Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering

Published: November 15, 2017 doi: 10.3791/56474
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 1, 1, 2, 1,2
1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

Summary

Vi præsenterer en protokol for at nøjagtigt kvantificere proteiner med Isobar mærkning, omfattende fraktionering, bioinformatik værktøjer og kvalitetskontrol trin i kombination med væskekromatografi interface til en høj opløsning massespektrometer.

Abstract

Mange ekstraordinære fremskridt er blevet gjort i massespektrometri (MS)-baseret proteomics, med særlige tekniske fremskridt i væskekromatografi (LC) koblet til tandem massespektrometri (LC-MS/MS) og Isobar mærkning multiplexing kapacitet. Her introducerer vi en dyb-proteomics profilering protokol, der kombinerer 10-plex tandem masse tag (TMT) mærkning med en omfattende LC/LC-MS/MS platform, og efter MS beregningsmæssige indblanding korrektion til nøjagtigt kvantificere hele proteomes. Denne protokol omfatter følgende hovedtrin: protein udvinding og fordøjelse, TMT mærkning, 2-dimensionelle (2D) LC, høj opløsning massespektrometri og beregningsmæssige databehandling. Kvalitetskontrol trin er inkluderet for fejlfinding og evaluere eksperimentel variation. Mere end 10.000 proteiner i pattedyr prøver kan trygt quantitated med denne protokol. Denne protokol kan også anvendes til kvantitering af indlæg translationel ændringer med mindre ændringer. Denne multiplex, robust metode giver et stærkt værktøj for proteom analyse i en lang række komplekse prøver, herunder cellekultur, animalsk væv og humane kliniske prøver.

Introduction

Næste generation sequencing teknologiske fremskridt har ført til en ny landskab for at studere biologiske systemer og sygdom hos mennesker. Dette har tilladt et stort antal målinger af genomet, transkriptom, proteom, metabolome og andre molekylære systemer til at blive konkret. Massespektrometri (MS) er en af de mest følsomme metoder i analytisk kemi, og dens anvendelse i proteomics vokset hurtigt efter sekvenseringen af det menneskelige genom. I feltet proteomics har de sidste par år givet store tekniske fremskridt i MS-baserede kvantitative analyser, herunder Isobar mærkning og multiplexing evne kombineret med omfattende væskekromatografi ud over instrumentering forskud, giver mulighed for hurtigere og mere præcise målinger med mindre prøvemateriale kræves. Kvantitative proteomics er blevet et mainstream tilgang til profilering titusinder af proteiner og posttranslationelle modifikationer i meget komplicerede biologiske prøver1,2,3,4 , 5 , 6.

Multiplex Isobar mærkning metoder såsom Isobar tag til relative og absolutte kvantitering (dvs, iTRAQ) og tandem masse tag (TMT) MS har stærkt forbedret prøve overførselshastighed og øget antallet af prøver, der kan analyseres i en enkelt eksperiment1,6,7,8. Sammen med andre MS-baserede kvantitering metoder, såsom etiket-fri kvantitering og stabil isotop mærkning med aminosyrer i cellekultur (dvs.SILAC), potentialet i disse teknikker i proteomics er felt betydelig9 ,10,11. For eksempel, tillader TMT metode 10 protein prøver der skal analyseres sammen i 1 eksperiment ved hjælp af 10-plex reagenser. Disse strukturelt identisk TMT tags har den samme samlede masse, men tunge isotoper er varierende fordelt på kulstof eller kvælstof atomer, hvilket resulterer i en unik reporter ion under MS/MS fragmentering af hvert tag, hvorved relative kvantitering mellem de 10 prøver. TMT strategi anvendes rutinemæssigt for at studere biologiske veje, sygdomsprogression og cellulære processer12,13,14.

Betydelige tekniske forbedringer har forbedret væskekromatografi (LC)-MS/MS systemer, både hvad angår LC separationer og MS parametre, at maksimere protein identifikation uden at ofre kvantitering nøjagtighed. Første-dimension adskillelse af peptider ved en adskillelse teknik med høj orthogonality til den anden dimension er afgørende i denne type af shotgun proteomics metode til at opnå maksimal resultater20. Høj pH omvendt-fase væskekromatografi (RPLC) giver bedre ydeevne end konventionelle stærk kationbytter kromatografi20. Når høj pH RPLC kombineres med en anden dimension af lav-pH RPLC, både analytisk dynamikområde og protein dækning er forbedret, hvilket resulterer i evnen til at identificere hovedparten af udtrykte proteiner, når du udfører hele-proteomet analyser15 ,16,17,18. Andre tekniske fremskridt omfatter små C18 partikler (1.9 µm) og udvidet lang kolonne (~ 1 m)19. Desuden, andre bemærkelsesværdige forbedringer inkluderer nye versioner af massespektrometre med hurtig scanning satser, forbedret følsomhed og opløsning20og sofistikeret Bioinformatik rørledninger til MS data mining21.

Her beskriver vi en detaljeret protokol, der inkorporerer de nyeste metoder med ændringer til at forbedre både følsomhed og overførselshastighed, mens fokus på kvalitetskontrol mekanismer under hele forsøget. Protokollen indeholder protein udvinding og fordøjelse, TMT 10-plex mærkning, grundlæggende pH og syre pH RPLC fraktionering, høj opløsning MS påvisning og MS databehandling (figur 1). Derudover gennemfører vi flere kvalitetskontrol trin til fejlfinding og evaluere eksperimentel variation. Denne detaljerede protokollen er beregnet til at hjælpe forskerne nye til feltet rutinemæssigt identificere og nøjagtigt kvantificere tusindvis af proteiner fra en lysate eller væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

forsigtighed: kontakt alle relevante sikkerhedsdatablade (dvs., muskel-og Skeletbesvær) før brug. Brug venligst alle relevante sikkerhedspraksis, når du udfører denne protokol.

Bemærk: en TMT 10-plex Isobar etiket reagens sæt bruges i denne protokol for proteomet kvantitering af 10 prøver.

1. forberedelse af celler/væv

NOTE: det er afgørende at indsamle prøver i minimal tid ved lav temperatur til at holde proteiner i deres oprindelige biologiske tilstand.

  1. Vask vedhængende celler (fx, HEK 293 celler) på en 10 cm plade to gange med 10 mL af is kold fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Skrabe og indsamle celler (~ 2 x 10 6 celler) i 1 mL PBS. Overføres til 1,5 mL rør og PBS efter centrifugering ved 600 x g i 5 min. ved 4 ° C. Store celle pellets ved-80 ° C indtil lysering.
    Bemærk: Et pilotprojekt er ofte udføres for at undersøge protein udbytte. Ca 1 mg af proteiner kan udvindes fra 10 x 10 6 pattedyrsceller eller fra en 15 cm plade med 80% sammenløbet.
  2. Lyse Alternativt, vedhængende celler på deres tallerken ved at tilføje lysisbuffer direkte til pladen efter vask. Saml lysates i 1,5 mL rør og bruge protokollen beskrivelsen i trin 2.5.
  3. Indsamle suspension celler i 15 mL rør, vaskes to gange med 10 mL af is kold PBS, overføre til 1,5 mL rør, og der centrifugeres ved 600 x g fjerne PBS. Fjerne PBS fra wash skridt helt til at opretholde den ønskede koncentration af lysis buffer ingredienser. Gemme celle pellets ved-80 ° C indtil lysering.
  4. Indsamle og vejer væv hurtigt. Holde væv i flydende nitrogen umiddelbart efter dissektion og butik på-80 ° C.
    Bemærk: Protein udbyttet af væv er ca 5-10% af væv vægt
  5. bruge homogent væv størrelser og anatomiske områder for de 10 prøver for at reducere prøve heterogenitet. Fjerne blod forurening ved at skylle prøver to gange med 1 mL af is kold PBS til at undgå meget rigelige blodproteiner påvirker protein kvantitering og downstream dataanalyse.

2. Protein udvinding, kvalitetskontrol Western Blotting, i løsning fordøjelse og peptid afsaltning

Bemærk: håndtering af hver af 10 prøver på samme måde under ethvert skridt, før en sammenlægning af TMT-mærket prøver er vigtigt at reducere variation.

  1. Gøre lysisbuffer (50 mM HEPES [pH 8,5], 8 M urinstof, og 0,5% natrium deoxycholate) dagen af forsøget.
    Bemærk: Delvis protein denaturering under prøven lysis påvirker protein fordøjelse effektivitet.
  2. Tilføj lysis buffer således at forholdet mellem buffer til at sample volumen er 10:1 og ~ 20% af den endelige mængden af glasperler (0,5 mm diameter) celle pellets eller væv (f.eks, 10: 1 volumen forholdet mellem buffer og prøver) at opnå en endelig proteinkoncentration 5 til 10 mg/mL. Holde alle 10 prøver den samme koncentration af i betragtning af antallet af celler eller væv vægten af hver prøve.
  3. Vedligehold urinstof koncentration på 8 M ved at tilføje fast urea til prøven. Husk at overveje mængden af celle pellet eller væv, når beregningen af fast urea tilføjes at prøve at opnå 8 M koncentration.
    Bemærk: Un-frisk urinstof buffer kan indføre kunstige kemiske modifikation (dvs., protein carbamylation) og negativt påvirker antallet af peptider identificeret. Urinstof indtager en betydelig volumen (100 mg urinstofnitrogen indtager ~ 73 µL i løsning).
  4. Holde den uopløselige snavs i den lysate at tillade fordøjelsen af uopløselige proteiner 23.
  5. Lyse prøver i en blender ved 4 ° C ved hastighed 8 til 30 s, hvile i 5 s, og Gentag 5 gange eller indtil prøverne er homogeniseret. Prøverne kan også være mængden af vortexing for 30 s ved stuetemperatur (RT) med en 30 s afkøling periode på isen for ~ 10 cyklusser. Justere lysis betingelser som nødvendige, afhængigt af hvilken prøve.
  6. Bland lysate godt uden centrifugering og gøre 2 små prøver (~ 15 µL). Brug 1 delprøve til foranstaltning proteinkoncentration og 1 delprøve skal udføres validering af positiv kontrol ved at udføre western blot analyse. Holde de resterende store delprøve til analysen af proteomics.
  7. Foranstaltning proteinkoncentration ved en standard protein kvantitering assay eller ved en Coomassie farvede kort sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gel (10%) 22 med bovint serumalbumin (BSA) som standard. Bruge en BSA standard med en høj grad af kendt koncentration nøjagtighed. For at opnå den højeste grad af nøjagtighed, udføre aminosyre analyse af standarden, BSA.
    Bemærk: Andre præcise standarder kan være tilgængelige. Protein koncentrationer kan også estimeres ved celle numre eller væv vægte. Selvom 1 mg protein (100 µg/eksempel) anbefales, analysen kan udføres med så lidt som 100 µg protein (10 µg/prøve).
  8. Tilføj 100% acetonitril (ACN) at opnå en endelig koncentration på 10% ACN og LysC protease på en enzym-substrat ratio på 1: 100 (w/w) til at fordøje proteiner under stærkt denatureringen betingelser på RT for 2 h 1. Tilføje dithiothreitol (DTT) til en endelig koncentration på 1 mM til at reducere disulfid obligationer i proteiner og inkuberes i 1 h. udføre LysC fordøjelse i en endelig koncentration på 7,2 M urinstof.
  9. Fortyndes prøver til 2 M urinstof med 50 mM HEPES (pH 8,5) og yderligere udtog prøver med trypsin på RT for 3 h eller natten på en trypsin at protein-forhold på 1:50 (w/w). Brug cirka 2 µg af trypsin for 100 µg af protein og en trypsin koncentration af ca. 10 ng/µL.
    Bemærk: Faktorer, der kan føre til ineffektive trypsin fordøjelsen er pH problemer, inaktive trypsin eller brugen af en upassende forholdet mellem enzym til bærematerialet.
  10. Tilføje DTT at give 1 mM og yderligere reducere peptider for 2 h på RT.
  11. Tilføj iodoacetamide (IAA) at opnå 10 mM. Der inkuberes ved RT i 30 min. i mørke til alkylatbenzin Cys-indeholder peptider.
  12. Dæmpning af ureageret IAA ved at tilføje DTT for at opnå 30 mM og Inkuber i 30 min. ved RT.
  13. Kontrollere effektiviteten af trypsin fordøjelsen ved at undersøge en lille alikvot af hver prøve. Desalt ved hjælp af en 10 µL pipette tip med kromatografi media indlejret i det døde rum, ifølge producenten ' s protokol. Analysere hver prøve af LC-MS/MS. LC-MS/MS parametre er den samme som i trin 5, med den undtagelse, at gradueringen er 10 min 23.
  14. Udføre en databasesøgning efter MS rå data (se nærmere i trin 6) ved hjælp af 4 ubesvarede splittelser som en søgeparameter.
    Bemærk: Hvis antallet af savnede splittelser er > 10%, kan det tyde ufuldstændige trypsin fordøjelsen. Dette vil negativt påvirke downstream resultater. Dette er en kritisk kvalitetskontrol (QC) trin.
  15. Fordøje prøver igen, hvis de ubesvarede kavalergang er > 10% ved at tilføje en ekstra 10 µL af trypsin at prøverne.
  16. Surt prøverne ved at tilføje trifluoreddikesyre (TFA) at opnå 1% koncentration. Måle pH-værdien ved at bruge en pH strimmel. Kontroller, at pH er betmellem 2 og 3. Tilføje flere TFA drop kloge (1 µL) efter behov indtil den korrekte pH opnås.
  17. Centrifugeres ved 20.000 x g på RT i 10 min og indsamle supernatanten.
  18. Vaske 0,5 til 60 µg kapacitet spin kolonner, der indeholder C18 omvendt-fase harpiks med 0,25 mL methanol, hvis bruger 100 µg prøver. Vaske 0,03-30 µg kapacitet spin kolonner med 0,25 mL 60% ACN/0.1% TFA hvis bruger 10 µg prøver. Centrifugeres spin kolonner på 500 x g for 30 s.
  19. Reagensglasset kolonner med 0,5 mL af 0,1% TFA og fjerne ved centrifugering ved 500 x g i 30 s.
  20. Indlæses prøver på kolonner og binde prøver til kolonner ved centrifugering ved 100 x g i 3 min, eller indtil alle prøven har passeret gennem kolonnen.
  21. Tilsættes 0,5 mL af 0,1% TFA til kolonner, og der centrifugeres 500 g ved x for 30 s.
  22. Tilføje 125 µL af 60% ACN/0.1% TFA til hver kolonne og elueres ved centrifugering ved 100 x g i 3 min. sikre alle løsning har passeret gennem kolonnen.
  23. Tør Elueringsvæskerne i et vakuum koncentrator. Sikre, at prøverne er helt tørre og ikke flydende resterne i rør. Opbevares ved-80 ° C indtil videre analyse.

3. TMT mærkning af peptider

NOTE: det er afgørende at sikre, at alle prøver er fuldt mærket af TMT reagenser. Flere faktorer (f.eks. mængden af TMT reagenser, pH-værdi og nøjagtigheden af protein kvantitering) kan påvirke TMT mærkning effektivitet, som vil have en negativ ændre alle downstream resultater.

  1. Rekonstruere hver afsaltes peptid prøven i 50 µL af 50 mM HEPES buffer (pH 8,5). Kontrollere pH og sikre, at det er mellem 7 og 8.
    Bemærk: Prøven kan være surt hvis ikke tørrede helt efter trinnet udvanding, som vil påvirke den mærkning effektivitet.
  2. Holde ~ 1 µg for hver umærkede prøve for en efterfølgende TMT mærkning effektivitet test, som beskrevet i trin 3.3.
  3. Opløses TMT reagenser i vandfri ACN og mærke peptid prøver ved at følge fabrikantens ' s instruktioner. Inkuber reagenser på RT for 1 h.
  4. Udføre en QC TMT mærkning effektivitet test ved udvanding ~ 1 µg hver TMT-mærket og -umærket prøve ved hjælp af 10 µL pipette tips med integrerede kromatografi medier ifølge producenten ' s protokol. Analysere TMT-mærket og umærket prøver af LC-MS/MS.
    Bemærk: LC-MS/MS parametre er den samme som i afsnit 5, med den undtagelse, at gradueringen er 10 min.
  5. Undersøge de rå data for at sikre, at ikke-navngivet peptider ikke registreres i mærket prøverne, komplet mærkning effektivitet ( figur 2). Gør det til 6-10 særskilt peptider til at kontrollere den mærkning effektivitet.
  6. Dæmpning reaktion ved at tilføje 4 µL af 5% hydroxylamin og Inkuber i 15 min.
  7. Blandes en lille og lige volumen (2 µL) delprøve af hver prøve, TMT-mærket. Desalt ved hjælp af 10 µL pipette tips med integrerede kromatografi medier. Analysere prøver af LC-MS/MS, som beskrevet i trin 3.4. Bruge programmet hoppe software (en open-source database søgealgoritme, der konverterer tandem MS rå filer til en liste af peptider og proteiner) til at bestemme relative koncentrationsgrad af alle 10 prøver af TMT tag intensiteter af alle identificeret peptider.
    Bemærk: Denne QC premix ratio test er nyttige til at bestemme den korrekte ratio for lige blande før den endelige samle, som pipettering fejl kan forekomme, der vil ændre koncentrationer og protein kvantitering trin muligvis ikke altid nøjagtig. Det er også den bedste måde at sikre, at mængden af hver af de 10 prøver anvendes til den endelige mix er alle på en lige forhold, som beskrevet i trin 3.5.
  8. Gentag så mange gange som nødvendigt for at opnå en 1:1 ratio på tværs af alle 10 prøver.
  9. Lige så Bland de 10 prøveeksemplarer efter resultaterne af premix ratio test. Brug eksemplet med den laveste koncentration som baseline til at justere mængderne af de andre 9 prøver.
  10. Fjerne biprodukter af poolede TMT-mærket prøven quenching reaktion ved udblødning.
  11. Vask 1 mL fast-fase udvinding patroner indeholdende 50 mg sorptionsmiddel pr. kolonne med 1 mL/0,25 mL methanol, hvis bruger 100 µg prøver. Vaske 0,5 til 60 µg kapacitet C18 spin kolonner med 1 mL/0,25 mL 60% ACN/0.1% TFA hvis bruger 10 µg prøver. Centrifugeres kolonner på 500 x g for 30 s.
  12. Reagensglasset kolonner med 0,5 mL af 0,1% TFA og fjerne ved centrifugering ved 500 x g i 30 s.
  13. Indlæses prøver på kolonner og binde ved centrifugering ved 100 x g i 3 min, eller indtil alle i stikprøven har bestået gennem kolonnen.
  14. Tilsættes 0,5 mL af 0,1% TFA til kolonner, og der centrifugeres 500 g ved x for 30 s.
  15. Tilføje 125 µL af 60% ACN/0.1% TFA til hver kolonne og elueres ved centrifugering ved 100 x g i 3 min. sikre alle af løsningen har passeret gennem kolonnen.
  16. Tør Elueringsvæskerne i et vakuum koncentrator. Sikre, at prøverne er helt tørre og ikke flydende resterne i rør. Opbevares ved-80 ° C indtil videre analyse.

4. Omfattende høj opløsning, grundlæggende pH LC Prefractionation

  1. sæt 2 forbundne C18 kolonner, der indeholder bro ethylen hybrid partikler (4,6 mm x 25 cm, sammentælling 50 cm, 3,5 µm partikelstørrelse) og brug en microliter flow high-performance LC pumpe til fraktionering.
    Bemærk: Brug af 2 kolonner øger peptid belastning og forbedrer ikke nødvendigvis kromatografi. For prøver indeholdende ≤ 200 µg af peptider, 1 kolonne er tilstrækkelig.
  2. Vaske 100 µL loop med senere tillæg af 300 µL af methanol, vand og buffer A (10 mM ammonium formate, pH 8,0).
  3. Kolonnerne udvaskes med 100 µL af lige så blandet isopropanol, methanol, ACN, og vand og Blandingen henstår kolonnen i 95% buffer A for 2 h.
  4. Solubilize den afsaltede poolede TMT-mærket peptid prøve i 65 µL af buffer A. Kontroller at prøve pH er ~ 8.0. Hvis stadig Sure, bruge ammoniumhydroxid til at justere pH 8,0.
  5. Fractionate prøve ved hjælp af de følgende forløb med buffer B (buffer et plus 90% ACN): 15-20% for 15 min, 20% til 35% for 100 min og 35-50% i 30 min. sæt brøkdel collector at indsamle fraktioner hver 2 min herunder loading tid. Indstil flowet til 0,4 mL/min. Se reference 29 og figur 1 for en repræsentativ kromatogram.
  6. Indsamle ialt 80 fraktioner og tørre 40 fraktioner (hver anden fraktion) med en vakuum koncentrator til fuldstændig tørhed.
  7. Bruger de 40 tørrede prøver for LC-MS/MS analyse.
  8. Analysere alle 80 fraktioner af LC-MS/MS at opnå ultra-dybe proteomet dækning.

5. LC-MS/MS forberedelse og parametre

NOTE: I TMT-baserede kvantitering, peptid ioner er Isobar og vises som 1 massen i en MS1 scanning. Dog er de quantitated ifølge intensiteten af reporter ioner (10 unikke reporter ioner) i MS/MS scanning efter peptid ion har været splittet med højere energi kollision dissociation (HCD). TMT reporter ion nøgletal kan undertrykkes fra Co eluering af TMT-mærket ioner 24. Indsnævring ion isolation vindue 25, gas-fase rensning 26, MultiNotch MS3 metode 27 eller omfattende fraktionering med flerdimensionale LC og lange gradienter (4-8 h) 28 er alternative tilgange.

  1. Pack 75 µm indre diameter (ID) tomme kolonner med 1.9 µm af C18 harpiks til 30 til 40 cm længde (~1.3 µL bed volumen).
  2. Varme kolonner på 65 ° C med en sommerfugl portefølje varmer at reducere modtryk og forhindre over pres af ultrakort-høj-pres væskekromatografi (UPLC) system. Spole kolonne 2 til 3 gange inden for butterfly vandvarmer til at sikre, at hele kolonnen seng længde er opvarmet. Tape kolonnen på indersiden af ovnen være omhyggelig med ikke at tape over temperaturføler inde ovnen.
    Bemærk: Sommerfugl portefølje vandvarmer er monteret og tapede på et specialfremstillet stykke plexiglas knyttet til XYZ fase af instrumentet.
  3. Forbered buffer en (3% dimethyl sulfoxid og 0,2% myresyre) og buffer B (buffer et plus 67% ACN) og kolonnerne udvaskes grundigt med 95% buffer B. Derefter, fuldt reagensglasset kolonner i 95% buffer A (mindst 3 kolonne diskenheder). Bruge en gennemstrømningshastighed på ~0.25 µL/min og modtryk af 280 til 320 bar
  4. Undersøge kvaliteten af LC-MS/MS systemet ved at køre 100 ng af rotte hjernen peptider (eller standard efter vores valg) to gange, før analysere prøverne TMT-mærket. Kontroller følgende parametre hyppigt for at sikre høj kvalitet dataindsamling: undersøgelse MS signal intensitet (mellem e8 og e9 til basistoppen intensitet), kvalitet af MS/MS-spektre (en god repræsentation af y og b ioner), peak bredde (12-22 s), samlede retentionstid, LC systemtryk (pres stigning > 50 barer angiver en beskidt kolonne eller tilstoppede emitter tip), og køre til at køre variation (identiske toppe skal være < 30 s mellem kørsler).
    Bemærk: For at løse nær Isobar reporter ioner af 10-plex TMT reagenser (6,32 mDa forskel), MS/MS opløsning indstilles til mindst 30.000 på 400 m/z. HCD bruges typisk til TMT10-plex reporter ion fragmentering, da det ikke er omfattet af en tredjedel reglen, der gælder for kollision induceret dissociation (CID) i ion trap instrumenter.
  5. Clean og kalibrere MS instrument regelmæssigt og bruge friske LC buffere til at forbedre systemets ydeevne.
  6. Rekonstruere de tørrede peptider fra grundlæggende pH adskillelse i 5% TFA.
  7. Indlæse ~0.2 µg på kolonnen mens strømmende 5% buffer A.
  8. Elute med 15% til 45% af buffer B i 150 min. Som udgangspunkt brug for følgende forløb: tid 0, buffer B 5%; tid 2, buffer B 15%; gang 135, buffer B 45%, gang 145, buffer B 70%; og tid 150, buffer B 95%. Justere forløb lidt for tidlige og sene grundlæggende pH RPLC brøker efter gennemgang af basistoppen kromatogrammer.
  9. Operere massespektrometer i data-afhængige tilstand med en undersøgelse scanning i ion trap masse analyzer (400-1600 m/z; 60.000 opløsning; 1 x 10 6 automatisk gain control (AGC) target; 50 ms maksimale ion tid; og barycentrum tilstand). Udføre 20 MS/MS høj opløsning scanninger (60.000 opløsning, 1 x 10 5 AGC mål, ~ 100 ms maksimale ion tid, 35 HCD normaliseret kollisionen energi, 0,4 m/z isolering vindue og 20 s dynamiske udelukkelse).
    Bemærk: Elektron overførsel dissociation (ETD) anbefales ikke til TMT10-plex reagenser fordi ETD kavalergang steder er forskellige fra HCD, hvilket resulterer i reporter ion overlapning. Derudover ETD er ikke effektiv som er HCD fordi tryptic peptider typisk generere + 2 opladet stater, og ETD er mere effektive på de højere afgift.

6. MS dataanalyse

Bemærk: vi beskriver dataanalyse med hoppe softwareprogram. Imidlertid dataanalyse kan udføres med andre kommercielt tilgængelige eller gratis programmer.

  1. Behandle raw filer fra massespektrometer med tag-baserede hybrid Søg motor JUMP 21, som kombinerer en mønster-baseret databasesøgning og en tag-baseret de novo sekventering at forbedre følsomheden og specificiteten.
  2. Konvertere raw data til mzXML format og søge MS2 spectra mod målet-decoy UniProt menneskelige database (eller andre passende artsspecifikke database) til Beregn falsk opdagelse sats (FDR).
  3. Udføre søgninger ved hjælp af en masse tolerance på 10 ppm for både forløber og fragment ioner. Angiv andre søgeparametre til fuldt tryptic begrænsning med 2 maksimale ubesvarede splittelser, 3 maksimal ændring websteder pr. peptid og tildeling af en, b, og y ioner til at score peptider. Angive statiske ændringer TMT tags på Lys restkoncentrationer og N termini (+229.162 Da) og carbamidomethylation af Cys restkoncentrationer (+57.021 Da). Indstille dynamiske ændringer omfatter Met oxidation (+15.994 Da), som er en fælles peptid artefakt som følge af prøven håndtering.
  4. Filter data efter følgende kriterier: 7 aminosyre minimum peptid længde, m/z nøjagtighed (fx, 5 ppm) og matchende scorer (J score og deltaCn). Gruppere peptider ifølge peptid længde, trypticity, og opkræve tilstand.
  5. Bruge et ekstra niveau af filtrering af matchende noder til at reducere protein FDR til under 1%. Proteiner identificeret af en enkelt spektrale tælle kræver en højere matchende score.
  6. For peptider deles af flere medlemmer af en protein familie, klynge matchede protein medlemmer i 1 gruppe.
    Bemærk: Ifølge princippet om parsimony gruppen er repræsenteret af protein med det højeste antal tildelte peptider og andre proteiner modsvares af unikke peptider 1.
  7. Kvantificere proteiner ved at addere reporter ion tæller på tværs af alle matchede peptid spektrum kampe (PSMs) ved hjælp af et program indbygget i hoppe software suite.
  8. For hver accepteret PSM, uddrag og korrigere TMT reporter ionintensiteter ifølge isotopiske fordelingen af de mærkning reagenser og lastning bias, som beregnes ud fra den globale PSM kvantitering data. Filtrer PSMs med lav intensitet og højt støjniveau med brugerdefinerede tærskler under kvantitering.
  9. Beregner en relativ signalet mellem hver reporter ion og gennemsnittet af alle 10 reporter ioner. Opsummere de relative signaler af PSMs for de identificerede proteiner. Konvertere disse relative signaler til absolut signaler ved at multiplicere gennemsnit reporter ion intensiteten af top 3 PSMs i tilsvarende proteiner.
  10. Bruge en post MS beregningsmæssige tilgang til at korrigere indblanding. Antages det, at y 1 ion intensitet er proportional med reporter ion intensitet, beregne det lineære forhold fra rene scanninger og udlede niveauet indblanding fra forurenede y1ion intensitet i støjende scanninger 23.
    Bemærk: For TMT-mærket tryptic peptider, K-TMT og R rester er 2 typer af y 1 ioner (376.27574 Da og 175.11895 Da, henholdsvis) i MS2 scanninger. Hvis kun 1 y 1 ion er opdaget og stemmer overens med den identificerede peptid, anses MS2 ren scanning ( figur 3A). Hvis begge y1ions opdages, MS2 anses for en støjende scanning.
  11. Eksportere protein kvantitering værdier til et regnearksprogram på software for yderligere analyse. Bruge parvise sammenligninger eller en analyse af varians til at identificere proteiner, der udtrykkes varierende.

7. MS datavalidering

Bemærk: for at vurdere kvaliteten af data, MS, mindst 1 metode til validering skal udføres, før du fortsætter med tidskrævende biologiske eksperimenter.

  1. Manuelt undersøge MS/MS-spektre af proteiner af interesse at validere peptid sekvens og TMT reporter ion kvantitering.
  2. Brug kendt protein kvantitering data til at bekræfte MS resultater.
  3. Bekræft protein ændringer med antistof-baserede metoder (fx, western skamplet og Immunhistokemi analyse).
  4. Kemisk syntetisere peptider af interesse og bruge dem som interne standarder for at bekræfte identifikation af indfødte peptider.
    Bemærk: Deres MS/MS mønstre og retentionstiden under LC-MS/MS skal være identiske.
  5. Kontrollere protein ændringer med en målrettet fremgangsmåde, MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brugte en tidligere beskrevet cross-arter peptid mix til systematisk analysere effekten af forholdet kompression i 3 store protokol trin, herunder pre-MS fraktionering, MS indstillinger og post-MS korrektion23. Pre-MS fraktionering blev evalueret og optimeret ved hjælp af en kombination af grundlæggende pH RPLC og sure pH RPLC. For post-MS analyse fandtes kun artsspecifik peptider. Vi brugte denne indblanding model til at undersøge en række parametre i LC LC-MS/MS, herunder MS2 isolation vindue, online LC opløsning, lastning mængden af online sure pH RPLC og opløsning af den offline høj pH RPLC (Se figur 3 i reference 29).

For at ændre opløsningen under offline Rembursen, vi adskilt de Isobar mærket peptider i 320 fraktioner, og derefter kombineres valgte brøker sammen for at justere adskillelse magt. Offline LC opløsning blev testet ved hjælp af en række indsamlede brøkdel delmængder (1, 5, 10, 20, 40, 80 og 320), mens overvågningen indblanding niveauer. Vi fandt, at interferens niveauer faldt gradvis fra 16,4% til 2,8%, der angiver den omfattende fraktionering under offline LC adskillelse noget afhjælpes problemet med co eluerer peptider men ikke var i stand til helt at fjerne den interferens.

Næste, vi har vurderet effekten af vinduet MS2 isolation på indblanding. Vi bestemmes eksperimentelt, at indgrebet var omtrent proportional med størrelsen af vinduet isolation i overensstemmelse med tidligere undersøgelser29,30. For eksempel, en 4-fold forskel på vinduesstørrelse (1,6 til 0,4 Da) resulterede i en ~ 4-fold forskel af inferens niveau (14.4-3,7%). Vi har også fastlagt optimal lastning beløb på kolonnen for MS analyse og bruges disse oplysninger til yderligere negere indblanding. Vi reduceret indblanding fra 9,4% til 3,3% ved at indlæse korrekt mængden af prøven. Lastning for meget prøve kan føre til peak udvide31 og derfor hæve niveauet indblanding, hvilket resulterer i reducerede protein kvantitering nøjagtighed. Endelig, vi optimeret online RPLC opløsning ved at ændre de gradient længder (1, 2 og 4 h) og ved hjælp af en lang kolonne (~ 45 cm). Vi fandt, at en 4-h gradient næsten elimineret indblanding (ned til 0,4%), men også tilføjet instrument tid. De optimerede parametre afslørede en smal isolation vindue (0.4 Da), ~ 100 ng af prøven indlæst på kolonne og mellemledere fraktionering (~ 40 x 2 h, 3,3 dage). Vi viste også, at vi ved hjælp af et edb-baseret post-MS korrektion strategi forbedres kvantitative præcision, når bestemmelse af protein nøgletal (figur 3B).

Vores resultater viser, at brugen af optimeret LC-MS parametre og post-MS korrektion kan give en grundig proteom profil og næsten eliminere indblanding, der er ofte produceret af Isobar mærkning teknikker for protein kvantitering.

Figure 1
Figur 1: ordningen for hele-proteomet profilanalyse af TMT-LC/LC-MS/MS. Ti biologiske prøver var mængden, fordøjet og mærket med 10 forskellige TMT tags, samles lige så, og opsplittet i 80 fraktioner af offline grundlæggende pH omvendt-fase væskekromatografi (LC). Hver anden fraktion blev yderligere adskilt af sure RPLC og analyseret online med en høj opløsning massespektrometer. MS/MS rå filer blev behandlet og søgte mod en Uniprot database for peptid og protein identifikation. Proteiner var quantitated efter de relative intensiteter af TMT tags. Endelig, de identificerede og quantitated proteiner blev forelagt for Integrativ dataanalyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: TMT mærkning effektivitet undersøgelse. Begge TMT-mærket og deres tilsvarende umærket prøver blev analyseret af LC-MS/MS særskilt at undersøge TMT mærkning effektivitet. For fuld TMT mærkning, (A) den umærkede peptid højdepunkt var helt fraværende i mærket prøven, (B), mens den TMT-mærket peptid fandtes kun i mærket prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: beregningsmæssige tilgang til interferens fjernelse efter MS dataindsamling. (A) alle MS2 scanninger var opdelt i ren (venstre panel) og støjende scanninger (højre panel). Støjende scanninger udviser både y1 ioner af K og R (1 fra en target peptid og de andre fra forurener peptider). (B) Escherichia coli peptider var individuelt mærket med 3 forskellige TMT reagenser og samles på 1:3:10 nøgletal. Ca 20-fold mere rotte peptider blev tilføjet som baggrund. De summerede relative intensiteter af E. coli peptider i de 3 grupper afslørede, at y1 ion-baserede korrektion er mere nøjagtig for TMT-baserede kvantitering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver en høj overførselshastighed protokol til kvantitering af proteiner med en 10-plex Isobar mærkning strategi, som er blevet gennemført med succes i flere publikationer12,13,14,32 . I denne protokol, kan vi analysere op til 10 forskellige biologiske protein prøver i 1 eksperiment. Rutinemæssigt kan vi identificere og kvantificere langt over 10.000 proteiner med høj genkendelsessikkerhed. Selvom Isobar mærkning er en effektiv teknologi til at kvantificere proteiner, er det begrænset af forholdet kompression, som kan føre til kvantitative unøjagtighed. Vores protokol bruger forskellige strategier, som optimering af LC/LC og MS/MS indstillinger i kombination med y1 ion-baserede post-MS korrektion, fjerner effektivt de fleste interferens virkninger og derfor øger betydeligt præcisionen af protein kvantitering.

For protein kvantitering, hoppe suite af programmer funktioner i en række forskellige måder. Vi målte den isotopiske urenhed for hver batch af indkøbte reagenser, som er lidt forskellig fra de rapporterede værdier i leverandør-forudsat certifikater. Den målte isotopiske urenhed bruges til at korrigere intensiteter af reporter ioner i hoppe software. Et protein er typisk quantitated af mange PSMs med forskellige absolutte støtteintensiteter, der er påvirket af flere faktorer, såsom ionisering effektivitet. Fordi indflydelse af faktorer, der er ukendt, afsløre massespektre kun de relative mængder af reporter ioner i en TMT assay. De relative mængder af reporter ioner beregnes ved at dividere hvert reporter ion intensitet af den gennemsnitlige intensitet af alle 10 journalister. For at give den bedste repræsentant "absolutte signal" af proteinet, beregnet vi et gennemsnit af de relative intensiteter af 3 PSMs med de højeste absolutte intensiteter fra protein og gennemsnittet af de stærkeste absolutte intensitet til at vurdere absolut signal af protein. Vi defineret disse trin som rescaling. Y1 korrektion er universelt gældende for enhver TMT assays; dog i nogle tilfælde kunne vi ikke korrigere for peptider med MS/MS spectra indeholdende y1 ion. Dog fandt vi, at ~ 90% af spektre har y1 ioner fra både Lysin- og arginin. For at kompensere for interferens i co eluerer peptider, der har de samme C-terminale rester som de identificerede peptid, var anslået indblanding hovedsagelig fordoblet og anvendes til korrektion. Denne antagelse var baseret på empiriske beviser for, at vi har indsamlet over talrige TMT eksperimenter, hvor vi observerede den samme intensitetsniveau for y1 i K - og R-indeholder peptider.

Interferens kan reduceres ved mange andre metoder end hvad vi har beskrevet i denne protokol, såsom MS3 multinotch tilgang. Alle disse metoder er gyldige og har individuelle saglige hensyn. I sidste ende, metoden afhænger af en række faktorer, herunder men begrænset ikke til prøven beløb, instrument tilgængelighed (dvs., instrumenttype og tid, der kræves til at analysere prøver), ønskede resultater (dvs., antal proteiner identificeret), og kvantitering nøjagtighed behov.

For at sikre de mest nøjagtige resultater, er det vigtigt at lytte til kvalitetskontrol foranstaltninger i hele protokollen. Disse omfatter brug af nøjagtige standarder for prøven kvantitering (fx, BSA, der har undergået aminosyre analyse), test TMT reagens mærkning effektivitet, bestemmelse af effektiviteten af trypsin fordøjelse, udfører en premix ratio test at sikre en lige blanding af alle 10 prøver, og ved hjælp af en software til at korrigere enhver lastning bias. I tilfælde hvor et kendt protein eller flere proteiner forventes at udstille udtryk ændringerne mellem de enkelte prøver, er det vigtigt at udføre western blot analyse efter den første celle lysis at bekræfte, at disse ændringer er til stede og kan påvises. Dette sikrer, at prøverne repræsenterer biologi til at blive testet og sparer tid, penge og kræfter inden de gennemfører hele TMT protokollen. Hvis en bestemt prøve forventes ikke udtrykke visse de(n), er det også vigtigt at bruge western blot analyse til at bekræfte deres fravær efter lysis før du fortsætter med protokollen. Premix ratio test bruges når de fleste proteiner forventes ikke ændre på tværs af de 10 biologiske prøver. Vi har også fjernet kendte kontaminerende proteiner, såsom keratiner, så de ikke vil negativt påvirke vores korrektion. Vores kvantitering metode korrigeret for eventuelle fejl, der kan være opstået fra pipettering fejl osv. Når det er muligt, anvendes vi specifikt pipette diskenheder større end 5 µL til at reducere fejl. Vi udførte flere runder af denne premix test for at sikre at vi en nøjagtige 1:1 blanding. Det er vigtigt at bemærke, at vi ikke udføre denne type premix ratio test ved brug af immunoprecipitation prøver for protokollen, som vi havde forventet en stor procentdel af proteiner til at ændre. I sådanne tilfælde ville premix test skew resultaterne. Dette gælder også for ethvert eksperiment, hvor mindst 1 af 10 prøver forventes at variere meget i protein udtryk (Tom vektor, proteasom hæmning, etc.) i sådanne tilfælde, er det stærkt anbefales at bruge replikater for at lette kvantitering statistik. Vi anbefaler typisk, udfører 3 replikater af disse former for prøver. I sidste ende er antallet af gentagelser baseret på den forventede variation af hver prøve.

Med nogle finjustering, kan Denne robuste protokollen bruges som en generel proteom rørledning for at undersøge proteiner, protein stier, sygdomsprogression og andre biologiske funktioner. Protokollen præsenteres her giver en kraftfuld teknik til at opnå dyb protein dækning og afhjælpe forholdet undertrykkelse under kvantificering. Med mindre ændringer kan denne protokol let tilpasses til at kvantificere protein posttranslationelle modifikationer, som fosforylering, ubiquitination og acetylation33,34. Disse typer af omfattende proteomics projekter kan integreres med genomforskning, transcriptomics og eventuelt metabolomics for et systems biologi tilgang til at forstå biologiske systemer og lette roman opdagelser af molekylære mekanismer, biomarkører, og terapeutiske mål i sygdom13,28,35,36,37,38.

Vi har demonstreret en metode for præcist quantitating over 10.000 proteiner fra hele celler eller væv lysates. Vi forventer, at denne metode skal være almindeligt gældende for mange biologiske systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke alle andre lab og facilitet medlemmer til nyttige diskussioner. Dette arbejde blev delvist støttet af NI H giver R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 og ALSAC. MS analyse blev udført i St. Jude children's Research Hospital Proteomics Facility, delvist understøttet af NIH kræft Center støtte grant P30CA021765. Forfatterne takke Nisha Badders for hjælp med at redigere håndskriftet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1220 LC system Agilent G4288B
50% Hydroxylamine Thermo Scientific 90115
Acetonitrile Burdick & Jackson AH015-4
Bullet Blender Next Advance BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater Phoenix S&T PST-BPH-20
C18 tips Harvard Apparatus 74-4607
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545
DMSO Sigma 41648
Formic acid Sigma 94318
Fraction Collector Gilson FC203B
Glass Beads Next Advance GB05
HEPES Sigma H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma I6125
Lys-C Wako 125-05061
Methanol Burdick & Jackson AH230-4
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Mass Spectrometer Thermo Scientific Q Exactive HF
nanoflow UPLC Thermo Scientific Ultimate 3000
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um Dr. Maisch GmbH r119.aq.0003
Self Pck Columns New Objective PF360-75-15-N-5
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Speedva Thermo Scientific SPD11V
TMT 10plex Isobaric label reagent Thermo Scientific 90110
Trifluoroacetic acid (TFA) Applied Biosystems 400003
Trypsin Promega V511C
Urea Sigma U5378
Xbridge Column C18 column Waters 186003943
Ziptips C18 Millipore ZTC18S096
SepPak 1cc 50mg Waters WAT054960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
  3. Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  6. Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
  7. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  8. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  9. Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
  10. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  11. Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
  12. Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
  13. Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
  14. Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
  15. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  16. Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
  17. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  18. Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
  19. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
  20. Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
  21. Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
  22. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  23. Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
  24. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  25. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  26. Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
  27. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
  28. Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
  29. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  30. Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
  31. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  32. Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
  33. Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
  34. Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
  35. Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
  36. Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
  37. Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
  38. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).

Tags

Biokemi sag 129 bioinformatik interferens Isobar mærkning LC-MS/MS liquid chromatography massespektrometri proteomics TMT
Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., … More

High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., Niu, M., Cho, J. H., Wang, X., Bai, B., Peng, J. Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification. J. Vis. Exp. (129), e56474, doi:10.3791/56474 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter