Summary

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Published: November 15, 2017
doi:

Summary

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Abstract

Vele uitzonderlijke vooruitgang geboekt in de Spectrometrie van de massa (MS)-op basis van proteomics, met bijzondere technische vooruitgang in vloeistofchromatografie (LC) gekoppeld aan massaspectrometrie tandem (LC-MS/MS) en isobaar labeling multiplexing capaciteit. Hier introduceren we een diep-proteomics profiling protocol dat 10-plex tandem massa tag (TMT combineert) labelen met een uitgebreide LC/LC-MS/MS platform, en na MS computationele interferentie correctie op het hele proteomes nauwkeurig te kwantificeren. Dit protocol omvat de volgende hoofdstappen: eiwit extractie en spijsvertering, labelen van de TMT, 2-dimensionale (2D) LC, hoge-resolutie massa spectrometrie en computationele gegevensverwerking. Kwaliteitscontrole stappen zijn opgenomen voor het oplossen van problemen en de evaluatie van de experimentele variatie. Meer dan 10.000 eiwitten in zoogdieren monsters kunnen vol vertrouwen met dit protocol worden quantitated. Dit protocol kan ook worden toegepast op de kwantificatie van post-vertalende wijzigingen met kleine wijzigingen. Deze methode multiplexed, robuuste biedt een krachtige tool voor proteoom analyse in een verscheidenheid van complexe monsters, met inbegrip van celkweek, dierlijke weefsels en menselijke klinische specimens.

Introduction

Vooruitgang in de technologie van de volgende generatie sequencing hebben geleid tot een nieuw landschap voor de studie van biologische systemen en ziekten bij de mens. Dit heeft een groot aantal metingen van het genoom, transcriptome Proteoom, metabolome en andere moleculaire systemen tot tastbare toegestaan. De Spectrometrie van de massa (MS) is een van de meest gevoelige methoden in de analytische chemie, en de toepassing ervan in proteomics is snel uitgebreid na de sequencing van het menselijk genoom. Op het gebied van proteomics, hebben de afgelopen jaren grote vooruitgang in op basis van MS kwantitatieve analyses, met inbegrip van isobaar labeling en multiplexing vermogen gecombineerd met uitgebreide vloeistofchromatografie, naast instrumentatie opgeleverd vooruitgang, waardoor voor snellere, meer nauwkeurige metingen met minder monstermateriaal nodig. Kwantitatieve proteomics geworden een reguliere aanpak voor profilering van tienduizenden van eiwitten en posttranslationele modificaties in zeer complexe biologische monsters1,,2,,3,4 , 5 , 6.

Multiplexed isobaar labeling methoden zoals isobaar tag voor relatieve en absolute kwantificatie (dat wil zeggen, iTRAQ) en tandem massa tag (TMT) MS hebben sterk verbeterd monsters worden verwerkt en steeg het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd in één 1,6,7,8te experimenteren. Samen met andere kwantificatie op basis van MS-methoden, zoals label-vrije kwantificatie en stabiele isotoop labelen met aminozuren in de cultuur van de cel (dat wil zeggen, SILAC), het potentieel van deze technieken in de proteomics is veld aanzienlijke9 ,10,11. De TMT-methode kunnen bijvoorbeeld 10 EiwitSteekproeven te samen in 1 experiment worden geanalyseerd met behulp van 10-plex reagentia. Deze structureel identiek TMT-tags hebben dezelfde totale massa, maar zware isotopen zijn differentieel verdeeld over kooldioxide of stikstof-atomen, resulterend in een unieke verslaggever ion tijdens MS/MS versnippering van elke tag, waardoor de relatieve kwantificatie tussen de 10 monsters. De strategie van de TMT is routinematig toegepast om te bestuderen van de biologische afbraak, progressie van de ziekte, en cellulaire processen12,13,14.

Aanzienlijke technische verbeteringen hebben vloeistofchromatografie (LC)-MS/MS systemen, zowel in termen van LC scheidingen en MS parameters, eiwit identificatie maximaliseren zonder in te boeten kwantificatie nauwkeurigheid verbeterd. Eerste-dimensie scheiding voor peptides door een scheiding techniek met hoge orthogonaliteit aan de tweede dimensie is van cruciaal belang is in dit soort geweer proteomics methode om maximale resultaten20. Hoge-pH reversed-phase vloeistofchromatografie (RPLC) levert betere prestaties dan conventionele sterke catie-uitwisseling chromatografie20. Als hoge-pH RPLC wordt gecombineerd met een tweede dimensie van lage-pH RPLC, zowel analytische dynamisch bereik en eiwit dekking zijn verbeterd, resulterend in de mogelijkheid om het grootste deel van de geuite eiwitten te identificeren bij het uitvoeren van geheel-Proteoom analyse15 ,16,17,18. Andere technische ontwikkelingen omvatten kleine C18 deeltjes (1.9 µm) en uitgebreid lang kolom (~ 1 m)19. Bovendien omvatten andere opmerkelijke verbeteringen nieuwe versies van massaspectrometers met snelle scan tarieven, verbeterde gevoeligheid en resolutie20en verfijnde bioinformatics pijpleidingen voor MS gegevens mijnbouw21.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol waarin de meest recente methodologieën met wijzigingen ter verbetering van zowel de gevoeligheid en de doorvoer, met de nadruk op kwaliteit controlemechanismen gedurende het gehele experiment. Het protocol bevat eiwit extractie en spijsvertering, TMT 10-plex labeling fundamentele pH en zure pH RPLC fractionering, high-resolution MS detectie en verwerking van de gegevens van de MS (Figuur 1). Bovendien voeren we verschillende kwaliteitscontrole stappen voor het oplossen van problemen en de evaluatie van de experimentele variatie. Dit gedetailleerde protocol is bedoeld om onderzoekers te helpen nieuwe naar het veld routinematig identificeren en duizenden eiwitten uit een lysate nauwkeurig te kwantificeren of weefsel.

Protocol

Let op: Raadpleeg alle relevante gegevens omtrent de veiligheid (d.w.z., MSDS) vóór gebruik. Gebruik bij het uitvoeren van dit protocol op alle passende veiligheidspraktijken. Opmerking: een TMT 10-plex isobaar label reagens set wordt gebruikt in dit protocol voor het proteoom kwantificatie van 10 monsters. 1. voorbereiding van de cellen/weefsels Opmerking: het is van cruciaal belang voor het verzamelen van monsters in minima…

Representative Results

We gebruikten een eerder beschreven Kruis-soorten peptide mix om systematisch analyseren het effect van de compressie verhouding in 3 stappen van de grote protocol, met inbegrip van pre-MS fractionering, MS-instellingen en post-MS correctie23. De pre-MS fractionering werd geëvalueerd en geoptimaliseerd met behulp van een combinatie van fundamentele pH RPLC en zure pH RPLC. Voor de analyse van de post-MS, werden alleen soortspecifieke peptiden beschouwd. We gebruik…

Discussion

Beschrijven we een hoge-doorvoer-protocol voor de kwantificatie van eiwitten met een 10-plex isobaar labeling strategie, die is met succes geïmplementeerd in verschillende publicaties12,13,14,32 . In dit protocol, kunnen we maximaal 10 verschillende biologische EiwitSteekproeven in 1 experiment analyseren. We kunnen routinematig identificeren en kwantificeren van ruim 10.000 eiwitten met hoge …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken alle andere lab en faciliteit leden voor nuttige discussie. Dit werk werd slechts gedeeltelijk ondersteund door NI H verleent R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 en ALSAC. De MS-analyse werd uitgevoerd in de St. Jude Children’s Research Hospital Proteomics Facility, slechts gedeeltelijk ondersteund door de NIH Cancer Center ondersteuning subsidie P30CA021765. De auteurs bedanken Nisha Badders voor hulp bij het bewerken van het manuscript.

Materials

1220 LC system Agilent G4288B
50% Hydroxylamine Thermo Scientific 90115
Acetonitrile Burdick & Jackson AH015-4
Bullet Blender Next Advance BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater Phoenix S&T PST-BPH-20
C18 tips Harvard Apparatus 74-4607
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545
DMSO Sigma 41648
Formic acid Sigma 94318
Fraction Collector Gilson FC203B
Glass Beads Next Advance GB05
HEPES Sigma H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma I6125
Lys-C Wako 125-05061
Methanol Burdick & Jackson AH230-4
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Mass Spectrometer Thermo Scientific Q Exactive HF
nanoflow UPLC Thermo Scientific Ultimate 3000
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um Dr. Maisch GmbH r119.aq.0003
Self Pck Columns New Objective PF360-75-15-N-5
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Speedva Thermo Scientific SPD11V
TMT 10plex Isobaric label reagent Thermo Scientific 90110
Trifluoroacetic acid (TFA) Applied Biosystems 400003
Trypsin Promega V511C
Urea Sigma U5378
Xbridge Column C18 column Waters 186003943
Ziptips C18 Millipore ZTC18S096
SepPak 1cc 50mg Waters WAT054960

References

  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
  3. Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  6. Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
  7. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  8. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  9. Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
  10. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  11. Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
  12. Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
  13. Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
  14. Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
  15. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  16. Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
  17. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  18. Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
  19. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
  20. Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
  21. Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
  22. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  23. Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
  24. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  25. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  26. Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
  27. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
  28. Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
  29. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  30. Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
  31. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  32. Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
  33. Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
  34. Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
  35. Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
  36. Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
  37. Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
  38. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).

Play Video

Cite This Article
High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., Niu, M., Cho, J., Wang, X., Bai, B., Peng, J. Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification. J. Vis. Exp. (129), e56474, doi:10.3791/56474 (2017).

View Video