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Cancer Research

इन विट्रो डीएनए क्षति का मूल्यांकन धूमकेतु परख का उपयोग

doi: 10.3791/56450 Published: October 11, 2017

Summary

धूमकेतु परख एक कुशल विधि एकल और डबल-असहाय डीएनए टूट सहित डीएनए क्षति का पता लगाने के लिए है । हम alkaline और तटस्थ धूमकेतु परख का वर्णन करने के लिए कैंसर की कोशिकाओं में डीएनए क्षति को मापने के लिए कीमोथेरेपी के उपचारात्मक प्रभाव का मूल्यांकन ।

Abstract

डीएनए क्षति प्रत्येक कोशिका के लिए अपनी उंर के दौरान एक आम घटना है, और जीनोमिक डीएनए की रासायनिक संरचना के परिवर्तन के रूप में परिभाषित किया गया है । ऐसे रेडियो के रूप में कैंसर चिकित्सा, और रसायन चिकित्सा, अतिरिक्त डीएनए क्षति की भारी राशि परिचय, सेल चक्र गिरफ्तारी और apoptosis के लिए अग्रणी करने के लिए कैंसर की प्रगति की सीमा । प्रयोगात्मक कैंसर थेरेपी के दौरान डीएनए क्षति का मात्रात्मक आकलन एक genotoxic एजेंट की प्रभावशीलता का औचित्य साबित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । इस अध्ययन में, हम एक एकल सेल ट्रो परख पर ध्यान केंद्रित भी धूमकेतु परख, जो एकल और दोहरे-किनारा डीएनए टूट विट्रो मेंयों तो कर सकते है के रूप में जाना जाता है । धूमकेतु परख एक डीएनए क्षति ठहराव विधि है कि कुशल और प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और कम समय है/ यहां, हम U251 तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं को olaparib/temozolomide संयोजन चिकित्सा के genotoxic प्रभाव का मूल्यांकन करके एक नैदानिक अध्ययन के लिए धूमकेतु परख की उपयोगिता पर प्रकाश डाला ।

Introduction

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धूमकेतु परख पहले १९८४ में Ostling और जोहनसन द्वारा एक तटस्थ शर्त1के तहत नाभिक से डीएनए अंशों के प्रवास का प्रदर्शन करके विकसित किया गया था । तकनीक बाद में सिंह एट अलद्वारा विकसित किया गया था, दिखा रहा है कि एक alkaline हालत में काफी विशिष्टता और परख2के reproducibility वृद्धि हुई है । तब से, तटस्थ धूमकेतु परख ज्यादातर के लिए दोहरे-असहाय डीएनए टूट जाता है, जबकि alkaline धूमकेतु परख डीएनए क्षति की छोटी मात्रा के लिए और अधिक संवेदनशील है का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है, एकल और डबल किनारा डीएनए टूट जाता है, क्षार-labile साइटों, डीएनए-डीएनए या डीएनए-प्रोटीन पार से जोड़ने, और डीएनए एकल किनारा अधूरा उत्पाद की मरंमत के साथ जुड़े ब्रेक साइटें3,4। दोनों परख खंडित डीएनए के दृश्य की अनुमति है, और एक सीधी तरह से मात्रात्मक डीएनए नुकसान का मूल्यांकन प्रदान करते हैं । धूमकेतु परख के लिए एक संवेदनशील विधि के रूप में माना जाता है इन विट्रो में और vivo आनुवंशिक विषाक्तता अध्ययन में और विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों के लिए लागू है, जैसे जल्दी दवा-उंमीदवार चयन, पर्यावरणीय निगरानी, मानव की निगरानी, और डीएनए क्षति में मौलिक अनुसंधान और5मरंमत ।

परख के सिद्धांत यह है कि एक बिजली के क्षेत्र के तहत, खंडित डीएनए nucleoid शरीर से बाहर जाता है (भी "धूमकेतु सिर" के रूप में जाना) और agarose जेल में एक डीएनए दाग रूपों (भी "धूमकेतु पूंछ के रूप में जाना") । न्यूक्लियोटाइड धुंधला के साथ, डीएनए क्षति की हद तक इस एकल कोशिका ट्रो द्वारा गठित "धूमकेतु" का विश्लेषण करके मात्रा जा सकता है । पूंछ पल की गणना आगे अलग प्रयोगात्मक समूहों के बीच डीएनए क्षति की तुलना करने में मदद कर सकते हैं । डीएनए क्षति का पता लगाने के पारंपरिक तरीकों के साथ तुलना में, धूमकेतु परख प्रत्यक्ष, संवेदनशील, सस्ती है, और अपेक्षाकृत आसान है ।

रेडियोथेरेपी और chemotherapies एक कतरा पैदा करके कैंसर के इलाज के लिए आम रणनीति है और गुणसूत्रों में डबल कतरा डीएनए टूट जाता है6। डीएनए मरंमत अवरोधकों में हाल ही में उंनति की अनुमति देता है संयोजन कीमोथेरेपी द्वारा एक और अधिक प्रभावी genotoxic प्रभाव, और इसलिए, संभावित एनीमिया, संक्रमण, और अस्थि मज्जा दमन7जैसे प्रणालीगत दुष्प्रभाव को कम करती है, 8. इस अध्ययन में, हमने एक पाली (ADP-ribose) पोलीमरेज़ (प्प) अवरोधक, olaparib (ओला)9की जांच को दिखाया । प्प एक प्रचुर मात्रा में परमाणु प्रोटीन है और एक पाली (ADP-ribose) बहुलक10बनाने के द्वारा डीएनए बेस उत्पाद शुल्क की मरंमत के लिए जिंमेदार है । Temozolomide (TMZ) एक मौखिक रूप से उपलब्ध alkylating एजेंट है और व्यापक रूप से तंत्रिकाबंधार्बुद रोगी उपचार के लिए इस्तेमाल किया गया है । धूमकेतु परख का उपयोग करके डीएनए नुकसान यों, हम प्रदर्शित करता है कि temozolomide के साथ संयोजन olaparib तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं में डीएनए क्षति को बढ़ाता है, जो olaparib/temozolomide संयोजन थेरेपी का सुझाव है एक प्रभावी रणनीति तंत्रिकाबंधार्बुद के इलाज के रूप में temozolomide अकेले11के साथ तुलना में ।

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Protocol

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< p class = "jove_title" > 1. रिएजेंट्स को तैयार करें

  1. 1x पंजाबस
    1. पतला १०० एमएल 10x पंजाबियों के साथ ९०० मिलीलीटर डीएच 2 हे और एक पीएच मीटर का उपयोग कर ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें । कमरे के तापमान पर स्टोर.
  2. Lysis समाधान (LS)
    1. तैयार २.५ मीटर NaCl, १०० एमएम disodium EDTA, 10 एमएम Tris बेस, और २०० एमएम NaOH में ९०० एमएल डीएच 2 ओ; यह सामांयतः के बारे में 20 मिनट लगते है मिश्रण पूरी तरह से भंग करने की अनुमति । पीएच एक पीएच मीटर का उपयोग कर 10 को समायोजित करें । 1% सोडियम lauryl sarcosinate और 1% ट्राइटन X-१०० जोड़ें, और अंतिम मात्रा १,००० मिलीलीटर के लिए समायोजित करें । कूल टू 4 & #176; C उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए.
  3. क्षार ट्रो समाधान (एईएस), पीएच & #62; 13
    1. तैयार २०० एमएम NaOH व 1 एमएम disodium EDTA में ८०० एमएल डीएच 2 ओ. पीएच समायोजित करें और यह सुनिश्चित करें कि यह ph & है #62; 13. अंतिम वॉल्यूम को १,००० mL में समायोजित करें । प्रयोग करने से पहले ताजा कर लें और 4 & #176; C का उपयोग करने से पूर्व कम से कम 30 min के लिए;
  4. न्यूट्रल ट्रो सोलूशन (NES)
    1. तैयार १,००० एमएल न्यूट्रल ट्रो बफर को मिलाकर १०० एमएम Tris बेस और ३०० एमएम सोडियम एसीटेट को १,००० एमएल डीएच 2 हे. हिमनदों एसिटिक एसिड के साथ ९.० को पीएच समायोजित करें । कूल टू 4 & #176; C उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए.
  5. डीएनए वर्षा समाधान (डीपीएस)
    1. 10 एमएल ७.५ मीटर अमोनियम एसीटेट स्टॉक की तैयारी । डीएनए वर्षा समाधान के ५० मिलीलीटर के लिए, ४३.३ मिलीलीटर ९५% इथेनॉल के साथ ६.७ मिलीलीटर ७.५ M अमोनियम एसीटेट मिलाएं । कमरे के तापमान पर स्टोर.
  6. दाग समाधान
    1. जोड 1 & #181; L 10, 000x & #160; ग्रीन फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग ( जैसे , SYBR ग्रीन) में 30 एमएल Tris-EDTA बफर (10 एमएम Tris-एचसीएल, 1 एमएम disodium EDTA, पीएच ७.४) और स्टोर 4 & #176 पर; C. से सुरक्षित रखें हल्.
  7. 1% कम पिघलने agarose
    1. पिघल 1% कम पिघल बिंदु agarose (1 जी में १०० मिलि डीएच 2 O) एक माइक्रोवेव में । भंवर agarose हर 15-20 s यकीन है कि agarose पूरी तरह से पिघला हुआ है बनाने के लिए । agarose को ३७ & #176 में रखें; C पानी स्नान का उपयोग करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए ।
  8. प्री-वार्म पिपेट टिप्स
    1. कट ऑफ़ P200 पिपेट टिप्स के संकीर्ण सिरों को 3 mm और गर्म करके ३७ & #176; ग से पहले pipetting agarose.
< p class = "jove_title" > 2. धूमकेतु स्लाइड तैयार करें

  1. स्लाइड कोटिंग
    1. पिघल 1% agarose (1 जी में १०० मिलीलीटर डीएच 2 O) एक माइक्रोवेव में 2-3 मिनट के लिए या जब तक agarose पूरी तरह से पिघला हुआ है । agarose में ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड डुबकी और एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछ का उपयोग कर स्लाइड के एक तरफ पोंछ ।
    2. हवा के लिए एक सपाट सतह पर स्लाइड रखना-सूखी या गर्मी में ५० & #176; तेज सुखाने के लिए C; सूखने के बाद एक पारदर्शी agarose फिल्म बनाई जानी चाहिए । लेपित स्लाइड्स में ३७ & #176; C उपयोग करने से पहले रखें ।
  2. सिंगल सेल सस्पेंशन की तैयारी
    1. कल्चर और तंत्रिकाबंधार्बुद सेल
      1. कल्चर U251 में एमजी सेल DMEM-हैम एफ-12 मध्यम पूरक 10% FBS, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, और 10 & #181; g/ml streptomycin पर ३७ & # १७६; ग के साथ 5% कं 2 .
      2. 3 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर trypsin का उपयोग कर कोशिकाओं को पचाने, और FBS के साथ DMEM-हैम एफ-12 माध्यम का उपयोग trypsin बेअसर । 15 मिलीलीटर ट्यूब में लीजिए, 4 मिनट के लिए ३०० x g पर स्पिन, मध्यम महाप्राण, और 2 x 10 5 सेल/
        में कम सेल/ नोट: सेल नमूना परख शुरू करने से पहले तुरंत तैयार किया जाना चाहिए और सभी नमूनों एक अंधेरे या मंद वातावरण में नियंत्रित किया जाना चाहिए प्रकाश से डीएनए क्षति को रोकने के लिए ।
      3. 1% पिघला हुआ कम पिघल बिंदु agarose के साथ सेल निलंबन गठबंधन (३७ & #176; C) पर एक अनुपात 1:10 (v/v), धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण, और तुरंत पिपेट 30 & #181; L एक स्लाइड पर. एक पतली परत के गठन को सुनिश्चित करने के लिए agarose/सेल मिश्रण फैलाने के लिए पिपेट टिप के साइड का प्रयोग करें ।
      4. जगह पर स्लाइड फ्लैट 4 & #176; C 10 मिनट के लिए अंधेरे में. तालमेल समय को बढ़ाने के लिए 30 मिनट उच्च आर्द्रता के वातावरण में नमूनों के पालन में सुधार.
      5. 4 & #176 में विसर्जित कर दिया; सी रास में रात भर के लिए 1 घंटे के लिए अंधेरे में ।
< p class = "jove_title" > 3. सिंगल सेल ट्रो

  1. क्षारीय (चरण ३.२) या तटस्थ (चरण ३.३) धूमकेतु परख
  2. alkaline धूमकेतु परख
    1. के लिए आगे बढ़ना धीरे LS, नाली अतिरिक्त बफर से स्लाइड को दूर करने के लिए, और धीरे 4 में 1 घंटे के लिए एईएस में विसर्जित डीएनए को खोलना अनुमति देने के लिए & #176; सी. स्लाइड्स को अंधेरे में रखें ।
    2. ट्रो स्लाइड ट्रे में पूर्व ठंडा एईएस जोड़ें, स्लाइड के ऊपर ०.५ सेमी से अधिक नहीं है (यह ट्रो इकाइयों के आकार पर निर्भर करता है), अंदर स्लाइड जगह और एक टोपी के साथ कवर । 1 V/cm (इलेक्ट्रोड के बीच लंबाई) के लिए बिजली की आपूर्ति वोल्टेज सेट और 4 & #176 पर 30 मिनट के लिए चलाने के लिए; C.
    3. जाऊन अतिरिक्त ट्रो स्लाइड से समाधान । धीरे कमरे के तापमान पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए डीएच 2 हे में दो बार स्लाइड विसर्जित कर दिया ।
    4. धीरे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल में स्लाइड विसर्जित कर दिया । चरण 4.
    5. के लिए आगे बढ़ें
  3. तटस्थ धूमकेतु परख
    1. के लिए धीरे से, LS से स्लाइड निकालें अतिरिक्त बफर, और धीरे 4 पर 30 मिनट के लिए NES में विसर्जित & #176; C. स्लाइड को अंधेरे में रखें.
    2. जोड़ें पूर्व ठंडा तटस्थ ट्रो बफर ट्रो स्लाइड ट्रे में, स्लाइड के ऊपर ०.५ सेमी से अधिक नहीं है (यह ट्रो इकाइयों के आकार पर निर्भर करता है), अंदर स्लाइड प्लेस और एक टोपी के साथ कवर । 1 V/cm (इलेक्ट्रोड के बीच लंबाई) के लिए बिजली की आपूर्ति वोल्टेज सेट और 4 & #176 पर ४५ मिनट के लिए चलाने के लिए; C.
    3. स्लाइड से अधिक बफ़र ड्रेन । धीरे से स्लाइड & #160; डीपीएस में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर विसर्जित कर दिया ।
    4. धीरे कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल में स्लाइड विसर्जित कर दिया । चरण 4.
    5. के लिए आगे बढ़ें
< p class = "jove_title" > 4. दाग धूमकेतु स्लाइड

  1. शुष्क स्लाइड पर ३७ & #176; ग के लिए अंधेरे में 10-15 मिनट.
  2. प्लेस ५०-१०० & #181; एल ग्रीन फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड धुंधला प्रत्येक सूखे agarose पर समाधान और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए दाग ।
  3. कुल्ला स्लाइड संक्षेप में डीएच 2 ओ और सूखी पूरी तरह से ३७ & #176; ग अंधेरे में । छवि अधिग्रहण और विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें ।
< p class = "jove_title" > 5. छवि प्राप्ति और विश्लेषण

< p class = "jove_content" > ध्यान दें: दृश्य और डीएनए के ठहराव टूट जाता है epifluorescence माइक्रोस्कोपी पर आधारित हैं और धूमकेतु परख सॉफ्टवेयर (देखें सामग्री की तालिका ) < सुप क्लास = "xref" > १२ .

  1. स्लाइड होल्डर से माइक्रोस्कोप पर स्लाइड रखें । सुनिश्चित करें कि agarose जेल उद्देश्य लेंस के लिए सामना करना पड़ रहा है । अचानक एक 10x उद्देश्य लेंस के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग दाग धूमकेतु स्लाइड से छवियों पर कब्जा । किनारों और किसी भी हवाई बुलबुले के आसपास के क्षेत्रों से बचें ।
  2. सुनिश्चित प्रत्येक धूमकेतु पूंछ क्षैतिज वितरित किया जाता है । धूमकेतु सिर छोड़ दिया और सही से पूंछ से शुरू करना चाहिए ।
  3. उज्ज्वल डीएनए दाग और अंधेरे पृष्ठभूमि के साथ एक बाइनरी TIF प्रारूप में प्रत्येक चित्र को बचाने के लिए । का उपयोग कर सॉफ्टवेयर के लिए छवियों को लोड & #34; उपकरण पट्टी के बाईं ओर स्थित है जो & #34; बटन का विश्लेषण करने के लिए फ़ाइलों का चयन करें । एक छवि दृश्य विंडो दिखनी चाहिए (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ ).
  4. स्क्रीन पर एक माप फ्रेम आकर्षित और सेल के धूमकेतु के अनुसार इसके आकार को समायोजित । क्लिक करें & #34; समायोजित & #34; बटन छवि के अनुसार सिर, धूमकेतु, और पूंछ की दहलीज सेट करने के लिए, फिर क्लिक करें & #34; प्रारंभ मापन & #34; बटन (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ ).
  5. फ़्रेम का उपयोग करके किसी कक्ष का चयन करें और माप को सक्रिय करने के लिए माउस के साथ क्लिक करके & #34; परख धूमकेतु & #34; बटन; एक तीव्रता छवि पर पता चलता है & #34;p rofiles & #34; चयनित माप पैरामीटर के साथ विंडो । & #34 पर क्लिक कर के परिणाम सहेजे जा सकते हैं; संग्रह परिणाम & #34; बटन (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ ).
    नोट: सॉफ्टवेयर धूमकेतु पूंछ की लंबाई, पूंछ डीएनए का प्रतिशत, पूंछ पल (TM) और जैतून का पूंछ पल (OTM) सहित मापदंडों की गणना करता है । पूंछ क्षणों के रूप में फार्मूले से गणना कर रहे है का पालन करें:
    < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56450/56450eq1.jpg"/>
    < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56450/56450eq2.jpg"/>
  6. कम से ५० कोशिकाओं का विश्लेषण प्रति उपचार.

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Representative Results

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वर्तमान प्रोटोकॉल धूमकेतु परख निष्पादन और डेटा विश्लेषण के लिए एक कदम दर कदम कार्यप्रवाह का वर्णन (चित्रा 1). alkaline और तटस्थ धूमकेतु परख से परिणाम से पता चला कि डॉक्सोरूबिसिन के धूमकेतु पूंछ-U251 कोशिकाओं का इलाज (1 µ एम, 20 एच) अब था और उच्च डीएनए तीव्रता था, खंडित डीएनए कीमोथेरेपी के कारण (चित्रा 2) के एक पर्याप्त संचय का सुझाव ।

या तो alkaline या तटस्थ धूमकेतु परख के लिए मात्रात्मक विश्लेषण डॉक्सोरूबिसिन उपचार के बाद काफी वृद्धि हुई धूमकेतु पूंछ गठन दिखाया (आंकड़ा 3) डीएनए क्षति का संकेत । परिणाम मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, और टीपरीक्षण सांख्यिकीय तुलना के लिए इस्तेमाल किया गया । दोनों परख से पूंछ पल के ठहराव औसत पूंछ पल की वृद्धि की पुष्टि: alkaline धूमकेतु परख के लिए, ०.१३४ ± ०.०४४८ (n = ५२) बनाम १३.८४ ± १.३२५ (n = ५१), p & #60; ०.०१; तटस्थ धूमकेतु परख के लिए, ०.५९६ ± ०.०६६६८ (n = ७८) बनाम ९.९७९ ± ०.६५८ (n = ५१), p & #60; ०.०१ । इन आंकड़ों को डीएनए क्षति का मूल्यांकन करने के लिए एक quantifiable सूचकांक प्रदान करते हैं । इसके अलावा, प्प अवरोध करनेवाला olaparib और temozolomide के संयोजन उपचार तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं में काफी बढ़ाया डीएनए क्षति (आंकड़ा 3सी), एक वृद्धि की लंबाई और धूमकेतु पूंछ संकेत की तीव्रता के साथ. अकेले Olaparib डीएनए क्षति का परिचय नहीं था, जबकि यह chemo एजेंट temozolomide के genotoxic प्रभाव potentiated (DMSO, ०.९८३६ ± ०.३३७७ (n = ६४); Olaparib, ०.६६६३ ± ०.२३२५ (n = ५१); TMZ, ६.१९७ ± ०.५७२ (n = ५१); Olaparib + TMZ, ४४.०४ ± 1.269 (n = ११५), & #60; ०.०१).

Figure 1
चित्र 1 : धूमकेतु परख सॉफ्टवेयर का उपयोग छवि विश्लेषण के कदम दर कदम गाइड । () धूमकेतु परख सॉफ्टवेयर के टूलबार । () एक उदाहरण के रूप में alkaline धूमकेतु परख: धूमकेतु परख सॉफ्टवेयर के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस एक छवि को देखने के होते हैं, तीव्रता प्रोफ़ाइल, और डेटा अधिग्रहण खिड़की । () सॉफ्टवेयर में इमेज बैकग्राउंड, धूमकेतु क्षेत्र, और धूमकेतु प्रमुख परिभाषित किए गए थे । (D) धूमकेतु सिर (लाल) और पूंछ (हरा) की तीव्रता प्रोफाइल क्रमश: रची जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : क्षारीय और तटस्थ धूमकेतु परख के प्रतिनिधि छवियां । U251 तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं डॉक्सोरूबिसिन के साथ इलाज किया और alkaline (ऊपरी पैनलों) और तटस्थ (कम पैनलों) धूमकेतु परख (स्केल बार = 10 µm) द्वारा जांच की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: धूमकेतु पूंछ पल के प्रतिनिधि डेटा । (एक) alkaline धूमकेतु परख डेटा साजिश । * * & #60; ०.०१. () तटस्थ धूमकेतु परख डेटा भूखंड । * * & #60; ०.०१. () धूमकेतु परख विश्लेषण temozolomide (TMZ) और olaparib (ओला) सहित संयोजन चिकित्सा के synergistic प्रभाव से पता चला. * * & #60; ०.०१. (D) temozolomide और olaparib (स्केल बार = 10 µm) के संयोजन उपचार के अंतर्गत तंत्रिकाबंधार्बुद कक्षों की प्रतिनिधि छवियां । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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धूमकेतु परख सेलुलर स्तर पर एकल और डबल-किनारा डीएनए टूटता को मापने के लिए एक कुशल उपकरण है । परख genotoxicity और13, आधार घावों, डीएनए crosslinks, औषध विकास, और क्षार संवेदनशील साइटों से लेकर निगरानी के बारे में अध्ययन में एक "गोल्डन मानक" के रूप में व्यापक रूप से लागू किया गया है । वर्तमान अध्ययन में, हम alkaline और तटस्थ धूमकेतु परख, क्रमशः के लिए दो अलग कदम दर कदम प्रोटोकॉल दिखाया । एक सेल ट्रो, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, और छवि व्याख्या, दोनों alkaline और तटस्थ धूमकेतु परख के संयोजन मात्रात्मक दृष्टिकोण को इन विट्रो मेंडीएनए क्षति की हद तक मूल्यांकन प्रदान करते हैं ।

धूमकेतु की परख के सफल निष्पादन के लिए कई महत्वपूर्ण कदम जरूरी हैं । उदाहरण के लिए, देखभाल एजेंट तैयारी के चरणों में लिया जाना चाहिए । प्रत्येक समाधान नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए और उपयोग करने से पहले, अंतर्जात डीएनए क्षति को रोकने के लिए या नमूना तैयार करने के दौरान मरम्मत के लिए उचित तापमान पर रखा । एक अंय महत्वपूर्ण कदम व्यवहार्य एकल सेल निलंबन की तैयारी है । यह प्रयोग करने से पहले ३७ डिग्री सेल्सियस पर agarose रखने के लिए महत्वपूर्ण है, धूमकेतु स्लाइड की तैयारी के दौरान सेल अस्तित्व को अधिकतम करने के लिए । कक्ष/agarose निलंबन की परख शुरू करने से पहले तुरंत तैयार कर लेना चाहिए । सेल/agarose के प्रसार के लिए पिपेट युक्तियों के पक्ष का उपयोग करना स्लाइड् स पर agarose की पतली परत को प्राप्त करने में मदद करता है, ताकि माइक्रोस्कोपी के दौरान अधिकांश कोशिकाएं एक ही फोकल विमान में तैनात की जा सकें । वैकल्पिक रूप से, agarose अनुलग्नक को बेहतर बनाने के लिए एक हीरे-ढोने वाले पेन का उपयोग करके स्लाइड्स के किनारों को स्क्रैच करें ।

धूमकेतु परख के फायदे के बावजूद, इस पारंपरिक विधि की14,15की कई सीमाएं हैं । उदाहरण के लिए, धूमकेतु परख का प्रवाह कांच स्लाइड की तैयारी की प्रक्रिया द्वारा सीमित है । कुछ अवसरों में, एक आठ-पडे गिलास स्लाइड परख प्रवाह में सुधार करने के लिए एक समाधान प्रदान करता है । एक और सीमा यह है कि धूमकेतु परख बस कोशिकाओं में खंडित डीएनए के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है । अतिरिक्त सहायक जानकारी के लिए अच्छी तरह से डीएनए क्षति के अलावा सेलुलर परिवर्तन चित्रित करने की आवश्यकता है । उस मामले में, apoptosis विश्लेषण, γH2A. X धुंधला, और immunoblotting बहुत अलग पहलुओं का एक गहन विश्लेषण प्रदान करने के लिए डीएनए हानिकारक एजेंटों के प्रभाव को प्रकट मददगार हो सकता है ।

वहां धूमकेतु छवि विश्लेषण के लिए कई सॉफ्टवेयर और उत्पादन कर रहे है विभिंन मापदंडों की एक किस्म भी शामिल है । सबसे अधिक इस्तेमाल किया मापदंडों पूंछ लंबाई, पूंछ में डीएनए का प्रतिशत है, और पूंछ पल रहे हैं । पूंछ लंबाई केवल डीएनए क्षति के निम्न स्तर पर इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि यह एक बार पूंछ14की स्थापना की है बदलने के लिए नहीं करते हैं । इसके बाद, पूंछ की तीव्रता बढ़ जाती है के रूप में नुकसान बढ़ाया है । धूमकेतु पूंछ में डीएनए का प्रतिशत एक और उपयोगी पैरामीटर है, के रूप में यह रैखिक तोड़ने आवृत्ति से संबंधित है । पूंछ पल एक ही मूल्य में पूंछ लंबाई और पूंछ तीव्रता को जोड़ती है, इस प्रकार, यह सबसे उपयोगी और अक्सर इस्तेमाल किया पैरामीटर है ।

धूमकेतु परख व्यापक रूप से genotoxicity परीक्षण और मानव की निगरानी में लागू किया गया है । डीएनए की मरंमत एंजाइम अवरोधकों के विकास के साथ, धूमकेतु परख संयोजन उपचार है कि पारंपरिक कीमोथेरेपी के परिणाम में सुधार के परीक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को NIH, NCI, और सीसीआर के अंदर रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया । सभी लेखकों NIH, NCI, और CCR से अंदर अनुसंधान अनुदान प्राप्त किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
10x PBS(Ca++, Mg++ free) TEKnova P0196
NaCl Sigma S5886
EDTA TEKnova E0308
Trizma base Sigma T1503
NaOH Sigma 72068
Sodium lauryl sarcosinate Sigma L7414
Triton X-100 Sigma 93443
Sodium acetate Sigma 32318
Glacial acetic acid Sigma 695092
Ammonium acetate Sigma A1542
SYBR Green Invitrogen S33102
Low melting point agarose Invitrogen 16520
Agarose Invitrogen 16500
95% ethanol WARNER-GRAHAM #64-17-5
Trypsin GIBICO 25300-054
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Glass tissue slides ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 63422-11
Kimwipes KIMberly-Clark
1.5 mL Microcentrifuge Tubes DENVILLE
Pipette Tips SHARP
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Microwave Avanti
Waterbath PRECISION
Horizontal electrophoresis chamber TREVIGEN Cometassay ES II
Power supply Bio-Rad
Incubator Quincy Lab Model 12-140E
Fluorescent microscope Zeiss LSM700
Micropipettor Eppendorf

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इन <em>विट्रो</em> डीएनए क्षति का मूल्यांकन धूमकेतु परख का उपयोग
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Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay. J. Vis. Exp. (128), e56450, doi:10.3791/56450 (2017).More

Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay. J. Vis. Exp. (128), e56450, doi:10.3791/56450 (2017).

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