Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering
Summary
Vi præsenterer en protokol for at nøjagtigt kvantificere proteiner med Isobar mærkning, omfattende fraktionering, bioinformatik værktøjer og kvalitetskontrol trin i kombination med væskekromatografi interface til en høj opløsning massespektrometer.
Abstract
Mange ekstraordinære fremskridt er blevet gjort i massespektrometri (MS)-baseret proteomics, med særlige tekniske fremskridt i væskekromatografi (LC) koblet til tandem massespektrometri (LC-MS/MS) og Isobar mærkning multiplexing kapacitet. Her introducerer vi en dyb-proteomics profilering protokol, der kombinerer 10-plex tandem masse tag (TMT) mærkning med en omfattende LC/LC-MS/MS platform, og efter MS beregningsmæssige indblanding korrektion til nøjagtigt kvantificere hele proteomes. Denne protokol omfatter følgende hovedtrin: protein udvinding og fordøjelse, TMT mærkning, 2-dimensionelle (2D) LC, høj opløsning massespektrometri og beregningsmæssige databehandling. Kvalitetskontrol trin er inkluderet for fejlfinding og evaluere eksperimentel variation. Mere end 10.000 proteiner i pattedyr prøver kan trygt quantitated med denne protokol. Denne protokol kan også anvendes til kvantitering af indlæg translationel ændringer med mindre ændringer. Denne multiplex, robust metode giver et stærkt værktøj for proteom analyse i en lang række komplekse prøver, herunder cellekultur, animalsk væv og humane kliniske prøver.
Introduction
Næste generation sequencing teknologiske fremskridt har ført til en ny landskab for at studere biologiske systemer og sygdom hos mennesker. Dette har tilladt et stort antal målinger af genomet, transkriptom, proteom, metabolome og andre molekylære systemer til at blive konkret. Massespektrometri (MS) er en af de mest følsomme metoder i analytisk kemi, og dens anvendelse i proteomics vokset hurtigt efter sekvenseringen af det menneskelige genom. I feltet proteomics har de sidste par år givet store tekniske fremskridt i MS-baserede kvantitative analyser, herunder Isobar mærkning og multiplexing evne kombineret med omfattende væskekromatografi ud over instrumentering forskud, giver mulighed for hurtigere og mere præcise målinger med mindre prøvemateriale kræves. Kvantitative proteomics er blevet et mainstream tilgang til profilering titusinder af proteiner og posttranslationelle modifikationer i meget komplicerede biologiske prøver1,2,3,4 , 5 , 6.
Multiplex Isobar mærkning metoder såsom Isobar tag til relative og absolutte kvantitering (dvs, iTRAQ) og tandem masse tag (TMT) MS har stærkt forbedret prøve overførselshastighed og øget antallet af prøver, der kan analyseres i en enkelt eksperiment1,6,7,8. Sammen med andre MS-baserede kvantitering metoder, såsom etiket-fri kvantitering og stabil isotop mærkning med aminosyrer i cellekultur (dvs.SILAC), potentialet i disse teknikker i proteomics er felt betydelig9 ,10,11. For eksempel, tillader TMT metode 10 protein prøver der skal analyseres sammen i 1 eksperiment ved hjælp af 10-plex reagenser. Disse strukturelt identisk TMT tags har den samme samlede masse, men tunge isotoper er varierende fordelt på kulstof eller kvælstof atomer, hvilket resulterer i en unik reporter ion under MS/MS fragmentering af hvert tag, hvorved relative kvantitering mellem de 10 prøver. TMT strategi anvendes rutinemæssigt for at studere biologiske veje, sygdomsprogression og cellulære processer12,13,14.
Betydelige tekniske forbedringer har forbedret væskekromatografi (LC)-MS/MS systemer, både hvad angår LC separationer og MS parametre, at maksimere protein identifikation uden at ofre kvantitering nøjagtighed. Første-dimension adskillelse af peptider ved en adskillelse teknik med høj orthogonality til den anden dimension er afgørende i denne type af shotgun proteomics metode til at opnå maksimal resultater20. Høj pH omvendt-fase væskekromatografi (RPLC) giver bedre ydeevne end konventionelle stærk kationbytter kromatografi20. Når høj pH RPLC kombineres med en anden dimension af lav-pH RPLC, både analytisk dynamikområde og protein dækning er forbedret, hvilket resulterer i evnen til at identificere hovedparten af udtrykte proteiner, når du udfører hele-proteomet analyser15 ,16,17,18. Andre tekniske fremskridt omfatter små C18 partikler (1.9 µm) og udvidet lang kolonne (~ 1 m)19. Desuden, andre bemærkelsesværdige forbedringer inkluderer nye versioner af massespektrometre med hurtig scanning satser, forbedret følsomhed og opløsning20og sofistikeret Bioinformatik rørledninger til MS data mining21.
Her beskriver vi en detaljeret protokol, der inkorporerer de nyeste metoder med ændringer til at forbedre både følsomhed og overførselshastighed, mens fokus på kvalitetskontrol mekanismer under hele forsøget. Protokollen indeholder protein udvinding og fordøjelse, TMT 10-plex mærkning, grundlæggende pH og syre pH RPLC fraktionering, høj opløsning MS påvisning og MS databehandling (figur 1). Derudover gennemfører vi flere kvalitetskontrol trin til fejlfinding og evaluere eksperimentel variation. Denne detaljerede protokollen er beregnet til at hjælpe forskerne nye til feltet rutinemæssigt identificere og nøjagtigt kvantificere tusindvis af proteiner fra en lysate eller væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en høj overførselshastighed protokol til kvantitering af proteiner med en 10-plex Isobar mærkning strategi, som er blevet gennemført med succes i flere publikationer12,13,14,32 . I denne protokol, kan vi analysere op til 10 forskellige biologiske protein prøver i 1 eksperiment. Rutinemæssigt kan vi identificere og kvantificere langt over 10.000 proteiner med høj genkendelses…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke alle andre lab og facilitet medlemmer til nyttige diskussioner. Dette arbejde blev delvist støttet af NI H giver R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 og ALSAC. MS analyse blev udført i St. Jude children’s Research Hospital Proteomics Facility, delvist understøttet af NIH kræft Center støtte grant P30CA021765. Forfatterne takke Nisha Badders for hjælp med at redigere håndskriftet.
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
References
- Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
- Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
- Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
- Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
- Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
- Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
- Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
- Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
- Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
- Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
- Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
- Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
- Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
- Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
