Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.
Kütle spektrometresi (MS) birçok olağanüstü gelişmeler yaptık-sıvı Kromatografi (LC) belirli teknik ilerleme ile tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ve izobarik etiketleme çoğullama kapasite birleştiğinde proteomik dayalı. Burada, bir geniş LC/LC-MS/MS platform ve doğru bir şekilde tüm proteomes quantitate için sonrası MS Hesaplamalı girişim düzeltme ile etiketleme 10-plex tandem toplu etiket (TMT) birleştiren bir derin-proteomik profil oluşturma protokolü tanıtmak. Bu iletişim kuralı aşağıdaki temel adımları içerir: protein ayıklama ve sindirim, TMT etiketleme, 2-boyutlu (2D) LC, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ve sayısal veri işleme. Kalite kontrol adımları sorun giderme ve deneysel varyasyon değerlendirmek için dahil edilir. 10.000’den fazla proteinler memeli örnekleri arasında güvenle bu iletişim kuralı ile quantitated. Bu iletişim kuralı küçük değişiklikler ile sonrası translasyonel modifikasyonlar Nefelometri için uygulanabilir. Bu çoğaltılmış, sağlam yöntemi karmaşık örnekleri, hücre kültürü, hayvan doku ve insan klinik örnekler de dahil olmak üzere çeşitli proteomik analiz için güçlü bir araç sağlar.
Yeni nesil sıralama teknolojisindeki ilerlemeler biyolojik sistemleri ve insan hastalık çalışmak için yeni bir manzara açmıştır. Bu ölçümler genom, transcriptome, Proteom, metabolome ve diğer moleküler sistemlerin somut olmak için çok sayıda izin vardır. Kütle spektrometresi (MS) analitik kimya en hassas yöntemlerinden biridir ve proteomik uygulaması hızlı bir şekilde insan genomu sıralama sonra genişledi. Proteomik alanında, son birkaç yıl içinde MS tabanlı kantitatif analizleri, izobarik etiketleme ve araçları yanı sıra kapsamlı sıvı Kromatografi ile birlikte yeteneği çoğullama da dahil olmak üzere önemli teknik gelişmeler vermiştir , daha hızlı, daha doğru ölçümler için daha az örnek malzeme gerekli izin ilerler. Nicel proteomik proteinler ve ardından değişiklikleri son derece karmaşık biyolojik örnekleri1,2,3,4 , on binlerce profil oluşturma için genel bir yaklaşım haline gelmiştir , 5 , 6.
Çoğaltılmış izobarik etiketleme gibi yöntemleri izobarik etiketi göreli ve mutlak Nefelometri (örneğin, iTRAQ) ve tandem kitle etiketi (TMT) MS için büyük ölçüde örnek işlem hacmi geliştirilmiş ve tek bir analiz örnekleri sayısı arttı 1,6,7,8deneme. Yanı sıra diğer MS tabanlı Nefelometri yöntemleri, etiket içermeyen Nefelometri ve kararlı izotop amino asitler (örneğin, SILAC), hücre kültüründe ile potansiyel proteomik teknikler etiketleme gibi önemli9 alandır ,10,11. Örneğin, TMT yöntemi 10 protein örneklerini birlikte 1 deneyde 10-plex reaktifler kullanarak çözümlenmesi için izin verir. Bu yapısal olarak özdeş TMT etiketleri aynı genel kitle var, ama ağır izotoplar differentially böylece göreli Nefelometri etkinleştirme her etiket, MS/MS parçalanma sırasında bir benzersiz muhabir iyon kaynaklanan karbon veya azot atomu dağıtılır 10 örnekleri arasında. TMT strateji rutin olarak biyolojik yollar, hastalık ilerleme ve hücresel12,13,14çalışmaya uygulanır.
Önemli teknik gelişmeler sıvı Kromatografi (LC)-MS/MS sistemleri, LC ayırmaları ve Nefelometri doğruluk ödün vermeden protein tanımlama en üst düzeye çıkarmak için MS parametreleri açısından hem de gelişmiş var. İlk boyut peptidler ikinci boyutu için yüksek dikeylilik ile ayırma tekniği ile20maksimum sonuçlar elde etmek için av tüfeği proteomik yöntemi bu tür kritik ayrılmasıdır. Yüksek pH ters fazlı sıvı Kromatografi (RPLL) geleneksel güçlü katyon değişim Kromatografi20daha iyi performans sağlar. Yüksek pH RPLL düşük pH RPLL ikinci bir boyut ile birleştirildiğinde, hem analitik dinamik alan ve protein kapsamı, Bütün-Proteom analizleri15 işlemi sırasında toplu ifade proteinlerin tanımlama yeteneği içinde kaynaklanan artırıldı ,16,17,18. Diğer teknik gelişmeler küçük C18 parçacıklar (1.9 µm) içerir ve genişletilmiş uzun sütun (~ 1 m)19. Ayrıca, diğer önemli iyileştirmeler hızlı tarama hızları, geliştirilmiş hassasiyet ve çözünürlük20ve MS veri madenciliği21sofistike Biyoinformatik boru hatları ile Kütle Spektrometreleri yeni sürümlerini içerir.
Burada, duyarlılık ve işlem hacmi, kalite kontrol mekanizmaları deneme boyunca odaklanan geliştirmek için değişiklikler ile en son metodolojiler birleştirmek detaylı bir protokol açıklayın. Protokol protein ayıklama ve sindirim, 10-plex TMT etiketleme, temel pH ve asit pH RPLL ayırma, yüksek çözünürlüklü MS algılama ve MS veri işleme (şekil 1) içerir. Ayrıca, sorun giderme ve deneysel varyasyon değerlendirmek için çeşitli kalite kontrol adımları uygulayın. Bu ayrıntılı iletişim kuralı düzenli olarak tanımlamak ve doğru bir şekilde proteinler üzerinden bir lysate binlerce quantitate araştırmacılar yeni alana yardımcı olma amacını taşıyan veya doku.
Biz yüksek üretilen iş iletişim kuralı olan çeşitli yayınları12,13,14‘ te,32 başarıyla uygulanan bir 10-plex izobarik etiketleme stratejisi ile proteinlerin Nefelometri için tarif . Bu protokol için ilâ 10 farklı biyolojik protein örnekleri 1 denemede analiz edebiliriz. Düzenli olarak tanımlamak ve 10.000 Eh proteinler yüksek güven ile quantitate. İzobarik etiketleme protei…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar tüm diğer laboratuar ve tesis üyeler yararlı tartışma için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen tarafından desteklenmiştir NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 ve ALSAÇ verir. MS analizi St. Jude çocuk Araştırma Hastanesi proteomik tesiste, kısmen desteklenen NIH Kanser Merkezi destek grant P30CA021765 tarafından seslendirildi. Yazarlar Nisha Badders el yazması düzenleme konusunda yardım için teşekkür ederiz.
1220 LC system | Agilent | G4288B | |
50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
DMSO | Sigma | 41648 | |
Formic acid | Sigma | 94318 | |
Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
Lys-C | Wako | 125-05061 | |
Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
Trypsin | Promega | V511C | |
Urea | Sigma | U5378 | |
Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |