इन विट्रो डीएनए क्षति का मूल्यांकन धूमकेतु परख का उपयोग
Summary
धूमकेतु परख एक कुशल विधि एकल और डबल-असहाय डीएनए टूट सहित डीएनए क्षति का पता लगाने के लिए है । हम alkaline और तटस्थ धूमकेतु परख का वर्णन करने के लिए कैंसर की कोशिकाओं में डीएनए क्षति को मापने के लिए कीमोथेरेपी के उपचारात्मक प्रभाव का मूल्यांकन ।
Abstract
डीएनए क्षति प्रत्येक कोशिका के लिए अपनी उंर के दौरान एक आम घटना है, और जीनोमिक डीएनए की रासायनिक संरचना के परिवर्तन के रूप में परिभाषित किया गया है । ऐसे रेडियो के रूप में कैंसर चिकित्सा, और रसायन चिकित्सा, अतिरिक्त डीएनए क्षति की भारी राशि परिचय, सेल चक्र गिरफ्तारी और apoptosis के लिए अग्रणी करने के लिए कैंसर की प्रगति की सीमा । प्रयोगात्मक कैंसर थेरेपी के दौरान डीएनए क्षति का मात्रात्मक आकलन एक genotoxic एजेंट की प्रभावशीलता का औचित्य साबित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । इस अध्ययन में, हम एक एकल सेल ट्रो परख पर ध्यान केंद्रित भी धूमकेतु परख, जो एकल और दोहरे-किनारा डीएनए टूट विट्रो मेंयों तो कर सकते है के रूप में जाना जाता है । धूमकेतु परख एक डीएनए क्षति ठहराव विधि है कि कुशल और प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और कम समय है/ यहां, हम U251 तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं को olaparib/temozolomide संयोजन चिकित्सा के genotoxic प्रभाव का मूल्यांकन करके एक नैदानिक अध्ययन के लिए धूमकेतु परख की उपयोगिता पर प्रकाश डाला ।
Introduction
धूमकेतु परख पहले १९८४ में Ostling और जोहनसन द्वारा एक तटस्थ शर्त1के तहत नाभिक से डीएनए अंशों के प्रवास का प्रदर्शन करके विकसित किया गया था । तकनीक बाद में सिंह एट अलद्वारा विकसित किया गया था, दिखा रहा है कि एक alkaline हालत में काफी विशिष्टता और परख2के reproducibility वृद्धि हुई है । तब से, तटस्थ धूमकेतु परख ज्यादातर के लिए दोहरे-असहाय डीएनए टूट जाता है, जबकि alkaline धूमकेतु परख डीएनए क्षति की छोटी मात्रा के लिए और अधिक संवेदनशील है का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है, एकल और डबल किनारा डीएनए टूट जाता है, क्षार-labile साइटों, डीएनए-डीएनए या डीएनए-प्रोटीन पार से जोड़ने, और डीएनए एकल किनारा अधूरा उत्पाद की मरंमत के साथ जुड़े ब्रेक साइटें3,4। दोनों परख खंडित डीएनए के दृश्य की अनुमति है, और एक सीधी तरह से मात्रात्मक डीएनए नुकसान का मूल्यांकन प्रदान करते हैं । धूमकेतु परख के लिए एक संवेदनशील विधि के रूप में माना जाता है इन विट्रो में और vivo आनुवंशिक विषाक्तता अध्ययन में और विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों के लिए लागू है, जैसे जल्दी दवा-उंमीदवार चयन, पर्यावरणीय निगरानी, मानव की निगरानी, और डीएनए क्षति में मौलिक अनुसंधान और5मरंमत ।
परख के सिद्धांत यह है कि एक बिजली के क्षेत्र के तहत, खंडित डीएनए nucleoid शरीर से बाहर जाता है (भी “धूमकेतु सिर” के रूप में जाना) और agarose जेल में एक डीएनए दाग रूपों (भी “धूमकेतु पूंछ के रूप में जाना”) । न्यूक्लियोटाइड धुंधला के साथ, डीएनए क्षति की हद तक इस एकल कोशिका ट्रो द्वारा गठित “धूमकेतु” का विश्लेषण करके मात्रा जा सकता है । पूंछ पल की गणना आगे अलग प्रयोगात्मक समूहों के बीच डीएनए क्षति की तुलना करने में मदद कर सकते हैं । डीएनए क्षति का पता लगाने के पारंपरिक तरीकों के साथ तुलना में, धूमकेतु परख प्रत्यक्ष, संवेदनशील, सस्ती है, और अपेक्षाकृत आसान है ।
रेडियोथेरेपी और chemotherapies एक कतरा पैदा करके कैंसर के इलाज के लिए आम रणनीति है और गुणसूत्रों में डबल कतरा डीएनए टूट जाता है6। डीएनए मरंमत अवरोधकों में हाल ही में उंनति की अनुमति देता है संयोजन कीमोथेरेपी द्वारा एक और अधिक प्रभावी genotoxic प्रभाव, और इसलिए, संभावित एनीमिया, संक्रमण, और अस्थि मज्जा दमन7जैसे प्रणालीगत दुष्प्रभाव को कम करती है, 8. इस अध्ययन में, हमने एक पाली (ADP-ribose) पोलीमरेज़ (प्प) अवरोधक, olaparib (ओला)9की जांच को दिखाया । प्प एक प्रचुर मात्रा में परमाणु प्रोटीन है और एक पाली (ADP-ribose) बहुलक10बनाने के द्वारा डीएनए बेस उत्पाद शुल्क की मरंमत के लिए जिंमेदार है । Temozolomide (TMZ) एक मौखिक रूप से उपलब्ध alkylating एजेंट है और व्यापक रूप से तंत्रिकाबंधार्बुद रोगी उपचार के लिए इस्तेमाल किया गया है । धूमकेतु परख का उपयोग करके डीएनए नुकसान यों, हम प्रदर्शित करता है कि temozolomide के साथ संयोजन olaparib तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं में डीएनए क्षति को बढ़ाता है, जो olaparib/temozolomide संयोजन थेरेपी का सुझाव है एक प्रभावी रणनीति तंत्रिकाबंधार्बुद के इलाज के रूप में temozolomide अकेले11के साथ तुलना में ।
Protocol
1. रिएजेंट्स को तैयार करें 1x पंजाबस पतला १०० एमएल 10x पंजाबियों के साथ ९०० मिलीलीटर डीएच 2 हे और एक पीएच मीटर का उपयोग कर ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें । कमरे के तापमान पर स्टोर. <li…
Representative Results
Discussion
धूमकेतु परख सेलुलर स्तर पर एकल और डबल-किनारा डीएनए टूटता को मापने के लिए एक कुशल उपकरण है । परख genotoxicity और13, आधार घावों, डीएनए crosslinks, औषध विकास, और क्षार संवेदनशील साइटों से लेकर निगरानी के बारे में अध…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को NIH, NCI, और सीसीआर के अंदर रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया । सभी लेखकों NIH, NCI, और CCR से अंदर अनुसंधान अनुदान प्राप्त किया ।
Materials
| Reagents | |||
| 10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| EDTA | TEKnova | E0308 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaOH | Sigma | 72068 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Sigma | L7414 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Sodium acetate | Sigma | 32318 | |
| Glacial acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Ammonium acetate | Sigma | A1542 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S33102 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500 | |
| 95% ethanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
| Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Glass tissue slides | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
| Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | DENVILLE | ||
| Pipette Tips | SHARP | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Microwave | Avanti | ||
| Waterbath | PRECISION | ||
| Horizontal electrophoresis chamber | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
| Power supply | Bio-Rad | ||
| Incubator | Quincy Lab | Model 12-140E | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Micropipettor | Eppendorf |
References
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