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Cancer Research

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

doi: 10.3791/56450 Published: October 11, 2017

Summary

O ensaio cometa é um método eficiente para detectar danos do DNA incluindo single e double-stranded DNA quebra. Descrevemos o cometa alcalino e neutro de ensaios para medir o dano de DNA em células cancerosas para avaliar o efeito terapêutico da quimioterapia.

Abstract

Dano do ADN é um fenômeno comum para cada célula durante sua vida útil e é definido como uma alteração da estrutura química do DNA genômico. Terapias de câncer, tais como o rádio e quimioterapia, apresentar a enorme quantidade de danos adicionais de DNA, levando à detenção do ciclo celular e apoptose para limitar a progressão do câncer. Avaliação quantitativa do dano do ADN durante a terapia de câncer experimental é um passo fundamental para justificar a eficácia de um agente genotóxico. Neste estudo, focamos em um ensaio de electroforese única célula, também conhecido como o ensaio cometa, que pode quantificar single e double-strand DNA quebras em vitro. O ensaio cometa é um método de quantificação de dano de DNA que é eficiente e fácil de executar, e tem exigências de tempo/orçamento baixas e alta reprodutibilidade. Aqui, destacamos o utilitário do ensaio cometa para estudos pré-clínicos, avaliando o efeito genotóxico de terapia de combinação olaparib/temozolomide U251 células de glioma.

Introduction

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O ensaio cometa foi primeiro desenvolvido por Ostling e Johanson, em 1984, demonstrando que a migração do DNA fragmentos dos núcleos sob uma condição neutra1. A técnica foi desenvolvida mais tarde por Singh et al, mostrando que uma condição alcalina aumentou substancialmente a especificidade e a reprodutibilidade do ensaio2. Desde então, o ensaio cometa neutro é usado principalmente para detectar quebras de DNA dupla-hélice, Considerando que o ensaio cometa alcalino é mais sensível para pequenas quantidades de dano do ADN, incluindo único e quebra de DNA de fita dupla, alcaloide-labile sites, DNA-DNA ou Cross-linking da ADN-proteína e quebras de single-strand DNA associadas com incompleta excisão reparar sites3,4. Ambos os ensaios permitem a visualização de DNA fragmentado e fornecem uma maneira simples de avaliar quantitativamente o dano do ADN. O ensaio cometa é considerado como um método sensível para os estudos toxicológicos in vitro e em vivo genéticos e é aplicável a áreas de investigação diferentes, tais como a seleção precoce de drogas-candidato, monitoramento ambiental, a biomonitorização humana, e fundamental Pesquisar no dano do ADN e reparar5.

O princípio do ensaio é que sob um campo elétrico, DNA fragmentado migra para fora do corpo do nucleoide (também conhecido como o "cabeça de cometa") e forma uma mancha de DNA no gel do agarose (também conhecido como a "cauda de cometa"). Com coloração de nucleótidos, a extensão dos danos do DNA pode ser quantificada pela análise "cometas", formados por electroforese esta única célula. Cálculo do momento de cauda mais pode ajudar a comparar o dano do ADN entre diferentes grupos experimentais. Em comparação com métodos tradicionais de detecção de danos do DNA, o ensaio cometa é direta, sensível, barata e relativamente simples.

Radioterapia e agentes quimioterápicos são estratégias comuns para o tratamento de câncer, gerando único filamento e quebras de DNA de fita dupla em cromossomos6. O avanço recente em inibidores de reparação do ADN permite um mais eficaz efeito genotóxico pela quimioterapia de combinação e, portanto, potencialmente reduz os efeitos secundários sistêmicos tais como anemia, infecção e medula óssea supressão7, 8. neste estudo, mostramos a investigação de um inibidor de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), olaparib (Ola)9. PARP é uma proteína nuclear abundante e é responsável pelo reparo de excisão de base de DNA, formando um polímero de poli (ADP-ribose)10. Temozolomide (TMZ) é um Agente alquilante disponível por via oral e tem sido amplamente utilizada para o tratamento do paciente de glioma. Usando o ensaio cometa para quantificar os danos do DNA, demonstramos que combina olaparib com temozolomide profundamente aumenta o dano de DNA em células de glioma, que sugere a terapia combinada de olaparib/temozolomide é uma estratégia eficaz para tratar de glioma, comparado com o temozolomide sozinho11.

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Protocol

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1. preparar reagentes

  1. 1X PBS
    1. diluir 100 mL x 10 PBS com 900 mL dH 2 O e ajustar o pH para 7,4 usando um medidor de pH. Armazenar em temperatura ambiente.
  2. Solução de lise (LS)
    1. preparar 2,5 M NaCl, EDTA dissódico de 100 mM, 10 mM Tris base e 200mm NaOH em 900 mL dH 2 O; comumente leva cerca de 20 min para permitir a mistura dissolver totalmente. Ajuste o pH a 10 usando um medidor de pH. Adicionar sarcosinate de Laurilsulfato de sódio 1% e 1% Triton X-100 e ajustar o volume final de 1.000 mL. Legal a 4 ° C, durante pelo menos 30 min antes do uso.
  3. Solução de eletroforese alcalina (AES), pH > 13
    1. preparar dissódico NaOH e 1 mM 200 mM EDTA em 800 mL dH 2 O. ajustar o pH e certifique-se que é pH > 13. Ajuste o volume final de 1.000 mL. Fazer fresco antes do utilizar e refrigerar a 4 ° C, durante pelo menos 30 min antes do uso.
  4. Sollution electroforese neutro (NES)
    1. preparar 1.000 mL de tampão de eletroforese neutro misturando 100 mM Tris base e 300mm de acetato de sódio para 1.000 mL dH 2 O. ajustar o pH a 9.0 com ácido acético glacial. Legal a 4 ° C, durante pelo menos 30 min antes do uso.
  5. Solução de precipitação de DNA (DPS)
    1. preparação de ações de acetato de amónio de 7,5 M 10 mL. Para 50 mL de solução de precipitação de DNA, mistura de acetato de amónio 6,7 mL 7,5 M com 43,3 mL de etanol 95%. Armazenar em temperatura ambiente.
  6. Solução de coloração
    1. Adicionar 1 µ l 10.000 x mancha verde fluorescente de ácidos nucleicos (por exemplo, SYBR Green) em tampão de 30 mL de Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, EDTA dissódico de 1 mM, pH 7,4) e loja em 4 ° C. proteger da luz.
  7. 1% baixa fusão agarose
    1. derreter 1% baixa fusão ponto agarose (1 g em 100 mL dH 2 O) no microondas. Agite a agarose cada 15-20 s para certificar-se que a agarose é completamente derretido. Coloque o agarose em banho de água a 37 ° C pelo menos 20 min antes do uso.
  8. Pontas de pipetas pre-quente
    1. cortar as extremidades estreitas de pontas de pipetas P200 por 3 mm e quente a 37 ° C antes de pipetagem agarose.

2. Preparar os Slides cometa

  1. , deslize o revestimento
    1. Melt agarose a 1% (1 g em 100 mL dH 2 O) no microondas durante 2-3 minutos ou até que a agarose é completamente derretido. Mergulhar as vidro corrediças do microscópio para a agarose e limpar um lado da lâmina utilizando um cotão.
    2. Colocar os slides sobre uma superfície plana para secar ao ar livre ou aqueça a 50 ° C para secagem mais rápida; um filme de agarose transparente deve ser formado após a secagem. Coloque as lâminas revestidas em 37 ° C antes do uso.
  2. Preparação de suspensões celulares único
    1. cultura e tratar as células de glioma
      1. cultura as células U251 MG em meio DMEM-Ham F-12 suplementado com 10% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 10 de µ g/mL em 37 & # 176; C com 5% de CO 2.
      2. Digerir as células usando a tripsina 1 mL por 3 min e neutralizar a tripsina usando meio DMEM-Ham F-12 com FBS. Coletar em tubo de 15 mL, giram a 300 x g, durante 4 min, Aspire o meio e suspender as células em 2 x 10 5 células/mL de 1X PBS.
        Nota: A amostra de célula deve ser preparada imediatamente antes de iniciar o ensaio e todas as amostras devem ser manuseadas em um ambiente escuro ou esmaecido para evitar danos no DNA da luz.
      3. Combinar a suspensão de células com agarose a 1% derretido baixo ponto de fusão (a 37 ° C) na proporção de 01:10 (v/v), misture suavemente pipetando para cima e para baixo e imediatamente distribuir 30 µ l de uma lâmina. Use o lado da ponta da pipeta para espalhar a mistura para garantir a formação de uma camada fina de agarose/célula.
      4. Coloque a corrediça plana a 4 ° C, no escuro por 10 min., aumentando o tempo de coagulação para 30 min melhora a aderência das amostras em ambientes de alta umidade.
      5. Imergir o slide em 4 ° C LS no escuro por 1h durante a noite.

3. Única célula eletroforese

  1. prosseguir com alcalino (passo 3.2) ou cometa neutro (passo 3.3) do ensaio
  2. para ensaio cometa alcalina
    1. gentilmente remover slides de LS, escorra o excesso reserva e delicadamente mergulhe na AES por 1h no 4 ° C para permitir o desenrolar de DNA. Manter os slides no escuro.
    2. Adicionar pre-refrigerados AES na bandeja de slide de electroforese, não deve exceder 0,5 cm acima os slides (isso depende do tamanho das unidades de eletroforese), coloque os slides dentro e cubra com uma tampa. Definir a tensão de alimentação para 1 V/cm (o comprimento entre os eletrodos) e executada por 30 min em 4 ° C.
    3. Solução de electroforese em excesso de dreno de slide. Mergulhe delicadamente slides duas vezes na dH 2 O por 5 min à temperatura ambiente.
    4. Delicadamente mergulhe slides em etanol a 70% por 5 min à temperatura ambiente. Avance para o passo 4.
  3. Para ensaio cometa neutro
    1. Remover suavemente os slides de LS, escorra o excesso tampão e delicadamente mergulhe no NES por 30 min em 4 ° ° C. conservar o slide no escuro.
    2. Tampão de eletroforese neutro previamente refrigerados
    3. Add na bandeja de slide de electroforese, não deve exceder 0,5 cm acima slides (isso depende do tamanho das unidades de eletroforese), coloque os slides dentro e cubra com uma tampa. Definir a tensão de alimentação para 1 V/cm (o comprimento entre os eletrodos) e executada por 45 min em 4 ° C.
    4. Buffer excesso de drenagem das lâminas de. Mergulhe delicadamente slides em DPS por 30 min à temperatura ambiente.
    5. Delicadamente mergulhe os slides em etanol a 70% durante 30 min à temperatura ambiente. Avance para o passo 4.

4. Mancha de Slides cometa

  1. seco slides a 37 ° C por 10-15 min no escuro.
  2. Lugar 50-100 µ l verde fluorescente ácido nucleico manchando a solução em cada secas agarose e mancha durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
  3. Lavar os slides brevemente em dH 2 O e secar completamente a 37 ° C, no escuro. Proceder à análise e aquisição de imagens.

5. Aquisição e análise de imagens

Nota: A visualização e a quantificação de quebras de DNA baseiam-se na microscopia de epifluorescência e o software do ensaio cometa (ver Tabela de materiais) 12 .

  1. Coloque os slides sobre o microscópio com um suporte de slide. Certifique-se que o gel de agarose é voltado para a lente objetiva. Aleatoriamente, capturam imagens de slides cometa manchada usando um microscópio de fluorescência com uma lente objetiva de 10x. Evitar as bordas e as áreas ao redor de quaisquer bolhas de ar.
  2. , Certifique-se de cada cauda de cometa é distribuída horizontalmente. Cabeças de cometa devem se originam da esquerda e a cauda da direita.
  3. Salvar cada imagem em um formato binário de TIF com mancha brilhante de DNA e fundo escuro. Carregar imagens para o software usando o " selecione arquivos para analisar " botão, que está localizado no lado esquerdo da barra de ferramentas. Uma janela de exibição de imagem deve aparecer ( Figura 1).
  4. Desenhar um quadro de medição na tela e ajustar seu tamanho em conformidade com o cometa da célula. Clique o " ajustar " o botão para configurar o limite da cabeça, cometa, cauda de acordo com a imagem e, em seguida, clique o " começar as medições " botão ( Figura 1).
  5. , Selecione uma célula usando o frame e ativar a medição clicando com o mouse sobre o " do ensaio cometa " botão; uma intensidade imagem aparece no " perfis " janela com os parâmetros de medição selecionado. Os resultados podem ser salvos clicando o " armazenar resultado " botão ( Figura 1).
    Nota: O software calcula os parâmetros, incluindo o comprimento da cauda de cometa, a porcentagem de DNA cauda, o momento de cauda (TM) e o momento de cauda verde-oliva (OTM). Os momentos de cauda são calculados por fórmulas como segue:
    Equation 1
    Equation 2
  6. analisar pelo menos 50 células por tratamento.

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Representative Results

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O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho passo a passo para a execução do ensaio cometa e análise de dados (Figura 1). Resultados de ensaios os cometa alcalino e neutro, mostrou que a cauda do cometa de células U251 tratados com doxorrubicina (1 µM, 20 h) era maior e tinha maior intensidade de DNA, sugerindo um acúmulo substancial de DNA fragmentado devido à quimioterapia (Figura 2).

Análise quantitativa para ambos o ensaio cometa alcalino ou neutro mostrou formação de cauda cometa significativamente aumentada após o tratamento de doxorrubicina (Figura 3A) indicando dano do ADN. Os resultados são apresentados como média ± SEM e t-testes foram usados para comparações estatísticas. Quantificação do momento cauda de ambos os ensaios confirmou o aumento do momento de cauda média: para o ensaio cometa alcalina, 0.134 ± 0.0448 (n = 52) vs 13.84 ± 1.325 (n = 51), p < 0,01; Para o ensaio cometa neutro, 0.596 ± 0.06668 (n = 78) vs 9.979 ± 0.658 (n = 51), p < 0,01. Estes dados fornecem um índice quantificável para avaliar os danos do DNA. Além disso, o tratamento de combinação de olaparib de inibidor PARP e temozolomide significativamente reforçada dano de ADN em células de glioma (Figura 3), com um aumento do comprimento e da intensidade do sinal da cauda do cometa. Olaparib sozinho não apresentou danos do DNA, Considerando que é potencializado o efeito genotóxico do temozolomide agente de quimioterapia (DMSO, 0.9836 ± 0.3377 (n = 64); Olaparib, 0.6663 ± 0.2325 (n = 51); TMZ, 6.197 ± 0.572 (n = 51); Olaparib + TMZ, 44.04 ± 1.269(n = 115), p < 0,01).

Figure 1
Figura 1 : Guia passo a passo da análise da imagem usando o software do ensaio cometa. Software (A), a barra de ferramentas do ensaio cometa. Ensaio de cometa alcalina (B) como um exemplo: a interface do usuário do software de ensaio cometa consiste em um modo de exibição de imagem, perfil de intensidade e janela de aquisição de dados. (C) a imagem de fundo, região de cometa e cabeça do cometa foram definidas no software. (D) a intensidade de perfis da cabeça do cometa (vermelho) e cauda (verde) são plotados, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Imagens representativas dos ensaios alcalino e neutro cometa. Células de glioma U251 foram tratadas com doxorrubicina e investigado pela alcalinos (painéis superiores) e cometa neutro (painéis inferiores) ensaios (barra de escala = 10 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Dados representativos do cometa cauda momento. Plotagem de dados do ensaio cometa alcalina (A). p < 0,01. Plotagem de dados do ensaio cometa neutro (B). p < 0,01. (C) análise de ensaio cometa revelou o efeito sinérgico da terapia combinada incluindo temozolomide (TMZ) e olaparib (Ola). p < 0,01. (D) imagens representativas de células de glioma sob tratamento de combinação de temozolomide e olaparib (barra de escala = 10 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O ensaio cometa é uma ferramenta eficiente para medir intervalos de single e double-strand DNA a nível celular. O ensaio foi amplamente aplicado como um "padrão ouro" em estudos sobre a genotoxicidade e biomonitorização13, variando de ligações cruzadas base lesões, DNA, desenvolvimento de drogas e locais sensíveis do alcaloide. No presente estudo, mostramos dois protocolos distintos de passo a passo para ensaios de cometa alcalino e neutro, respectivamente. Combinando a electroforese única célula, microscopia fluorescente e interpretação de imagem, ambos os ensaios de cometa alcalino e neutro fornecem abordagens quantitativas para avaliar a extensão do DNA danos em vitro.

Diversas etapas-chave são essenciais para a execução bem-sucedida do ensaio cometa. Por exemplo, deve-se ter cuidado nas etapas de preparação dos reagentes. Cada solução deve ser recentemente preparada e mantida à temperatura apropriada durante pelo menos 30 minutos antes do uso, para evitar danos ao DNA endógeno ou reparar durante a preparação da amostra. Mais um passo vital é a preparação da suspensão de célula única viável. É importante manter o agarose a 37 ° C antes do uso, para maximizar a sobrevivência da pilha durante a preparação dos slides cometa. A suspensão de célula/agarose deve ser preparada imediatamente antes de iniciar o ensaio. Usando o lado das pontas de pipetas para espalhar a suspensão celular/agarose ajuda a atingir uma camada fina de agarose nos slides, para que a maioria das células pode ser posicionada no mesmo plano focal durante a microscopia. Opcionalmente, arranhe as bordas dos slides usando uma caneta com ponta de diamante para melhorar a fixação de agarose.

Apesar das vantagens do ensaio cometa, existem várias limitações deste método tradicional de14,15. Por exemplo, a taxa de transferência do ensaio cometa é limitada pelo processo de preparação de slides o vidro. Em algumas ocasiões, uma lâmina de vidro de oito-jorrava fornece uma solução para melhorar o throughput de ensaio. Outra limitação é que o ensaio cometa simplesmente representa a relação entre o DNA fragmentado nas células. Informações adicionais de apoia é necessária para descrever completamente as alterações celulares, além de danos no DNA. Nesse caso, análise de apoptose, γH2A.X coloração e immunoblotting poderiam ser muito útil para fornecer uma análise minuciosa dos diferentes aspectos para revelar o efeito do DNA de agentes nocivos.

Existem inúmeros softwares para análise de imagem do cometa e a saída inclui uma variedade de parâmetros diferentes. Os parâmetros mais comumente usados são o comprimento da cauda, a porcentagem de DNA na cauda e o momento de cauda. Comprimento da cauda só pode ser usado em baixos níveis de dano do ADN, desde que não tende a mudar uma vez que a cauda é estabelecido14. Posteriormente, a intensidade da cauda aumenta à medida que o dano é reforçado. A porcentagem de DNA na cauda do cometa é outro parâmetro útil, como está relacionada linearmente com a frequência de quebra. O momento de cauda combina comprimento da cauda e intensidade de cauda em um único valor, portanto, é o parâmetro mais úteis e usado com frequência.

O ensaio cometa foi amplamente aplicado em testes de genotoxicidade e biomonitorização humana. Com o desenvolvimento de inibidores de enzima de reparo de DNA, o ensaio cometa poderia uma ferramenta valiosa para testar terapias de combinação que melhoram os resultados da quimioterapia tradicional.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa Intramural do NIH, ICN e CCR. Todos os autores receberam Intramural bolsa de pesquisa de NIH, ICN e CCR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
10x PBS(Ca++, Mg++ free) TEKnova P0196
NaCl Sigma S5886
EDTA TEKnova E0308
Trizma base Sigma T1503
NaOH Sigma 72068
Sodium lauryl sarcosinate Sigma L7414
Triton X-100 Sigma 93443
Sodium acetate Sigma 32318
Glacial acetic acid Sigma 695092
Ammonium acetate Sigma A1542
SYBR Green Invitrogen S33102
Low melting point agarose Invitrogen 16520
Agarose Invitrogen 16500
95% ethanol WARNER-GRAHAM #64-17-5
Trypsin GIBICO 25300-054
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Glass tissue slides ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 63422-11
Kimwipes KIMberly-Clark
1.5 mL Microcentrifuge Tubes DENVILLE
Pipette Tips SHARP
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Microwave Avanti
Waterbath PRECISION
Horizontal electrophoresis chamber TREVIGEN Cometassay ES II
Power supply Bio-Rad
Incubator Quincy Lab Model 12-140E
Fluorescent microscope Zeiss LSM700
Micropipettor Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123, (1), 291-298 (1984).
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Avaliação <em>In Vitro</em> o dano de DNA usando ensaio cometa
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Cite this Article

Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay. J. Vis. Exp. (128), e56450, doi:10.3791/56450 (2017).More

Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay. J. Vis. Exp. (128), e56450, doi:10.3791/56450 (2017).

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