Evaluere In Vitro DNA skade bruk av Comet analysen

Summary

Comet analysen er en effektiv måte å oppdage DNA skade inkludert single og double-strandet DNA bryter. Vi beskriver alkaliske og nøytrale comet analyser for å måle DNA skade i kreftcellene evaluere den terapeutiske effekten av kjemoterapi.

Abstract

DNA skade er et vanlig fenomen for hver celle i løpet av sin levetid, og er definert som endring den kjemiske strukturen til genomisk DNA. Kreft behandlinger, som radio- og kjemoterapi, introdusere enorm ytterligere DNA skade, fører til celle syklus arrestasjon og apoptose begrense kreft progresjon. Kvantitativ vurdering av DNA skade under eksperimentelle kreft terapi er et viktig skritt å rettferdiggjøre effektiviteten av en gentoksisk agent. I denne studien vi fokusere på en enkelt celle geleelektroforese analysen, også kjent som kometen analysen, som kan kvantifisere enkelt og dobbel-strand DNA bryter i vitro. Comet analysen er en DNA skade kvantifisering metode som er effektiv og enkel å utføre, og har lav tid/budsjett krav og høy reproduserbarhet. Her markere vi nytten av kometen analysen for en prekliniske studie ved å evaluere gentoksisk effekten av olaparib/temozolomide Kombinasjonsbehandling U251 glioma celler.

Introduction

Comet analysen ble først utviklet av Ostling og Johanson i 1984 ved å demonstrere migrering av DNA fragmenter fra atomkjerner under en nøytral betingelse¹. Teknikken ble senere utviklet av Singh et al., viser at en alkalisk tilstand vesentlig økt spesifisitet og reproduserbarhet analysen². Siden da nøytral comet analysen brukes hovedsakelig til å oppdage double-strandet DNA pauser, mens alkaliske comet analysen er mer følsomme for mindre mengde DNA-skader, inkludert single og double strand DNA bryter, lut-labil nettsteder, DNA-DNA eller DNA-protein cross-linking og DNA single-strand bryter forbundet med ufullstendig excision reparere nettsteder^3,4. Begge analyser tillate visualisering av fragmentert DNA, og gir en enkel måte å evaluere kvantitativt DNA skade. Comet analysen regnes som sensitive metode for i vitro og i vivo genetiske toksikologiske undersøkelser og gjelder for ulike forskningsfelt, som tidlig narkotika-kandidat valg, miljøovervåking, menneskelige biomonitoring, og grunnleggende forskning i DNA skade og reparere⁵.

Prinsippet om analysen er at under et elektrisk felt, fragmenterte DNA overfører ut av nucleoid kroppen (også kjent som “comet-hodet”) og danner en DNA flekk i agarose gel (også kjent som “comet-hale”). Med nukleotid flekker, kan omfanget av DNA skade kvantifiseres ved å analysere “comets” dannet av dette enkelt celle geleelektroforese. Beregning av halen kan videre hjelpe sammenligne DNA skade annerledes eksperimentell grupper. Sammenlignet med tradisjonelle metoder for DNA skade gjenkjenning, er comet analysen direkte, følsom, billig og relativt enkle.

Strålebehandling og chemotherapies er vanlige strategier for kreftbehandling ved å generere enkelt tråd og dobbel tråd DNA bryter i kromosomene⁶. Det nylige fremskrittet i DNA reparasjon hemmere gjør en mer effektiv gentoksisk effekten av kombinasjonen kjemoterapi, og derfor reduserer potensielt systemisk bivirkninger som anemi, infeksjoner og benmarg undertrykkelse^{7, 8}. i denne studien vi viste etterforskningen av en poly (ADP-ribose) utvalg (PARP) hemmer, olaparib (Ola)⁹. PARP er en rikelig kjernefysiske protein og er ansvarlig for DNA base excision reparasjon ved å danne en poly (ADP-ribose) polymer¹⁰. Temozolomide () er en muntlig tilgjengelig alkylating agent og har vært mye brukt for glioma pasient behandling. Ved hjelp av kometen analysen kvantifisere DNA skade, viser vi som kombinerer olaparib med temozolomide dypt øker DNA skade i glioma celler, noe som tyder på olaparib/temozolomide Kombinasjonsbehandling er en effektiv strategi å behandle glioma, som sammenlignet med temozolomide alene¹¹.

Protocol

1. klargjør reagenser 1 x PBS fortynne 100 mL 10 x PBS med 900 mL dH 2 O og justere pH 7,4 bruker en pH-meter. Butikken ved romtemperatur. Lysis løsning (LS) forberede 2,5 M NaCl, 100 mM disodium EDTA, 10 mM Tris base og 200 mM NaOH i 900 mL dH 2 O, tar det vanligvis ca 20 min å tillate blandingen til å fullstendig løse opp. Justere pH 10 med en pH-meter. Legge til 1% natrium lauryl sarcosinate og 1% Triton X-100,…

Representative Results

Nåværende protokollen beskriver en trinnvis arbeidsflyt for comet analysen gjennomføring og dataanalyse (figur 1). Resultatene fra alkaliske og nøytrale comet analyser viste at kometen hale doksorubicin-behandlet U251 celler (1 µM, 20 h) var lengre og hadde høyere DNA intensitet, antyder en betydelig akkumulering av fragmentert DNA på grunn av kjemoterapi (figur 2). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=…

Discussion

Comet analysen er et effektivt verktøy til å måle singel og dobbel-strand DNA pauser på cellenivå. Analysen er mye brukt som en “gyllen standard” i studier om gentoksisitet og biomonitoring¹³, alt fra grunnleggende lesjoner, DNA krysskoblinger, narkotika utvikling og alkali følsomme områder. I studien viste vi to forskjellige trinnvise protokoller for alkaliske og nøytrale comet analyser, henholdsvis. Kombinere enkelt celle geleelektroforese, fluorescerende mikroskopi og bilde tolkning, gi…

Materials

Reagents
10x PBS(Ca++, Mg++ free)	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma base	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
Sodium lauryl sarcosinate	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
Sodium acetate	Sigma	32318
Glacial acetic acid	Sigma	695092
Ammonium acetate	Sigma	A1542
SYBR Green	Invitrogen	S33102
Low melting point agarose	Invitrogen	16520
Agarose	Invitrogen	16500
95% ethanol	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
Trypsin	GIBICO	25300-054
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Glass tissue slides	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes	KIMberly-Clark
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	DENVILLE
Pipette Tips	SHARP
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Microwave	Avanti
Waterbath	PRECISION
Horizontal electrophoresis chamber	TREVIGEN	Cometassay ES II
Power supply	Bio-Rad
Incubator	Quincy Lab	Model 12-140E
Fluorescent microscope	Zeiss	LSM700
Micropipettor	Eppendorf