een verscheidenheid van verschillende parameters. De meest gebruikte parameters zijn de staartlengte, het percentage van DNA in de staart, en het moment van de staart. Staartlengte kan alleen worden gebruikt op een laag niveau van DNA-beschadiging, aangezien het heeft niet de neiging om te veranderen zodra de staart gevestigde14 is. Vervolgens neemt de intensiteit van de staart toe naarmate de schade wordt versterkt. Het percentage van DNA in de staart van de komeet is een andere handige parameter, als deze lineair gerelateerd is aan de frequentie breken. Het moment van de staart combineert staartlengte en staart intensiteit in één enkele waarde, dus het is de meest nuttige en vaak gebruikte parameter.

De komeet bepaling is algemeen toegepast in genotoxiciteitsonderzoek en menselijke biomonitoring. Met de ontwikkeling van DNA-reparatie enzym remmers kan de komeet-bepaling een waardevol instrument voor het testen van de combinatie therapieën die verbetering van het resultaat van traditionele chemotherapie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gesteund door de intramurale Research Program van de NIH, NCI, en CCR. Alle auteurs ontvangen intramurale onderzoeksbeurs NIH, NCI, en CCR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
10x PBS(Ca++, Mg++ free) TEKnova P0196
NaCl Sigma S5886
EDTA TEKnova E0308
Trizma base Sigma T1503
NaOH Sigma 72068
Sodium lauryl sarcosinate Sigma L7414
Triton X-100 Sigma 93443
Sodium acetate Sigma 32318
Glacial acetic acid Sigma 695092
Ammonium acetate Sigma A1542
SYBR Green Invitrogen S33102
Low melting point agarose Invitrogen 16520
Agarose Invitrogen 16500
95% ethanol WARNER-GRAHAM #64-17-5
Trypsin GIBICO 25300-054
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Glass tissue slides ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 63422-11
Kimwipes KIMberly-Clark
1.5 mL Microcentrifuge Tubes DENVILLE
Pipette Tips SHARP
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Microwave Avanti
Waterbath PRECISION
Horizontal electrophoresis chamber TREVIGEN Cometassay ES II
Power supply Bio-Rad
Incubator Quincy Lab Model 12-140E
Fluorescent microscope Zeiss LSM700
Micropipettor Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123, (1), 291-298 (1984).
  2. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175, (1), 184-191 (1988).
  3. Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35, (3), 206-221 (2000).
  4. Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays. Indian J Exp Biol. 54, (8), 502-508 (2016).
  5. Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch Toxicol. 87, (6), 949-968 (2013).
  6. Goldstein, M., Kastan, M. B. The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).
  7. Gavande, N. S., et al. DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment? Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).
  8. Torgovnick, A., Schumacher, B. DNA repair mechanisms in cancer development and therapy. Front Genet. 6, 157 (2015).
  9. Weston, V. J., et al. The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo. Blood. 116, (22), 4578-4587 (2010).
  10. Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors. Cancer Discov. 7, (1), 20-37 (2017).
  11. Lu, Y., et al. Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair. Cancer Res. 77, (7), 1709-1718 (2017).
  12. Konca, K., et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 534, (1-2), 15-20 (2003).
  13. Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutat Res. 681, (1), 93-109 (2009).
  14. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26, (3), 249-261 (2004).
  15. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Sci Rep. 4, 7200 (2014).
Evaluatie van de <em>In Vitro</em> DNA schade, met behulp van komeet Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay. J. Vis. Exp. (128), e56450, doi:10.3791/56450 (2017).More

Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay. J. Vis. Exp. (128), e56450, doi:10.3791/56450 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter